Содержание к диссертации
Стр.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, 6
СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
ВВЕДЕНИЕ 10
Глава . 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 19
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВОЗБУДИТЕЛЕ ЧУМЫ 19
ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ - ОСНОВНОЙ КОМПОНЕНТ 20 ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ 32
КАТИОННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ 35
СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА 39
ЛПС И УСТОЙЧИВОСТЬ К БАКТЕРИЦИДНОМУ 42 ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ ПЕПТИДОВ
ЛПС И УСТОЙЧИВОСТЬ К БАКТЕРИЦИДНОМУ 45 ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ КРОВИ
1.6. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОСИНТЕЗА ЛПС И 52
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУР, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА
УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ КАТИОННЫХ
ПЕПТИДОВ И СЫВОРОТКИ
1.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 55
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 57
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57
ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ 57
ПЛАЗМИДЫ 59
СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 59
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МЕТОДЫ 60
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ, 62 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
2.6. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ 63
Y.PESTIS К ДЕЙСТВИЮ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО
ИММУНИТЕТА
2.6.1 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С КАТИОННЫМИ 63
ПЕПТИДАМИ
2.6.1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОЙ 63
ПОДАВЛЯЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ (МІЖ)
ПОЛИМИКСИНАВ
2.6.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ 64
ПОЛИМИКСИНА В С ЖИЗНЕСПОСОБНЫМИ
БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ
ЛПС
2.6.2 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЖИВЫХ 64
БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Y. PESTIS С НОРМАЛЬНОЙ
И ИММУНОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ И МЫШИНОЙ СЫВОРОТКОЙ.
2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ 65
КОМПЛЕМЕНТА
2.8. ОПСОНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК 66
КОМПОНЕНТАМИ КОМПЛЕМЕНТА НОРМАЛЬНОЙ
ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
2.9. ОЦЕНКА СВЯЗЫВАНИЯ КОМПОНЕНТА СЗ С 67
БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ
ЛПС
ОЦЕШСА СВЯЗЫВАНИЯ КОМПОНЕНТА СЗ С 67 БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ ЛПС МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
ОЦЕНКА СВЯЗЫВАНИЯ КОМПОНЕНТА СЗ С 67 БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ И ПРЕПАРАТАМИ ЛПС ДОТ-БЛОТ АНАЛИЗОМ
2.10. МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ 68
РЕЗУЛЬТАТОВ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 68
ГлаваЗ. ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ Y. PESTIS К 68
БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ ПОЛИМИКСИНА В....
3.1.СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К 69
ПОЛИМИКСИНУВ ШТАММОВ Y.PESTIS В
ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ К ПОДВИДУ И ТЕМПЕРАТУРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
3.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕ СПОСОБНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ 74
КЛЕТОК Y.PESTIS И ПРЕПАРАТОВ
ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ СВЯЗЫВАТЬ ПОЛИМИКСИН В
3.3. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА 75
ШТАММА КМ218 Y.PESTIS ВЫРАЩЕННОГО ПРИ
ТЕМПЕРАТУРЕ 37 С В ПРИСУТСТВИИ
ПОЛИМИКСИНА В
3.4. ОБСУЖДЕНИЕ. 75
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ 83
СЫВОРОТКИ КРОВИ НА Y. PESTIS
4.1.ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ 84
ЛАБОРАТОРНЫХ ШТАММОВ Y. PESTIS К
БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ СЫВОРОТКИ.
4.2.ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛПС НА МЕХАНИЗМЫ 90
УСТОЙЧИВОСТИ К БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ
СЫВОРОТКИ ЛАБОРАТОРНЫХ ШТАММОВ Y. PESTIS.
4.3. ОБСУЖДЕНИЕ 95
Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЗНАЧИМОСТИ ГЕНОВ 100 УЧАСТВУЮЩИХ В РАЗНЫХ СТАДИЯХ БИОСИНТЕЗА ЛПС НА ОСНОВЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИЗОГЕННЫХ МУТАНТОВ Y. PESTIS.
5.1.КОНСТРУИРОВАНИЕ ИЗОГЕННОЙ СИСТЕМЫ 100 ШТАММОВ Y. PESTIS С ДЕФЕКТАМИ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ БИОСИНТЕЗА ЛПС
5.2.АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ 103 ШТАММОВ С МУТАЦИЯМИ ПО ГЕНАМ YPO0057, YPO0416, YPO0417, YPO0654 И YP02421. НА ОСНОВЕ ШТАММА КМ260(11) Y. PESTIS
5.3. ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ОБЛАСТИ ГЕНОВ, 109
УЧАСТВУЮЩИХ В БИОСИНТЕЗЕ ЛПС Y. PESTIS, НА
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К
ПОЛИМИКСИНУВ И БАКТЕРИЦИДНОМУ ДЕЙСТВИЮ
СЫВОРОТКИ
5.4. ОБСУЖДЕНИЕ ПО
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 113
ВЫВОДЫ 118
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 121
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,
ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
АП - альтернативный путь активации комплемента
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВНИИ ПМ (Гос- - Всесоюзный НИИ прикладной микробиологии (Государст-
НИИ ПМ, венный НИИ прикладной микробиологии, Государственный
ГНЦ ПМ, ГНЦ научный центр прикладной микробиологии, Государствен-
ПМБ) ный научный центр прикладной микробиологии и биотех-
нологии)
ГЖХ-МС - газо-жидкостная хромотографическая масс спектрометрия
ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля ме-
дицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича
ДАБ - диаминобутировая кислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ЗФР - забуференный физиологический раствор
ИНИПЧИ СДВ - Иркутский научно-исследовательский противочумный ин
ститут Сибири и Дальнего Востока
ИОХ РАН - Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Рос-
сийской Академии Наук
ИФА - иммуноферментный анализ
КАМП - катионный антимикробный пептид
КОЕ - колониеобразующая единица (colony forming unit)
КП - классический путь активации комплемента
липид А - липофильная часть молекулы ЛПС
ЛПС - липополисахарид
МАК - мембран-аттакующий комплекс комплемента
МПК - минимально подавляющая концентрация
м.к. - микробная клетка
МКАТ - моноклональные антитела
РКПБ "Микроб" - Российская коллекция патогенных бактерий "Микроб" при
Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"
РНК - рибонуклеиновая кислота
тИЧС - инактивированная прогреванием человеческая сыворотка
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия
.ЯМР - ядерный магнитный резонанс
Ail - белок, принимающий участие в инвазии и адгезии
Yersinia enterocolitica
AmpR - устойчивость к ампициллину
Ara4N - 4-амино-4-дезоксиарабиноза
BHI - питательная среда для культивирования микроорганизмов,
на основе сердечно-мозговой вытяжки
С12, С14, С16, - обозначение жирных кислот с соответствующим количест-
С18 вом атомов углерода
CD 14 - специфический рецептор ЛПС из семейства CD на поверх-
ности иммунокомпетентных клеток
CD18hCD11/18 - трансмембранные сигнальные рецепторы к ЛПС, функционирующие в отсутствие CD 14
DD-Hep - О-глицеро-О-манно-гептоза
DNAStar - программа для дизайна праймеров
EBD - энтеральный /?-дефенсин, выделенный из эпителия тонкой
GlcN
GlcNAc
hBD-1,2
in vitro in vivo kDa Kdo
LAP LL-37 MD-2 NF-kB
PAMPs
кишки коров
капсульный антиген - "фракция I" (fraction I)
галактоза
глюкоза
2-амино-2-дезоксиглюкоза (глюкозамин)
N-ацетил-глюкозамин
человеческий /?-дефензин -1,2
аккумулирование гемина (hemin storage)
белок инвазии, принимающий участие в инвазии и адгезии Yersinia pseudotuberculosis и Y. enterocolitica эксперимент "в пробирке", без использования животных эксперимент на животных
килодальтон1
2-кето-З-дезоксиоктоновая кислота
устойчивость к канамицину
Б-глицеро-В-тало-2-октулопиразоновая кислота
(low calcium response) потребность в ионах кальция для роста in vitro при температуре 37 С в сочетании со способностью продуцировать при этой же температуре V антиген и белки внешних мембран
лингвальный антибактериальный пептид
синтетический катионный пептид
корецептор CD 14
фактор транскрипции, главный регулятор воспалительного процесса
оксид азота
- молекулярные структуры, характерные для патогенов
(rjathogen-associated molecular patterns)
1 Согласно Международной системе СИ молекулярная масса измеряется в атомных единицах массы (а. е. м.); 1 а. е. м. ~ 1,66057хЮ"27 кг. В биохимии молекулярную массу макромолекул принято выражать в дальтонах; 1 дальтон = 1 а. е. м.
pH 6 антиген PhoP/PhoQ
РМВ PRRs
R-мутанты
sCD14
S-форма
TLR TNF-a TAP YadA
Yops
UDP-GlcNAc
белок, продуцируемый Y. pestis при низких значениях pH среды
двухкомпонентная система, которая запускается в ответ на фосфатное и углеродное голодание бактерий, при низких значениях рН
активатор плазминогена, определяющий фибринолитиче-скую и плазмокоагулазную активности возбудителя чумы
полимиксин В
рецепторы распознавания для PAMPs (p_attern-recognition receptors}
- микроорганизмы, формирующие колонии шероховатой
(rough) формы
растворимая форма CD 14, присутствующая в плазме крови (soluble CD14)
грамотрицательные бактерии, образующими колонии гладкой (smooth) формы
семейство толл-подобных рецепторов (toll-like receptor)
фактор некроза опухолей-альфа (tumor necrosis factor-а)
трахеальный антимикробный пептид
белок адгезии, обеспечивает адгезию Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica к эукариотическим клеткам
белки внешних мембран иерсиний {Yersinia outer membrane proteins)
ундекапренилфосфат глюкоз-ІМ-ацетил
Введение к работе
Актуальность исследований. Важная: роль в решении? проблемы, обеспечения населения России полноценной; экологически безопасной и конкурентоспособной мясное продукцией отводится одной из; скороспелых отраслей животноводства - свиноводству.. В последние десятилетия успешное развитие отрасли определяется- интенсификацией селекционного процесса на получение животных с высокими мясными кондициями и уменьшенным содержанием жира в туше. В то же; врёмя новые специализированные мясные породы, типы свиней отличаются повышенной чувствительностью; к стрессам что в условиях промышленно технологии приводит К снижению качества; свинины. Одним из основных генов; обуславливающих; генетическую предрасположенность к стрессам, является рианодин-рецепторный ген:(RYR1). Мутация в данном локусе является причиной возникновения злокачественного гипертермического синдрома. Разработка генетического теста; выявляющего наследственность на уровне молекулярной основы- ДНК, позволила; в; отличие от галотанового метода, точно идентифицировать носителей нежелательною ; мутации, что делает новый подход, перспективным для использования. Настоящая диссертационная работа, является: разделом планап НИР лаборатории общей химии, биохимии ; и иммуногенетики выполнена в соответствии с государственной темой по заданию:;} 06;ОГ.01.01: «Разработать эффективные молекулярно-генетические методы прогнозирования, повышения и реализации генетического потенциала- продуктивности резистентности, устойчивости к заболеваниям сельскохозяйственных животных», № госрегистрации 01:200:110987. 1.2. Цель н- задачи; исследований; Целью: работы являлась оценка полиморфизма гена RYRrl с помощью ДНК - диагностики: популяциях: свиней разных пород, разводимых в Ставропольском крае и определение влияния генотипов на хозяйственно-полезные признаки..
Для достижения указанной цели бьшйшоставлены следующие задачи:
- генотипировать животных по гену RYR1 с: помощью !ШЦР диагностики и охарактеризовать генетическую структуру популяций? свиней различных пород, разводимых в Ставропольском крае; ;
- оценить воспроизводительные качества свиней различных генотипов/по
- рассчитать экономическую) эффективность использования ДНК Диагностики. , • 1".ЗІ Научная новизна исследований: Получены; новые данные полиморфизме гена RYR1 в популяциях свинет пород крупная/ белая, скороспелая мясная и дрок, разводимых в Ставропольском; крае; Дана оценка частоты встречаемости доминантного (N) и рецессивного (п) аллеля для разных половозрастных трупп. Проведен сравнительный анализ воспроизводительных, откормочных и мясных: качеств свиней /гомозиготных и гетерозиготных генотипов. Выявлено влияние различного аллельногрусостояния локуса RYR1: -гена на хозяйственно-ценные качества свиней.
1.4. Значимость и реализация результатов исследований.. Проведенные исследования і позволяют определить продуктивные возможности свиней различных генотипов? локуса RYR1. Данные о генотипах и результатах оценки их- влияния:. на. хозяйственно-полезные признаки используются в хозяйствах Ставропольского? края при разработке селекционно-генетических программ совершенствования, стад, направленных на повышение стрессустойчивости и продуктивных показателей животных;.
Результаты диссертационных исследований внедрены в СХИК «Россия» Новоалександровского района и в ЗАО «им., Кирова» Труновского района Ставропольского края.
1.5. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетах лаборатории иммуногенетики; биохимии и общей-химии; на заседаниях Ученого Совета ЄНИИЖК в 2005 -:2007гг. (Ставрополь); на пятнадцатом заседании межвузовского координационного1 совета по свиноводству и международной научно-производственной конференции. (п.Г.Терсиановка, 2006); на 6-й международной ! научной конференции:
«Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных (п. Дубровицы, 2006); научно-практической конференции «Современные достижения зоотехнической; науки I и практики» (Краснодар, 2007); международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнической, науки? и практики,. = как основа; " улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных, животных (Ставрополь, 2007). 1.6. Основные положения, выносимые на защиту::
- полиморфизм гена RYR1 в популяциях ; свиней разных пород, разводимых в Ставропольском крае; зависимость частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену RYR1 от породы и половой принадлежности;
- влияние аллельного состояния RYR1 - гена на репродуктивные и воспроизводительные качества свиней разных пород; :
- влияние мутации в RYRl-гене на мясную продуктивность и качественные показатели мяса свиней;.
117. Публикация результатов исследований. По материалам; диссертации опубликовано 6;научных статей;
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена- на страницах компьютерного текста; содержит 25 таблиц и 9 рисунков, включает в себя введение, обзор литературы, материал, методику и результаты исследований! обсуждения, выводы, и предложения производству, список литературы (насчитывающий 163 источника,;в т.ч. 4:7 зарубежных):
