Введение к работе
Актуальность проблемы.
Возбудитель чумы, Yersinia pestis, является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов и относится к грам-отрицательным бактериям рода Yersinia [Хоулт Дж. с соавт., 1997]. В патогенезе инфекций, вызываемых грамм-отрицательными микроорганизмами, одну из первостепенных ролей играет адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина. У иерсиний известно несколько белков, обеспечивающих прикрепление патогена к мембране эукариотических клеток: адгезии YadA, инвазии, белок Ail и рН 6 антиген.
рН 6 антиген (пили адгезии, белок PsaA - рН six antigen) является общим для двух видов Yersinia поверхностным белком, синтезирующимся в виде субъединиц с молекулярной массой 15 кДа, которые затем агрегируют с образованием макромолекулярной капсулы [L.E. Lindler etal. 1990]. Экспрессия PsaA кодируется psaEFABC опероном, включающим пять генов: psaA, кодирующий синтез структурной субъединицы; psaB и psaC, кодирующие шаперонный и ашерный белки, обеспечивающие доставку структурных субъединиц из цитоплазмы на поверхность бактериальной клетки; psaE и psaF, отвечающие за температурную и рН-регуляпию синтеза белка PsaA [Yang, Isberg, 1997; Price etal, 1995; Панферцев и др., 1991; Lindler et al, 1990 и др.].
К моменту начала настоящих исследований рНб антиген наряду с белками внешних мембран Yops, липополисахаридом, V антигеном и др. расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y. pestis, так как его экспрессия необходима для вирулентности чумного микроба. Утрата продукции рНб антигена в результате делеции гена psaA приводили к 200-кратному снижению вирулентности штамма Y. pestis KIM5 [Lindler etal., 1990], а делеции гена/гаді7 - к полной потере вирулентности штамма Y. pestis 231 [Панферцев и др., 1991].
Одним из свойств рНб антигена, привлекшим к нему внимание исследователей, была зависимость его синтеза от рН и температуры окружающей среды - его продукция начиналась при температуре 37 С и значениях рН ниже 6,4, близких к рН фаголизосом макрофагов или некротического содержимого абсцессов [Ben-Efraim etal, 1961]. Эксперименты по активной иммунизации лабораторных животных препаратами PsaA показали, что его выраженная способность индуцировать антителогенез не приводила к протектив-ному эффекту при последующем заражении животных Y. pestis [Черепанов и др., 1991;
Водопьянов и др., 1995]. Высказывались предположения, что отсутствие протективности может быть связано с особенностями рН регуляции этого фактора: его синтез внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает невозможным контакт покрытых рНб антигеном бактериальных клеток с антителами и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [Анисимов, 2002]. Однако до сих пор не было приведено доказательств этой гипотезы.
Исследования функциональной активности PsaA продемонстрировали, что он обладает целым рядом биологических свойств, каждое из которых может обеспечивать его вклад в вирулентность чумного микроба. PsaA+ клетки Y. pestis и препараты белка PsaA обладали цитотоксическои активностью по отношению к перитонеальным [Bichowsky-Slonimsky , Ben-Efraim , 1963] и альвеолярным [Степаншина с соавт., 1993; Водопьянов с соавт., 1995] макрофагам. Однако в экспериментах с мутантным по собственным пи-левым белкам штаммом Pseudomonas aeruginosa клонированные гены Y. pestis psaABC восстанавливали доставку цитотоксичного экзоэнзима S в цитоплазму клеток хозяина благодаря восстановлению дефекта пилей, но не кодировали дополнительную цитоток-сическую активность [Sundin et ah, 2002].
Публиковались данные об адгезивной активности PsaA. Многие исследователи отмечали способность PsaA агглютинировать эритроциты различных видов животных [Bichowski-Slonimski, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов, Мишанькин, 1985; Lindler etal, 1990 и др]. Кроме того, при развитии псевдотуберкулезной инфекции PsaA выполняет функцию адгезина, способствуя связыванию клеток Y. pseudotuberculosis с мембраной эпителиальных клеток [Yang etal, 1996; Marra, Isberg, 1997]. Однако позже были опубликованы данные об отсутствии влияния PsaA на способность Y. pestis связываться с мембраной макрофагов [Huang , Lindler , 2004]. В то же время было показано, что рНб антиген обладает антифагоцитарной активностью и препятствует захвату клеток чумного микроба макрофагами [Huang , Lindler , 2004].
Таким образом, несмотря на разностороннее изучение функциональной активности PsaA, до настоящего времени нет единого мнения о том, какое из его свойств является определяющим вклад этого фактора в вирулентность Y. pestis. Анализ публикаций показал противоречивость данных о цитотоксическои активности и влиянии рНб антигена на вирулентность Y. pestis. Адгезивные свойства PsaA установлены для Y. pseudotuberculosis, но не подтверждены для Y. pestis. До настоящего времени не изуче-
ны механизмы отсутствия протективной активности PsaA, нет данных о митогенной активности PsaA, присущей другим бактериальным адгезинам. В связи с этим для уточнения роли рН 6 антигена в иммунопатогенезе чумы сохраняется актуальность изучения цитотоксических, митогенных и адгезивных свойств белка PsaA, а также определение его вклада в вирулентность чумного микроба.
Цель исследования - получение новых данных о функциональной активности рН 6 антигена и его вкладе в вирулентность возбудителя чумы.
Задачи исследования:
Создать на основе штаммов Yersinia spp. коллекцию изогенных нокаутных мутантов по генам оперока psaEFABC.
На основе созданной коллекции провести комплексную сравнительную оценку
биологических свойств PsaA+ и PsaA" штаммов Yersinia spp in vitro.
Оценить цитотоксические, митогенные и адгезивные свойства белка PsaA.
Изучить протективные свойства PsaA и его вклад в вирулентность Yersinia spp в экспериментах in vivo.
Научная новизна. Доказано, что PsaA не обладает цитотоксичностью. Установлено, что PsaA не относится к обязательным факторам патогенности Y. pestis. Показано, что PsaA обеспечивает адгезию возбудителя чумы к эпителиальным клеткам. Выявлена мито-генная активность PsaA, а также его влияние на адгезию и дифференпировку макрофагов. Получены штаммы Y. pestis со способностью к независимому от рН и температуры среды (конститутивному) синтезу рН 6 антигена и с их помощью проверена и опровергнута гипотеза о том, что отсутствие протективных свойств PsaA определяется особенностями рН-регуляции его синтеза. Выявлено, что PsaA+ клетки Y. pestis в организме теплокровного хозяина имеют селективные преимущества перед PsaA" бактериями.
Практическая значимость. Полученные данные о селективных преимуществах PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина, объясняющие факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов, являются основанием для разработки диагностических препаратов, направленных на выявление генов, кодирующих рН 6 антиген возбудителя чумы.
В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы пять авторских штаммов Y. pestis и
Y. pseudotuberculosis с мутациями по генам psaA и psaEFABC , которые будут использованы для изучения роли рН 6 антигена Y. pestis в патогенезе чумы.
Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности четырех генов, кодирующих белки Y. pestis с предполагаемой адгезивной активностью -YP01387-YP01388, YPO1708, YPO1709-YPO1711 и YPO 4044 (№№ доступа EU637081; EU637083; EU637082 и EU637084 соответственно) []
Внедрение результатов работы. Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций «Изучение взаимодействия патогенных иерсиний с культурами фагоцитирующих и нефагоцитирующих клеток млекопитающих» (Оболенск, 2007).
Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета.
Положения, выносимые на защитугж
рН 6 антиген Y. pestis не обладает цитотоксической активностью в отношении различных типов эукариотических клеток.
рН 6 антиген не является обязательным фактором патогенности Y. pestis. Утрата способности к его продукции не приводит к снижению вирулентности возбудителя чумы, но его присутствие дает селективные преимущества PsaA+ бактериям в организме теплокровного хозяина на ранних стадиях инфекции.
Большинство присущих белку PsaA биологических эффектов определяется его адгезивной активностью. В зависимости от концентрации PsaA либо стимулирует диф-ференцировку и адгезию макрофагов, либо вызывает их аутоагглютинацию.
Индукция антител к PsaA не обеспечивает защиту при заражении животных штаммами с конститутивной продукцией PsaA, следовательно, отсутствие протективно-сти PsaA не зависит от его синтеза внутри фаголизосом и недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности PsaA в совокупности с феноменом селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 года. Материалы диссертации доложены и представлены на 5 международных научных конференциях: П-й Международной научной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (20-21 октября 2005 г., Москва, Россия); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); 9-ом международном симпозиуме по иерсиниям (10-14 октября, 2006, Lexington, Kentucky, USA); межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г., Саратов); 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 56 работ отечественных и 194 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами.
