Введение к работе
Актуальность проблемы В настоящее время эпидемиологическая обстановка по чуме, туляремии и сибирской язве во всем мире остается достаточно сложной Это обусловлено активностью природных очагов чумы и туляремии, возможностью заноса возбудителей с эндемичных территорий на эпидемически благополучные в связи с хозяйственной деятельностью человека [Онищенко Г Г с соавт, 2003] Кроме того, Yersinia pestis, Francisella tularensis и Bacillus anthraas отнесены к наиболее опасным из возможных агентов биотерроризма, благодаря их высокой контагиозности, а для сибиреязвенного микроба - вследствие возможности образования спор [Воробьев А А, 2002] Поэтому остается актуальным разработка и совершенствование методов специфической индикации и ускоренной идентификации чумного, туляремийного и сибиреязвенного микробов в биологическом материале и объектах окружающей среды
В последние годы все большее распространение получают генамплификационные технологии, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая обладает высокой чувствительностью - 1x102- 1x10 КОЕ/мл, специфичностью и позволяет в течение 3-6 ч выявить ДНК патогенного биологического агента (ПБА) в нативном материале без этапа культивирования микроорганизмов и охарактеризовать его по интересующим признакам таксономия, вирулентность и эпидемическая значимость, устойчивость к антибактериальным препаратам [Rolfs A etal, 1993]
На сегодняшний день имеются многочисленные данные о применении ПЦР для индикации и идентификации возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы, однако в лабораторную практику в России внедрены только два диагностических препарата «ГенСиб - Тест-система для выявления ДНК В anthraas pXOl методом ПЦР» [ТУ 8895-007-01898109-2007] и «ГенПест - Тест-система для выявления ДНК Y pestis методом ПЦР» [ТУ 8895-005-01898109-2007] Опыт проведения генодиагностических исследований с данными ПЦР-тест-системами указывает на необходимость решения ряда проблем
Во-первых, увеличение продолжительности и трудоемкости анализа при исследовании проб, подозрительных на зараженность неизвестным ПБА, а также материала, собранного на территории сочетанных природных очагов чумы и туляремии Связано это с тем, что разработанные диагностические препараты с одной стороны направлены на детекцию лишь одного возбудителя, а с другой - имеют многоэтапную технологию подготовки реакционной смеси для ПЦР и длительное время реакции амплификации (от 2 до 4,5 ч)
;-
Во-вторых, трудности организации исследований методом ПЦР в полевых условиях и мобильных лабораториях специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ), учитывая противоконтаминационный режим работы, поскольку в существующих ПЦР-тест-системах учет результатов проводится с помощью электрофореза в агарозном геле и для его постановки требуется оборудование изолированного рабочего места
В-третьих, сложность ускоренной идентификации Y pestis, так как имеющийся препарат для генной диагностики чумы основан на амплификации генов, расположенных на видоспецифичных плазмидах pFra и pPst, и, следовательно, направлен только на детекцию возбудителя без определения его свойств В тоже время такие системы созданы для характеристики штаммов сибиреязвенного и туляремийного микробов [Тучков И В с соавт, 1994, Leal N С etal, 1999, Versage J L etal, 2003, Levi К etal, 2003, Шевченко О В с соавт, 2004, Тучков И В , 2005, Осина Н А с соавт, 2006]
Решением обозначенных проблем может быть разработка качественно новых препаратов для генной диагностики чумы, туляремии и сибирской язвы на основе технологий мультилокусной ПЦР (МПЦР) и гибридизационно-флуоресцентного учета результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) Принципиальной особенностью мультилокусной ПЦР (МПЦР) является введение в состав системы двух и более пар праймеров, которые обеспечивают одновременную амплификацию сразу нескольких ДНК-мишеней разных возбудителей или одного патогена В тоже время ПЦР-РВ позволяет детектировать реакцию амплификации автоматически по накоплению флуоресцентного сигнала в пробирках, не открывая их и не используя для этих целей метод электрофореза в агарозном геле
Цель работы — создание тест-систем для выявления и генетической характеристики штаммов возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов
Основные задачи исследования
1 Провести анализ геномов возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии на
наличие специфичных регионов, выбрать оптимальные ДНК-мишени для мультилокусной
ПЦР
2 Подготовить и охарактеризовать обширную выборку штаммов Y pestis,
F tularensis, В anthracis, и гетерологичных микроорганизмов для оценки специфической
активности (чувствительности) и специфичности мультилокусной ПЦР
3 Подобрать к выбранным фрагментам ДНК олигонуклеотидные праймеры и
зонды TaqMan, оптимизировать условия проведения мультилокусной ПЦР с
электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов
4 Разработать схему подготовки биологического материала и объектов
окружающей среды для одновременной детещии Y pestis, F tularensis и В anthracis с
помощью мультилокусной ПЦР
Сконструировать и апробировать при исследовании полевого материала тест-системы для одновременного выявления ДНК Y pestis, F tularensis и В anthracis методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, охарактеризовать их диагностическую ценность
Разработать методический подход для характеристики штаммов возбудителя чумы по вирулентности с помощью мультилокусной ПЦР
Научная новизна работы
Впервые на основе анализа структуры геномов возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии определены оптимальные ДНК-мишени для создания МПЦР, направленной на одновременное выявление указанных возбудителей хромосомный локус За Y pestis, гены/g/BCF tularensis, ген pagA В anthracis
Впервые на основе подобранных праймеров и зондов TaqMan сконструированы тест-системы для одновременного выявления в одной реакции ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов
Установлена возможность эффективной детекции с помощью усовершенствованной методики выделения ДНК и разработанных тест-систем возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы в пробах биологического материала и объектах окружающей среды
Продемонстрирована эффективность методического подхода для одновременной детекции и характеристики возбудителя чумы с помощью мультилокусной ПЦР, основанной на выявлении видоспецифичного локуса За и ассоциированных с вирулентностью генов хромосомного ОВП и плазмиды pCad, а также возможность дифференцирования авирулентных штаммов чумного микроба от вирулентных
Практическая значимость работы
По результатам проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методами мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (тест-системы «ЧТС-ЭФ» и «ЧТС-
РВ»), а также экспериментальные серии тест-системы «Мульти-Yp» для детекции штаммов чумного микроба и их характеристики по генам, ассоциированным с вирулентностью Разработаны инструкции по изготовлению и контролю сконструированных тест-систем
При межлабораторных испытаниях подтверждена диагностическая ценность тест-систем специфическая активность (чувствительность) - 1 х 103 мк/мл, специфичность -100 %, воспроизводимость результатов - 100 % (акт № 9 от 24 11 2006 г, утвержден директором ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб")
Разработаны методические рекомендации "Применение многофакторного генетического анализа для детекции и характеристики возбудителей особо опасных инфекций бактериальной и вирусной природы", одобренные на заседании Ученого Совета (протокол № 9 от 24 11 2006 г ) и утвержденные директором ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб"
Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий на курсах повышения квалификации специалистов "ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов" при РосНИПЧИ "Микроб"
Основные положения, выносимые на защиту
1 На основе специфических нуклеотидных последовательностей генов Y pestis
(видоспецифичный хромосомный локус За), F tularensis (гены iglQC, кодирующие белок
23 кДа) и В anthracis (ген pagA плазмиды pXOl, отвечающий за синтез протективного
антигена), определенных в результате анализа геномов чумного, туляремийного и
сибиреязвенного микробов, возможно создание эффективных праймеров и зондов TaqMan
для конструирования тест-системы, обеспечивающей одновременную детекцию
возбудителей указанных инфекций методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим
и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов
Разработана схема подготовки проб, которая обеспечивает эффективное выделение и концентрирование ДНК из биологического материала и объектов окружающей среды для одновременного выявления возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР, и соответствует требованиям нормативной документации по биологической безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности
Разработанные тест-системы для одновременного выявления ДНК Y pestis, F tularensis и В anthracis методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов позволяют проводить одномоментную специфическую индикацию возбудителей в пробах биологического
7 материала и объектах окружающей среды (специфическая активность їх 103 мк/мл и специфичность 100%)
4 Предложенный методический подход для детекции и характеристики возбудителя чумы обеспечивает дифференцирование штаммов Y pestis по генетическим маркерам, ассоциированным с вирулентностью (хромосомный ОВП и плазмида pCad), и обнаружение авирулентных штаммов чумного микроба
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология - XXI век" (Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (Волгоград, 2005), Российской научно-практической конференции (Новосибирск, 2005), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им С М Кирова (Санкт-Петербург, 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита "Группы восьми" и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств" (Оболенск, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2007)
Публикации
Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них 1 - в рекомендованном ВАК издании
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 241 цитируемую работу Общий объем диссертации 152 страницы Текст иллюстрирован 18 таблицами и 14 рисунками
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
