Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первой группы патогенности (Weekly epidemiological record, 2010).
В настоящее время возбудитель чумы обнаружен более чем в 200 видах диких грызунов, обитающих в очагах чумы на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды (Cui et al, 2008). Люди подвергаются инфицированию, вступая в контакт с зараженным животным. Чума может передаваться человеку при употреблении в пищу мяса инфицированных животных или при обращении с мясом инфицированных животных (Eppinger et al, 2010).
Патогенез чумы начинается с прикрепления бактерий к поверхности клеток-хозяев. После адгезии возбудитель очень быстро размножается. Бактерии в большом количестве вырабатывают факторы проницаемости, подавляющие фагоцитоз, такие как F1, V, рНб-Аг. Массивная антигенемия, выброс медиаторов воспаления, в том числе и шокогенных цитокинов, ведёт к развитию микроциркуляторных нарушений, ДВС-синдрома с последующим исходом в инфекционно-токсический шок (Bartra et al, 2008).
В связи с вышесказанным, быстрая индикация возбудителя способствует
оперативной организации и своевременному проведению
противоэпидемических мероприятий, а при необходимости - выбору правильной стратегии лечения.
Лабораторная диагностика чумы построена на детекции возбудителя и его дифференциации от других представителей рода Yersinia. Для этого в основном используются микробиологические, серологические и биохимические методы исследования. Однако нередко возникают проблемы детекции возбудителя чумы и его дифференциации от близкородственного возбудителя Yersinia pseudotuberculosis (Лебедева и др., 2010; Попов и др., 2009).
В связи с этим возникает необходимость в разработке новых экспрессных методов диагностики, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надёжности и лёгкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.
Видоспецифическим антигеном чумного микроба, на выявлении которого базируется диагностика чумы, является капсульный антиген F1. Однако хорошо известно, что в природе существуют штаммы Y. pestis не продуцирущие F1 антиген, но при этом сохраняющие вирулентность (Winter et al, 1960; Schofield et al, 2012). Данный признак указывает на то, что F1 антиген не всегда является идеальной мишенью для определения возбудителя. Другой антиген чумного микроба - V антиген (LcrV), представляющий собой полипептид с
молекулярной массой 37 кДа, кодируемый геном IcrV в составе оперона IcrGVH, расположенного на плазмиде кальцийзависимости pCad, присутствующей у всех патогенных для человека иерсиний (Anisimov et. al., 2010). У возбудителя чумы и псевдотуберкулеза эта генетическая структура имеет высокую степень гомологии (Roggenkamp et al., 1997; Bergman et al., 1991), но при этом выявлены как небольшие видовые, так и внутривидовые различия в ее структурной организации и фенотипическом проявлении (Сухоносов И.Ю. Автореф. дис. ... канд. мед. наук, 2008). V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis (Светоч Т.Э. Автореф. дис. ... канд. биол. наук, 2012) и может служить хорошей мишенью для индикации патогена.
Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Иммуноанализы на основе антител наиболее часто используемый тип диагностических тестов и остающийся одной из быстро развивающихся технологий при анализе биомолекул.
Одним из ведущих направлений в области совершенствования диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител (МКА), обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов (Andreotti et al., 2003). Использование МКА в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МКА является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах (Абелев, 1998).
Цель исследования - создание высокочувствительных
иммунодиагностических тест-систем для выявления возбудителя чумы на основе специфичных МКА.
Задачи исследования
1. Получить панели гибридом, стабильно продуцирующие
высокоспецифичные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.
2. Изучить специфическую и перекрестную активность полученных МКА
и оценить их диагностическую значимость в различных форматах
иммуноанализа: непрямого ИФА, «сэндвич-ИФА», дот-блот анализа.
-
Разработать систему специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени при идентификации Y. pestis.
-
Сконструировать диагностические тест-системы в формате латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа и хМАР-технологии.
Научная новизна
Получена и охарактеризована панель МКА к V и F1 антигенам чумного микроба. Подобраны диагностически значимые пары антител и показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем чумы.
Впервые с помощью метода атомно-силовой микроскопии разработана система специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях при идентификации Y. pestis.
Впервые в России получены и охарактеризованы системы на основе МКА в формате латекс-агглютинации и хМАР технологии для идентификации F1 антигена Y. pestis и ИФА для обнаружения V антигена Y. pestis.
Теоретическая и практическая значимость работы
-
Получены и депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ - ОБОЛЕНСК») штаммы гибридных клеток - продуценты МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.
-
На основе МКА сконструированы высокоспецифичные лабораторные образцы диагностических тест-систем в формате латекс-агглютинации и хМАР-технологии.
-
Изготовлены экспериментальные образцы иммуноферментной и латекс-агглютинационной тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.
-
Получены 4 Патента на изобретение - № 2460787 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 10G4 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2460788 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 13F8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2478704 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2В8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis»; № 2478703 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 -продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis».
Методология и методы исследования
В работе использовались различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, латекс-агглютинация, иммуно-блот), микроскопические.
Положения, выносимые на защиту
-
Полученные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции возбудителя чумы.
-
Использование метода атомно-силовой микроскопии позволяет визуализировать специфическое взаимодействие антиген-антитело на молекулярном уровне при выявлении Y. pestis.
3. Латекс-агглютинационная тест-система способна выявлять F1 антиген Y.
pestis в чистых культурах чумного микроба в концентрации от 1х105 м.к./мл до
2х106 м.к./мл и выше и 4 нг/мл водорастворимого F1 антигена Y. pestis, что
подтверждает диагностическую эффективность набора.
4. Разработанная тест-система иммуноферментная моноклональная для
выявления V антигена Y. pestis характеризуется высокой чувствительностью
детекции V антигена 2 нг/мл и не выявляет клетки гомологичных
микроорганизмов в концентрации 10 м.к./мл и ниже.
5. Разработанная тест-система в формате хМАР технологии детектирует
капсульный F1 антиген как в буферном растворе (до 6 пг/мл), так и в сыворотке
крови (до 32 пг/мл), а также клетки возбудителя чумы в концентрации до
1x10 м.к./мл.
Степень достоверности и апробация результатов
Материалы диссертации изложены и представлены на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2010); III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2011г) (3-место в конкурсе молодых ученых); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2011); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2012г); 7-м Европейском конгрессе по тропической медицине и международному здравоохранению (Барселона, Испания, 2012г); V Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2013г).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 25 марта 2010 г., протокол №3, с изменениями, утвержденными Ученым советом от 11 сентября 2013 г., протокол №7.
Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ГНЦ ПМБ 4 июля 2013 г., протокол № 31.
Публикации
Результатом научной работы являются 11 публикаций по теме диссертации, включающие одну статью, опубликованную в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, четыре Патента РФ на изобретение: №2460787 С1 РФ и № 2460788 С1 РФ от 28.07.2011; № 2478703 С1 РФ и № 2478704 С1 РФ от 20.12.2011) и 7 тезисов.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с их обсуждением, заключение, выводы, список сокращений и список литературы, приложения Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами. Приложения состоят из одной статьи, опубликованной по теме диссертации, четырех Патентов и протокола технических испытаний.
