Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Крупные вспышки чумы, регистрируемые в течение последних лет в Танзании (1991 г.), Заире (1993 г.) и Индии (1994), появление нового, эпидемически опасного штамма Vibrio cholerae 0139 серовара, вызывающего массовую заболеваемость с высокой летальностью (Hall et al, 1993; Levisalles et al, 1993; Preston, 1993; Shimada et al, 1993; Albert et al, 1993, 1997; Kaper et ai, 1995; Fa-ruque et al, 1998; Basu et al, 2000; Steinberg et al, 2001; Смирнова, 2002), диктуют актуальность проведения научных исследований по совершенствованию диагностических и профилактических препаратов, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию этих инфекций.
В свою очередь конструирование высокочувствительных диагностических тест-систем и разработка эффективных химических вакцин невозможны без новых современных знаний об антигенах Yersinia pestis и V. cholerae 0139, имеющих ряд сходных признаков по структурной организации клетки (наличие капсулы и R-форма ли-пополисахаридов (ЛПС)) (Schutze, 1932; Burrows, 1963; Бахрах с соавт., 1967-1972, 1977; Вейнблат, 1972; Тараненко с соавт., 1972, 1973, 1977, 1988, 1990; Brabaker, 1972,2000; Waldor et al, 1994; Weintraub et al, 1994; Ломов с соавт., 1995; Kaper et al, 1995; Knirel et al, 1995, 1997, 2003; Nandy et al, 1995, 1999; Favre et al, 1996; Дома-радский, 1996, 1998; Skurnik et al, 1996; 1999-2002; Perry, Fetherston, 1997; Attridge et al, 2001; Смирнова, 2002; Gremyakova et al, 2002; Hoist, 2002; Prior et al, 2002; Vinogradov et al, 2002; Bruneteau, Minka, 2003; Oyston et al. 2003 и др.).
Несмотря на огромные достижения отечественных и зарубежных ученых в молекулярной микробиологии и биохимии чумного микроба и холерного вибриона, имму-нохимические свойства многих известных антигенов изучались в малочувствительных по современным представлениям серологических реакциях и опосредованно с помощью рекомбинантных штаммов, что позволяет лишь косвенно судить о биологических функциях полипептидов или полисахаридов в естественных природных условиях, поскольку наличие того или иного гена не всегда коррелирует с проявлением экспрессируемого им признака in vivo.
С появлением гибридомной технологии и новых эффективных методов иммуно-
химического анализа стало возможным изучение структурных особенностей антиге-
'ТоС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА 1
нов полипептидной и углеводной природы на молекулярном уровне (Douglas et al, 1988; Ezzdietal, 1990; Алексеева с соавт, 1991, 1993, 1998,2001, 2002; Храпова с со-авт., 1991, 1994, 1996; Бичуль, 1993; Garg et al, 1994; Helmerhorst et al, 1998; Suss-kind et al, 1998; Rivera-Betancourt, 2000; Prior, Titball, 2002; Heagy et al, 2003; Mitov et al, 2003; Monreal et al, 2003; Ogawa et al, 2003; Someya et al, 2003 и др.). В первую очередь это касается такого сложноорганизованного антигена, как капсульный антиген (К-антиген) чумного микроба (Ф1). В частности, остаются не до конца выяснены вопросы о связи его серологической активности с конкретными антигенными компонентами, особенности фолдинга белка Ф1 у штаммов Y. pestis с Fra± фенотипом, причины кросс-реактивности полученных к нему сывороток.
Другим, имеющим диагностическую значимость, видоспецифическим антигеном чумного микроба является фибринолизин (активатор плазминогена), синтез которого детерминируется уникальной для возбудителя чумы плазмидой пестициногенности (Вейнблатссоавт., 1984, 1988-1991; Титенко, 1985; McDonough, Falkow, 1989; Булгакова с соавт., 1991; Попов с соавт., 1991; Lahteenmaki et al, 2001). Проявление чумным микробом фибринолитической активности, как правило, коррелирует со способностью Y. pestis к коагуляции плазмы (Квашнина, 1941, 1959; Домарадский с соавт., 1960, 1963, 1996, 1998; Яромюк, 1964; Brubaker et al, 1965; Beesley et al, 1967 и др.), -а участвующие в реализации данного процесса антигены - фибринолизин и коагулаза охарактеризованы как полипептиды с м.м. 37 и 35 кД, соответственно (Cavanough, 1971; McDonough, Falkow, 1989; Straley, Brubaker, 1982; Sodeinde et al, 1988, 1989; Булгакова, 1991; Лупикова с соавт., 1992; Домарадский, 1996, 1998; Perry, Fetherston, 1997; Brubaker, 2000; Lahteenmaki et al, 2001; Goguen, 2002). Однако несмотря на значительное количество научных разработок, до сих пор не установлено, один или оба белка определяют фибринолитическую и коагулазную активности возбудителя чумы.
Широко используемая в лабораторной диагностике серологическая дифференциация бактерий по химической структуре ЛПС (Davies, 1960; Luderitz et al, 1966, 1968; Jann, Westphal, 1975; Овчинников, 1979; Захарова, 1980; Яровая, Алешкин, 1991; Книрель, Кочетков, 1993; Whvtfield et al, 1995, 1997; Hoist et al, 1996, 1998, 1999, 2002; Rietschel et al, 1996; Raetz, Whitfield, 2002 и др.), а также данные о способности моноклональных антител (МКА) к ЛПС Y. pestis выявлять все штаммы чумного микроба независимо от наличия или отсутствия собственных плазмид и температуры
5 культивирования (Дсвдариани, 1993) предопределяют актуальность, теоретическую и практическую значимость исследований по определению с помощью современных информативных методов иммунохимического анализа родо- и видоспецифических антигенных детерминантов Л ПС, а также изучению антигенной структуры входящего в его состав липида А и другого полисахаридсодержащего препарата чумного микроба - основного соматического антигена (ОСА) (Дальвадянц, 1968; Бахрах с соавт., 1969, 1970, 1972, 1973, 1977; Боровикова, 1972; Вейнблат с соавт., 1972, 1989, 1991 и
ДР-)-
Как известно, ведущую роль в проявлении чумным микробом вирулентных
свойств большинство исследователей связывает с наличием в его геноме плазмиды Са2+-зависимости (pCad), детерминирующей синтез ряда продуктов, в частности, белков наружной мембраны (БНМ) или Yops (Brubaker et al, 1979, 1991, 2000; Straley, Bowmer, 1986; Bolin, Wolf-Watz, 1988; Cornells et al, 1989, 1997, 1998,2002; Bliska et al, 1990; Видяева, 1992; Кутырев, 1992; Микеров, Кутырев, 1997 и др.), часть из которых обладает протективными свойствами (Burrows, 1963; Brubaker, 1991; Kutyrev et al, 1994; Leary et al, 1995, 1997, 2001; Nakajima et al, 1995; Williamson et al, 1995, 1997, 1999,2001; Anderson et al, 1996; Health et al, 1996; Andrews et al, 1999; Titball et al., 1999, 2000,2002; Jones et al, 2002 и др.)- Несмотря на огромный интерес исследователей к ним, сравнительное изучение иммуногенных свойств отдельных антигенов проводилось косвенно на моделях других бактерий с клонированными генами pCad Y. pestis в связи с трудностями выделения антигенов в чистом виде (Brubaker et al, 1987; Sample, Brubaker, 1987; Sodeinde et al, 1988; Заренков с соавт., 1991; Шмелев с соавт., 1991; Leary et al, 1997; TitbaU et al, 1997,1999,2001,2002 и др.). К тому же, даже при щадящих методах экстракции, изолированные из цельного микроорганизма антигены могут полностью или частично утрачивать свои нативные свойства.
Для преодоления этих препятствий в настоящее время весьма перспективно применение антиидиотипических антител (АИТ), сохраняющих функциональную, серологическую и иммунобиологическую активности исходного антигена и позволяющих проводить изучение его свойств в условиях, максимально приближенных к естественному состоянию in vivo (Amit et al, 1986; Bona, 1988; Anders et al, 1989; Araga, 1993; Field et al, 1993; Fernandez et al, 1994, 2001; Koliakos et al, 2002). He менее актуальна разработка на их основе экспериментальных антиидиотипических вакцин
(Bona, Moran, 1985; Chanh et al, 1990; Raychaudhuri et al, 1990; Beatty, 1992; Sutherland et al, 1993; Herlyn et al, 1995; Spertini et al, 1999; Basak et al, 2000; Le Poole et al, 2002; Magliani etal, 2003 и др.).
Поскольку капсульныс антигены (К-антигены) большинства грамотрицательных бактерий обладают выраженными протективными свойствами и высокой специфичностью, представляет несомненный интерес выделить К-антиген из V. cholerae 0139 серовара и изучить его иммунохимические и иммунобиологические свойства- Сведения о неэффективности существующих холерных вакцин против V.cholerae 0139 (Chongra-nguan et al, 1993; Levisalles, 1993; Ramamurthy et al, 1993; Kaper et al, 1995; Favre et al, 1996; Faruque et al, 1998) придают особую важность исследованиям в. этом направлении.
Не менее актуальными являются исследования по изучению структурной организации ЛПС V. cholerae 0139, выявлению различий в иммунореактивности этого антигена у исходных и диссоциированных вариантов вибрионов со сниженной вирулентностью, а также попытки экспериментально обоснованного получения моноспецифических неадсорбированных антител, пригодных для разработки экспресс-методов индикации возбудителя холеры 0139.
ЦЕЛЬЮ ИССЛЕДОВАНИЯ является получение новых сведений об антигенной структуре возбудителей чумы и холеры с помощью современных методов иммунохи-мического анализа с применением поликлональных, моноклональных и антиидиоти-пических антител, а также экспериментальное обоснование возможности их практического применения.
-
Получить панель МКА для изучения антигенной структуры возбудителя чумы и разработки на их основе экспериментальных диагностических тест-систем нового поколения.
-
Изучить природу антигенных детерминантов, определяющих серологическую активность Ф1 чумного микроба, особенности фолдинга белкового компонента капсулы у штаммов Y.pestis с Frafc фенотипом с использованием современных методов иммунохимического анализа и разработать методические подходы для их выявления.
-
Определить общие и специфические эпитопы углеводсодержащих антигенов возбудителя чумы (ЛПС и ОСА) с использованием набора поли- и моноклональных антител.
-
С помощью панели МКА изучить иммунохимические особенности фибриноли-зина Y.pestis и возможности использования моноклональных иммуноглобулинов в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном анализах для детекции штаммов чумного микроба, содержащих pPst.
-
Определить спектр полипептидов, детерминируемых pCad Y. pestis, у возбудителя чумы, выращенного в условиях их максимальной экспрессии. Получить панель поли- и моноклональных антител к белкам, кодируемым pCad чумного микроба, провести сравнительное изучение иммуногенных свойств и диагностической значимости отдельных антигенов с помощью методов иммунохимического анализа.
-
Получить АИТ к отдельным антигенам чумного микроба и экспериментально -обосновать перспективу их применения для разработки профилактических и диагностических медицинских иммунобиологических препаратов.
-
Определить видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды путем сравнения электрофоретических профилей клеточных лизатов V. cholerae 01 и не 01 се-рогрупп (в частности, V. cholerae 0139), по наличию или отсутствию которых возможно проведение дифференциации штаммов холерных вибрионов на этапах идентификации выделенных культур.
-
Изучить иммунохимические свойства ЛПС, экстрагированных из холерного вибриона 0139 серовара различными методами, и получить моноспецифические не-адсорбированные поликлональные антитела, пригодные для его обнаружения в иммуноферментном анализе.
-
Разработать на основе антикапсульных антител к V. cholerae 0139 методический подход, позволяющий дифференцировать вирулентные и слабовирулентные штаммы этого возбудителя. Изучить протективные свойства К-антигена и обосновать принципиальную возможность его использования в качестве потенциального компонента химической холерной вакцины.
10. Разработать принципы гибкой технологии изготовления как моно-, так и поли-
клональных иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с ис-
пользованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые с использованием гибридомной технологии и оригинальных методов скрининга антите-лопродуцирующих гибридом получена уникальная панель моноклональных антител для изучения антигенов возбудителя чумы, кодируемых как хромосомными, так и плазмидными генами.
С помощью антител различной специфичности и современных методов иммуно-химического анализа установлены гликопептидная природа и конформационная зависимость антигенного детерминанта, определяющего серологическую активность Ф1 чумного микроба. Новыми являются сведения о способности углеводного компонента этого антигена возбудителя чумы вызывать продукцию антител у лабораторных животных.
Представлены экспериментальные доказательства исключительной роли СаПМ в доставке Сап на клеточную поверхность Y. pestis, но не в процессе фолдинга мономеров Ф1.
Новыми являются установленные с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа и иммуноблота, основанных на использовании поли- и моноклональных антител, сведения о наличии у полисахарида кора ЛПС чумного микроба как специфических для коровой части антигенных детерминантов, так и общих с липидом А и ОСА эпитопов.
Впервые обнаружены и изучены иммунобиологические свойства у ряда ранее не описанных белков, детерминируемых pCad чумного микроба, при культивировании в условиях их максимальной экспрессии. Получена панель гибридом-продуцентов МКА с различной специфической активностью, направленных к отдельным антигенным детерминантам белков, кодируемым указанной плазмидой Y. pestis. С их помощью подтверждена устойчивость V антигена к протеолитической деградации под влиянием фибринолизина, а также наличие у белков с м.м. 25±2,54±2, 72±2 и 87±2 кД кросс-реактивных эпитопов. Доказано существование YopE в виде сложноорганизо-ванного антигена, состоящего из нескольких субъединиц белковой природы со сходными свойствами, наиболее важными из которых являются высокая иммуногенность и отсутствие деградации под действием фибринолизина.
Впервые с использованием сложной оригинальной системы скрининга гибридом, основанной на функциональных и антигенных свойствах фибринолизина чумного микроба, получена панель МКА различной специфичности. С помощью МКА показана иммунохимическая идентичность фибринолизина и коагулазы Y. pestis. Доказано существование этих субстанций у возбудителя чумы в виде бифункционального белка с двумя ферментативными активностями, проявление которых индуцируется температурой культивирования чумного микроба.
Экспериментально на модели возбудителя чумы подтверждена теория идиотипи-ческих сетей N. Jeme (1974). Впервые получены и охарактеризованы по иммунохими-ческому, иммунологическому и функциональному критериям АИТ к отдельным антигенам чумного микроба. Установлено, что АИТ к ЛПС Y. pestis имеют выраженный адъювантный эффект без токсических проявлений у иммунизированных животных, характерных для исходного препарата, а АИТ к белкам, кодируемым pCad, с м.м. 25±2, 87±2 кД и YopE обладают высокой специфической иммуногенностью, сопоставимой с уровнем протективной активности соответствующих полипептидов. Показана перспективность использования АИТ не только в роли эффективного инструмента изучения антигенной структуры бактерий, но и в качестве основных специфических компонентов для разработки экспериментальных диагностических и профилактических иммунобиологических препаратов.
Впервые для выделения К-антигена из капсулообразующего нового эпидемически значимого 0139 серовара холерного вибриона использован метод, эффективный при экстракции, капсульной субстанции из культуральной жидкости биомассы чумного микроба (Вейнблат с соавт., 1980), который позволил получить приоритетные данные о присутствии в капсульном веществе V. cholerae 0139 наряду с углеводным компонентом двух иммунореактивных полипептидов с м.м. 38±2 и 61±2 кД. При этом установлено, что протективные свойства К-антигена не связаны с его белковым компонентом, а обусловлены капсульным полисахаридом. Иммуногенность последнего по отношению к гомологичному серовару избирательна в отличие от ЛПС, выделенного из биомассы клеток V. cholerae 0139, обладающего одинаковой протективной активностью как при заражении возбудителем холеры Эльтор, так и V. cholerae 0139.
Впервые научно обоснована и экспериментально подтверждена эффективность разработанного нами методического подхода по получению препаративного количе-
ства мышиных моноспецифических поликлональных антител к ЛПС V. cholerae 0139, не нуждающихся в дополнительной адсорбции близкородственными по антигенной структуре гетерологичными микроорганизмами. Благодаря использованию оригинального способа экстракции получены новые данные о выраженных антигенных свойствах липида А V. cholerae 0139 и изучена специфичность полученных к нему антител. Впервые идентифицированы видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды холерного вибриона при сравнительном изучении электрофоретических профилей различных представителей рода Vibrio.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Получен оригинальный набор линий лимфоид-ных гибридных клеток, продуцирующих МКА к белковым и углеводсодержащим антигенам Y. pest is. Эти антитела могут быть использованы для конструирования диагностических тест-систем, а также изучения иммуно- и патогенеза чумной инфекции.
Предложено несколько методических подходов для индикации и идентификации штаммов чумного микроба с Frat-фенотипом, не требующих разработки специальных диагностических препаратов для обнаружения так называемой "атипичной" капсулы ("атипичного" К-антигена): 1. Разрушение идентифицируемых клеток Y.pestis лизи-рующим буфером с последующим определением Ф1 соответствующими коммерческими диагностическими препаратами; 2. Использование для индикации иммунофер-ментных тест-систем, основой которых являются МКА к другому видоспецифиче-скому антигену - фибринолизину/плазмокоагулазе; 3. Применение для обнаружения таких штаммов моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к ЛПС чумного микроба или аналогичной иммуноферментной тест-системы.
Подтверждена более высокая серологическая активность и специфичность К-антигена чумного микроба, выделенного из культуральной жидкости методами В.И. Вейнблата с соавт. (1980) и Л.Н. Сердобинцева с соавт. (1983) в сравнении с традиционным способом его экстракции из клеточной биомассы Y. pestis по Е. Baker et at. (1952), который по настоящее время используется в технологии получения соответствующих чумных гипериммунных сывороток.
Впервые на основе МКА к видоспецифическому антигену фибринолизи-ну/коагулазе чумного микроба разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины и иммуноферментная тест-система, способные выявлять штаммы Y. pestis, содержащие
плазмиду пестициногенности, независимо от температуры культивирования бактерий и не дающие положительных реакций с гетерологичными микроорганизмами, в том числе другими патогенными иерсиниями.
С использованием моноклональных иммуноглобулинов к антигенным детерминантам ЛПС Y.pestis, кодируемого хромосомными генами (Девдариани, 1993), сконструирован сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для обнаружения типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы независимо от отсутствия или наличия в них собственных плазмид. Апробация указанного варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) на большом наборе природных и генно-инженерных штаммов возбудителя чумы свидетельствует о высокой практической значимости ан-тилипополисахаридных МКА, как универсальных диагностических реагентов с широким диапазоном действия, несмотря на перекрестную реактивность только с от-дельнымипредставителямивида Y.pseudotuberculosis.
Обнаружен ряд новых полипептидов, кодируемых pCad чумного микроба, обладающих не только антигенными, но и достаточно выраженными защитными свойствами, которые, в дополнение к протективному белку YopE, могут быть использованы при создании чумных химических вакцин.
Разработана стратегия иммунизации лабораторных животных для индукции АИТ к антигенам чумного микроба. Доказана принципиальная возможность применения АИТ для создания противочумных вакцин нового поколения, не содержащих материала патогена и обладающих выраженными превентивными свойствами. Экспериментально обосновано новое перспективное научно-практическое направление в конструировании медицинских иммунобиологических препаратов с использованием АИТ как аналогов диагностически значимых антигенов.
Установлена достоверно более высокая протективная активность К-антигена в сравнении с ЛПС V. cholerae 0139 при заражении аутбредных мышей гомологичным серовариантом. Полученные результаты позволяют рекомендовать первый из названных антигенов для создания химической вакцины против заболеваний, вызываемых V.cholerae0139.
Предложен способ дифференциации вирулентных и слабовирулентных штаммов V. cholerae 0139, основанный на разной степени активности меченных пероксидазой антикапсульных антител при постановке иммуноферментного анализа с капсулиро-
ванными (мутные колонии) и лишенными капсулы (прозрачные колонии) штаммами V.choleraeO 139.
С помощью иммунохимических методов анализа доказана серологическая идентичность энтеротоксинов (XT) холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Эти данные имеют практическое значение при разработке универсальной химической вакцины против холеры, обязательным компонентом которой является специфический анатоксин.
Впервые в мировой практике получены с использованием биохимически очищенных антигенов и линейных мышей BALB/c неадсорбированные поликлональные антитела к ЛПС и К-антигену холерного вибриона 0139 серовара, не дающие перекрестных серологических реакций с гетерологичными микроорганизмами и вибрионами других серогрупп в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа.
Разработаны принципы гибкой технологии изготовления иммуноглобулиновых диагностических препаратов и тест-систем с использованием в качестве продуцентов специфического сырья линейных мышей BALB/c.
По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены:
- Программа комиссионного испытания иммуноглобулинов диагностических чумных
флуоресцирующих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором
ВНИПЧИ "Микроб" 22.05.90 г.);
- Регламент производства "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие
чумные антикапсульные моноклональные сухие" № 11-86(90);
Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических мо-ноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);
Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических моноклональных флуоресцирующих сухих к липополисахариду чумного микроба (Утверждена директором ВНИПЧИ "Микроб", протокол № 21 от 2.11.90 г.);
Методические рекомендации по обнаружению типичных и атипичных штаммов, чумного микроба в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИП-ЧИ "Микроб", протокол № 3 от 4.03.94 г.);
Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсульного антигена и липополисахарида Vibrio cholerae OI39 серовара на этапах
экспериментального производства химической холерной вакцины (Утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб", протокол № 5 от 20.06.97 г.);
Методические рекомендации по обнаружению штаммов Vibrio cholerae 0139 серо-вара в иммуноферментном анализе (Утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб", протокол № 6 от 10.10.97 г.);
Штамм гибридных клеток Yp.LPS.A6.Sp, продуцирующих моноклональные антитела к ЛПС Y. pestis, депонирован в Российской коллекции клеточных культур в институте цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург) 04.12.89 г. под номером ВСКК(П) 426Д;
Усовершенствованные методические приемы по гибридомной технологии включены в соответствующий раздел методического пособия для врачей и биологов "Методические приемы при работе с возбудителями инфекционных болезней бактериальной природы І—И групп патогенности", которое утверждено пленумом Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ 31.10.2001г.
Теоретические и практические результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, используются при чтении лекций по иммунологии чумы и холеры и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ "Микроб" с 1989 г. по настоящее время.
