Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка современных диагностических систем для детекции возбудителя сибирской язвы представляет собой одну из наиболее актуальных задач борьбы с сибиреязвенной инфекцией. Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием людей и животных, вызываемым аэробным спорообразующим грамположительным микроорганизмом Bacillus anthracis.
По классификации ВОЗ Россия относится к зоне спорадического проявления инфекции. Однако, в последние годы в стране отмечается неуклонный рост территорий, неблагополучных по сибирской язве, таким образом, службы надзора Российской Федерации оценивают санитарно-эпидемиологическую обстановку по этому заболеванию как напряженную [Лукьянова и др., 2011].
Возбудитель - В. anthracis представляет собой грамположительную палочку длиной 6-10 мкм и шириной 1-2 мкм. Она неподвижная, образует споры и капсулу. Хорошо растет на различных питательных средах. Споры сибирской язвы весьма устойчивы во внешней среде, они могут сохраняться в почве несколько десятков, а, возможно, и сотни лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции.
Источником В. anthracis считают больных домашних и диких животных, организм которых предоставляет естественные условия для развития и размножения этого патогена [Ипатенко и др., 1987]. При этом источником могут быть и животные-бациллоносители, с атипичным или бессимптомным течением заболевания [Онищенко и др., 1999]. Заражение может наступать при уходе за больными животными, убое скота, обработке мяса, а также при контакте с продуктами животноводства (шкуры, кожи, меховые изделия, шерсть, щетина), обсемененными спорами сибиреязвенного микроба. Основным резервуаром В. anthracis считается почва [Ипатенко и др., 1987]. К тому же, почва может быть и непосредственным источником инфекции сибирской язвы - известны случаи заболевания людей и животных, возникшие в результате контакта с заражённой почвой [Маринин и др. 2008].
Основными факторами патогенности возбудителя сибирской язвы являются капсула и бинарный экзотоксин. Однако, в конечном итоге, вирулентность бактерии определяется суммой факторов, которая до конца не изучена [Okinaka et al, 2006]. Капсульные антигены кодируются генами, расположенными на плазмиде рХ02, а токсинный комплекс и некоторые ферменты, необходимые для синтеза капсулы - на плазмиде рХО 1. Действие сибиреязвенного токсина не ограничивается блокировкой иммунного ответа и реакции макрофагов и нейтрофилов. При развитии лёгочной, кишечной и септической форм инфекции действие токсинов становится системным и приводит к гибели организма. Механизм интоксикации до конца не ясен [Chauncey et al, 2011], однако, очевидно, что при определённой концентрации токсина в крови наступает так называемое «состояние невозврата», при котором любая терапия существующими в настоящее время методами оказывается неэффективной [Barr et al, 2010].
Важнейшую роль играет ранняя диагностика инфекции и необходимость детекции низких концентраций возбудителя сибирской язвы в окружающей среде и продуктах питания. К настоящему времени в нашей стране и за рубежом разработан целый ряд экспериментальных иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы и его антигенов [Терешкина и Девдариани, 2008]. Однако экспериментальные разработки зачастую не завершаются внедрением результатов в практику на уровне сертифицированных
препаратов, как правило, из-за несоответствия принятым параметрам специфичности (неспецифическое взаимодействие с близкородственными видами, такими как Bacillus cereus и др.).
Таким образом, для разработки эффективных средств иммунодиагностики сибирской язвы необходимы дополнительные фундаментальные и прикладные исследования. Помимо создания собственно диагностических систем, существенную роль в разработке новых диагностических средств играет идентификация антигенов или их фрагментов, специфичных исключительно для В. anthracis. В качестве основы для быстрой разработки различных типов современных диагностикумов наиболее перспективными и универсальными являются панели моноклональных антител (МКА), на основе которых можно создавать широкий спектр диагностических средств, учитывающих как особенности патогенеза сибирской язвы, так и современные форматы высокочувствительных систем детекции микроорганизмов и их факторов вирулентности.
В настоящее время в России существуют четыре коммерческих препарата
для иммунологического определения сибирской язвы: «Иммуноглобулины
диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие сухие»
(СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные
антиспоровые (адсорбированные) люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные неадсорбированные сухие» (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи) и «ИХ тест-система В. anthracis» (ГНЦ ПМБ). Чувствительность первых двух препаратов не превышает 10 микробных клеток/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминесцирующие иммуноглобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами В. cereus и Bacillus thuringiensis. Чувствительность «ИХ тест-системы В. anthracis» не превышает 10 - 10у спор/мл. В связи с этим, необходимость в создании новых методов и средств индикации возбудителя сибирской язвы не вызывает сомнений.
Цель исследования - создание комплекса высокоэффективных и чувствительных иммунодиагностических тест-систем для определения возбудителя сибирской язвы, основанных на специфичных МКА, анализ их эффективности и идентификация антигенной мишени МКА.
Задачи исследования:
Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к В. anthracis. Провести изучение полученных МКА на наличие внутри- и межвидовой перекрестной активности при помощи коллекции патогенных и сапрофитных бацилл.
Разработать на основе полученных МКА диагностические тест-системы в формате ИФА и латекс-агглютинации.
Сконструировать систему для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА.
Идентифицировать антигенную мишень полученных МКА, использованных при разработке диагностических тест-систем.
Научная новизна:
Получена и охарактеризована панель МКА к спорам В. anthracis. Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.
Идентифицирована антигенная мишень МКА, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок ЕА1, поверхностный антиген В. anthracis. Показано взаимодействие МКА, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком ЕА1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в Е. coli.
Практическая ценность диссертации:
С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.
Высоко экспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/12159 от 20 октября 201 Ігода Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития).
Тест-система на основе магноиммуносорбентов способна специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях -1x10 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений Санэпиднадзора.
Получен Патент на изобретение №2439148 С1 РФ «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museums 1Е6 -продуцент моноклональных антител для специфичного обнаружения спор Bacillus anthracis».
5. Разработаны и внедрены на Федеральном уровне методические указания
«Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы
для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней»
МУ 4.2.2941-11,2011г.
Положения, выносимые на защиту:
Полученная панель из шести МКА, являющихся специфичными к белку ЕА1 S-слоя возбудителя сибирской язвы и не дающих перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, может быть использована для создания иммунодиагностикумов для определения В. anthracis.
«Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» обладает чувствительностью от 1x10 спор/мл до 2x10 спор/мл и выше, а также высокой специфичностью. Данный латексный диагностикум может быть использован в лабораторной диагностике для детекции как споровой, так вегетативной форм возбудителя сибирской язвы.
3. «Набор реагентов. Тест-система иммуноферментная
магноиммуносорбентная для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой
форме моноклональная» обеспечивает выявление спор возбудителя сибирской язвы с высокой чувствительностью (1x10 спор/мл) и специфичностью. Концентрация спор возбудителя сибирской язвы на поверхности МИС позволяет максимально освобождаться от посторонней микрофлоры при исследовании проб окружающей среды (вода, почва).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. Е.В. Беловой (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.M. Барановым (ГНЦ ПМБ), к.б.н. А.В. Козырь (ГНЦ ПМБ), к.б.н. А.В. Колесниковым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. С.С. Ветчининым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. Е.В. Барановой (ГНЦ ПМБ), д.б.н. И.В. Жарниковой (СтавНИПЧИ) и д.б.н., проф. И.Г. Шемякиным. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Р.И. Миронова и Н.М. Лунева.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ», (Киров, 2008); Научно-практической конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Биологическая безопасность в современном мире» (Обо лене к, 2009); Научно-практической конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); Юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», (СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); III Научно-практической школе-конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 24 декабря 2008 г., протокол № 8. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 22 от 28 декабря 2011г).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, в том числе в трех статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, в одном патенте на изобретение №2439148 С1 РФ. ив МУ 4.2.2941-11, 2011 г.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований с их обсуждением, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 38 работ отечественных и 119 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 рисунками и
16 таблицами. Приложения состоят из трех статей, опубликованных по теме диссертации.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
