Введение к работе
Актуальность проблемы. Ежегодно в мире инфекционные болезни, и в их числе особо опасные инфекции, регистрируются более чем у двух миллиардов человек [WER, 2007; ЕИКЗР, 2007]. В результате роста и развития экономической деятельности, открытия границ, миграции населения, увеличения объемов международных сообщений и торговли тенденция к глобализации инфекционных болезней будет сохраняться. Реальная потребность создания современных, надежных средств профилактики и лечения особо опасных инфекционных болезней обусловливает интерес исследователей к всестороннему рассмотрению проблемы взаимодействия микро- и макроорганизма [Smith H., 2000; Бухарин О.В. и др., 2002; Туйгунов М.М. и др., 2003; Железникова Г.Ф., 2006].
Молекулярно-биологический анализ возбудителей холеры, чумы и туляремии, являющийся основой для получения новых знаний о ключевых факторах их патогенности и вирулентности, значительно опережает исследования в области изучения различных сторон взаимодействия патогенных бактерий с макроорганизмом [Farugue S.M. et al., 2004; Zhou D. et al., 2006; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006]. Но для адекватного решения вопросов, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов эффективной борьбы с особо опасными инфекционными болезнями, этого недостаточно.
Инфекционный процесс, рассматриваемый как результат взаимодействия микро- и макроорганизма, отражает состояние нарушенного баланса между уровнями экспрессии детерминант вирулентности первого и адекватностью функционирования защитных барьеров второго [Бондаренко В.М., 1999; Атауллаханов Р.И., Гинцбург А.Л., 2005; Portnoy D., 2005; Bradley C. et al., 2005]. В этом аспекте представляют интерес исследования особенностей взаимодействия организма биомоделей с возбудителем инфекции, основанные на выяснении роли молекулярных механизмов патогенности микроорганизма, приводящих к разбалансировке функционирования систем реагирования и контроля макроорганизма.
Для решения этой задачи необходимо расширение методической базы традиционного экспериментального исследования инфекционного и вакцинного процессов при работе с возбудителями особо опасных инфекционных болезней за счет внедрения морфофункционального и морфометрического анализа адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма на патоген. Так, для объективного суждения о состоянии функциональных систем макроорганизма при моделировании экспериментального инфекционного процесса в количественной оценке нуждаются: выраженность воспалительных и иммунных реакций, интенсивность регенеративных и некротических процессов, особенности и интенсивность гистохимических и иммуногистохимических характеристик клеток нейроэндокринной системы (НЭК), элементов мукозального гомеостаза и ряд других параметров.
Эксперименты на лабораторных животных являются важным этапом при доклиническом испытании вакцин. При этом научные основы оценки качества вакцин, несмотря на большой фактический материал, накопленный в этой области, только начинают формироваться. В то же время имеющиеся вакцины против особо опасных инфекционных болезней не лишены недостатков [Медуницын Н.В., 2004; Kabir S., 2005], а поиск диагностических и прогностических критериев их безопасности является актуальной научной проблемой, требующей всестороннего изучения.
Важное место в перечне методов доклинической оценки вакцин занимает морфологический анализ [РД 42-28-8-89; РД 42-28-10-90; СП 3.3.2.561-96; МУ 3.3.1.1113–02; МУ 3.3.1.2075-06; МУ 3.3.1.2161-07]. Оценка степени выраженности изменений в органах и тканях биомоделей при экспериментальном вакцинном процессе, базирующаяся на применении тезиса “оптимального морфофункционального соотношения” элементов системы для ее эффективной работы [Бородин Ю.И. и др., 1992; Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., 2002], подразумевает широкое использование методов морфометрического анализа. Но многие структурные и функциональные взаимосвязи в работе системы реагирования, контроля и защиты макроорганизма (нейроэндокринной, иммунной) при вакцинном процессе, обусловленном препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии, остаются мало изученными
В связи с этим комплексное исследование влияния возбудителей Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Francisella tularensis с определенным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма особенно актуально для расширения представлений о патогенезе этих заболеваний. Разработка алгоритма проведения патоморфологического исследования экспериментального инфекционного и вакцинного процессов направлена на формирование научно-методической основы для решения важной проблемы, связанной с информативной и объективной оценкой качества вакцинных препаратов против холеры, чумы и туляремии на этапах их разработки и доклинического испытания.
Цель исследования. Совершенствование научно-методической основы оценки качества вакцинирующих препаратов против особо опасных инфекций, базирующейся на комплексном исследовании влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма.
Задачи исследования:
1. Осуществить подбор штаммов возбудителей V.cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой для воспроизведения экспериментального инфекционного процесса и изучить их влияние на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, определяемые по ряду морфометрических параметров.
2. Разработать алгоритм патоморфологической оценки тяжести течения экспериментального инфекционного процесса при холере, чуме и туляремии. Определить возможность его применения при использовании аппаратно-программных компьютерных комплексов.
3. Предложить морфометрические критерии для отбора штаммов V.cholerae, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях.
4. Выявить особенности влияния холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп на клетки APUD-системы кишечника и другие элементы кишечного «барьера» биомоделей.
5. Охарактеризовать течение инфекционного процесса в организме биомоделей, используя штаммы чумного и туляремийного микробов с различной вирулентностью. Сопоставить данные морфологического и морфометрического анализа изменений во внутренних органах подопытных животных с генетическими особенностями этих штаммов.
6. Провести морфофункциональный и морфометрический анализ адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании вакцинного процесса с использованием коммерческих вакцин и экспериментальных препаратов.
7. Оценить реакцию «барьерных» структур (желудочно-кишечного тракта, лимфоидных органов, дыхательной системы) макроорганизма при введении живых коммерческих вакцин, аттенуированных и рекомбинантных штаммов возбудителей холеры, чумы и туляремии.
8. Изучить реакцию апудоцитов функционально значимых систем организма, клеток мукозального эпителия, образований эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и легких, лимфоидной системы при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации биомоделей коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.
Научная новизна. Впервые при изучении влияния на макроорганизм штаммов возбудителей V. cholerae, Y. рestis и F. tularensis c различной генетической характеристикой разработан алгоритм проведения патоморфологических исследований экспериментального инфекционного и вакцинного процессов и определены морфометрические параметры, объективно характеризующие тяжесть течения патологического процесса у биомоделей. Впервые оценена реакция нейроэндокринных клеток (НЭК) лимфоидных органов, лимфатических структур в легких и кишечнике при особо опасных инфекциях и вакцинации против них. Подобраны морфометрические параметры для характеристики адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации против холеры, чумы и туляремии. Обоснована необходимость проведения комплексных исследований при оценке безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности вакцин против холеры, чумы и туляремии и показаны возможности применения для этого аппаратно-программных компьютерных комплексов с целью получения стандартизированных объективных результатов. Усовершенствована научно-методическая основа оценки экспериментальных препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.
Впервые показана возможность применения морфометрических характеристик состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекторной зоны иммунной системы и слизеобразующих элементов мукозального эпителия желудочно-кишечного тракта для оценки качества противохолерных вакцин и степени выраженности холерного инфекционного процесса (патент на изобретение № 2301075 «Способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры»). Впервые предложены морфометрические критерии для отбора штаммов холерного вибриона, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях (патент на изобретение № 2254371 «Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio Cholerae биовара eltor серовара Ogawa (ctxA-, tcpA-, toxR-, zot-), используемый в иммунологических, генетических исследованиях и учебном процессе»).
Практическая значимость и внедрение. Предложенный алгоритм патоморфологического исследования был применен при проведении Государственных доклинических испытаний рекомбинантного штамма V. cholerae eltor КМ 184 – кандидата в живые противохолерные вакцины (Протокол № 5 от 15.01.2001 г.)
Результаты исследований использованы в следующих документах:
- Методические указания МУ 3.3.1.2075-06 «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко и введенные в действие с 11.07.06 г. взамен методических указаний «Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона», утвержденных Госкомсанэпиднадзором России от 17.10.1994 г. № 01-19/48-11;
- Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко и введенные в действие впервые с 01.04.07 г.;
- Методическое пособие «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», одобренное Ученым советом (протокол № 1 от 01.02.02 г.) и утвержденное директором РосНИПЧИ «Микроб» (05.02.02 г.);
- Методические рекомендации «Оценка эффективности противохолерных вакцин по ряду морфофункциональных показателей адаптационно-приспособительной реакции биомодели к холерной инфекции», одобренные Ученым советом (протокол № 5 от 11.05.06 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (12.05.06 г.);
- Методические рекомендации «Техника и прядок забора гистологического материала для морфометрических исследований от биомоделей, зараженных возбудителями I-II групп патогенности», одобренные Ученым советом (протокол № 3 от 17.06.08 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (18.06.08 г.).
Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».
Опубликованные материалы исследования явились основой для написания монографий:
- «APUD-система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе».- Деп. ВИНИТИ, 2000;
- «Патоморфологические подходы к доклинической оценке холерных вакцин».- Деп. ВИНИТИ, 2002.
- «Патоморфологические аспекты доклинических испытаний вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры».- Саратов: ЗАОПЦ «ИППОЛиТ-99», 2004.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Введение штаммов возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой вызывает в организме биомоделей изменение морфометрических показателей, степень выраженности которых находится в зависимости от полноты набора детерминант вирулентности микроорганизма.
-
Разработанные алгоритмы проведения комплексных исследований влияния возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis на адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей при моделировании инфекционного и вакцинного процессов повышают информативность экспериментального патоморфологического исследования.
-
Предложенные морфометрические параметры позволяют отбирать штаммы V. cholerae для использования в качестве контрольных при проведении морфологических и иммунологических исследований.
-
Применение разработанных коэффициентов и индексов для учета состояния трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника объективизирует и стандартизирует оценку качества противохолерных вакцинных препаратов на доклиническом этапе исследований
-
Морфометрические и морфофункциональные эквиваленты адаптационно-компенсаторных и иммунопатологических реакций у биомоделей характеризуют направленность процессов иммуногенеза при первичном и вторичном иммунных ответах.
-
Реакция апудоцитов функционально значимых органов биомоделей при инфекционном и вакцинном процессах отражает уровень вовлечения APUD-системы макроорганизма в процесс поддержания его гомеостаза.
-
В основе повышения объективности оценки безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии на этапах их доклинического изучения лежит широкое применение возможностей базовых аппаратно-программных компьютерных комплексов для денситоморфометрической характеристики состояния клеток и тканей макроорганизма.
Апробация диссертационной работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР РосНИПЧИ «Микроб» в период 1999 - 2008 г.г.: 025-99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинантных штаммов холерного вибриона, несущих гетерологические антигены» № госрегистрации 01.99.0008392; 006-3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных методов оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № госрегистрации 01.200.111501; 21-4-04 «Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлении противохолерного иммунитета» № госрегистрации 0120.0504666; 32-3-08 «Изучение взаимодействия возбудителей чумы, туляремии с организмом хозяина при инфекционном и вакцинальном процессе». Исследование иммуногенных и протективных свойств препаратов «теней» клеток холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп (VCG/O1 c TCP и VCG/O1 без TCP; VCG/O139 c TCP и VCG/O139 без TCP) выполняли в рамках договора РосНИПЧИ «Микроб» с Институтом микробиологии и генетики Университета г. Вены, Австрия (1999-2000); ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, Блок I «Ориентированные фундаментальные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защита от патогенов».
Материалы диссертационной работы были представлены на: Всероссийской научно-практической конференции “Новые технологии в медицине”, 13-14 апреля 2001 г., Саратов; Общероссийской конференции с международным участием “Проблемы морфологии”, 14-16 мая 2002 г., г. Сочи; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме “Холера”, 4-5 июня 2003 г., г. Ростов-на-Дону; ХIХ съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 19-24 сентября 2004 г., г. Екатеринбург; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Окружающая Среда и здоровье”, 19-22 мая 2005 г., г. Суздаль; XXI Российской конференции по электронной микроскопии, 5-10 июня 2006 г., г.Черноголовка; VII Российском съезде врачей-инфекционистов “Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней”, 25-27 октября 2006 г., г. Нижний Новгород; VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в рамках Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств», 3-5 октября 2006 г., г. Оболенск; проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00) 2000-2006 г.г.; IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля 2007 г., г. Москва; VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, 27-29 июня 2007 г., г. Москва ; VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ», 25-26 сентября 2007 г., г. Саратов; на научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований» в институте «Микроб», 2000-2008 г.г.
Публикации результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 46 печатных работах, из них 15 статей в рекомендованных ВАК изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 337 листах машинописного текста, состоит из введения, 7-ми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 201 отечественный и 182 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 89 таблицами и 47 рисунками.
