Введение к работе
Актуальность проблемы. Чума - зоонозная природно-очаговая особо опасная карантинная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1996]. Чума представляет реальную угрозу для населения из-за существования многочисленных природных очагов чумы, часть из которых расположена в Российской Федерации и ближнем зарубежье [Оншценко с соавт., 2004]. Высока вероятность заноса возбудителя чумы на территорию России из соседних, неблагополучных по этой болезни стран, а также в результате биотеррористических актов. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 2000 случаев заболевания чумой, многие из которых заканчиваются летальным исходом. Большая вспышка легочной чумы в 2009 г. произошла в Хайнань-Тибетском автономном округе Китая, в которой тоже был зарегистрирован ряд смертельных случаев [WHO / plague sheets, 2009]. Все эти факты настоятельно требуют разработки новых, основанных на современных технологиях высокоэффективных методов диагностики возбудителя чумы, средств профилактики и лечения вызываемой им особо опасной болезни.
Используемые до настоящего времени классификации Yersinia pestis учитывали лишь морфологические, культуральные, биохимические и другие фенотипические признаки [Безсонова, 1928; Борзенков, 1938; Туманский, 1957; Тимофеева, 1968; Ку-тырев, Проценко, 1998; Devignat, 1951] и были не лишены недостатков, связанных с изменчивостью этих свойств. Однако достигнутые в последнее время успехи в фундаментальной генетике и молекулярной микробиологии позволяют перевести решение задач по систематизации возбудителя чумы на качественно новый уровень, основанный на использовании его молекулярно-генетических особенностей.
В соответствии с принятой в настоящее время отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делят на основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский) подвида [Тимофеева, 1985; Кутырев, Проценко, 1998]. Согласно распространенной зарубежной классификации штаммы Y. pestis на основании различий по ряду биохимических свойств (способность к ферментации глицерина, редукции нитратов, окислению аммиака) и по историко-географическому принципу [Devignat, 1951] делят на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). По фенотипическим характеристикам штаммы основного подвида соответствуют трем биоварам (античному, средневековому и восточному), принятым в зарубежной классификации. Однако штаммы Y. pes-
4 tis, циркулирующие в природньк очагах чумы в РФ и ближнем зарубежье, остаютс не систематизированными по их принадлежности к определенным биоварам.
По экспрессии дифференциально-значимых биохимических признаков наиб( лее активными являются штаммы античного биовара. Они ферментируют глицерин обладают денитрифицирующей активностью. Штаммы средневекового биовара '. pestis не способны редуцировать нитраты, но ферментируют глицерин и арабиноз; Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но активно редуцирук нитраты и утилизируют арабинозу.
Штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнег зарубежья, как правило, высоко вирулентны и имеют высокую эпидемическую зн: чимость. Они не ферментируют рамнозу и мелибиозу, не чувствительны к ПЄСТИЦИЇ I, имеют высокий уровень продукции изоцитралиазы. Штаммы неосновных подвиде ферментируют рамнозу и мелибиозу, чувствительны к пестицину I, не проявляк изоцитрат-лиазной активности, избирательно вирулентны для лаборторных живо1 ных, эпидемически малозначимы.
Генетические причины различной экспрессии биохимических признаков, и пользуемых при делении штаммов Y. pestis на биовары и подвиды, остаются к н стоящему моменту изученными недостаточно. Достоверно установлено лишь то, чт причиной отсутствия ферментации глицерина у штаммов восточного биовара являє ся мутация в гене глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (glpD). Показано, что в этом геї у всех штаммов восточного биовара присутствует делеция размером 93 п.н. [Parhill al., 2001; Motin et al., 2002]. В литературе имеются лишь единичные работы по опр делению различий в структуре генов Y. pestis основного и неосновных подвидов, ю дирующих редукцию нитратов и ферментацию рамнозы [Куклева с соавт., 200 2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].
Остаются не установленными причины гетерогенности штаммов чумного ми роба по питательным потребностям. Штаммы из различных природных очагов чум отличаются по питательным потребностям, определяемым нарушениями генов пр межуточного метаболизма, что может быть использовано в генетической схеме диі ференциации штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы.
Выявление изменений в структуре генов, лежащих в основе различной эк прессии микробиологических и биохимических признаков, послужит надежной о новой для создания генетической схемы классификации штаммов возбудителя чум а также для определения основных направлений внутривидовой эволюции Y. pestis.
5 Цель работы. Определение генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать использованные в работе штаммы Y. pestis, выделенные в природных очагах чумы в РФ и ближнего зарубежья, по биохимическим свойствам (редукция нитратов, продукция изоцитрат-лиазы, ферментация арабинозы и мелибиозы), лежащим в основе деления на подвиды и биовары. Установить принадлежность штаммов, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, к определенным биоварам.
-
Изучить структурно-функциональную организацию генов, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении на биовары, - редукцию нитратов и ферментацию арабинозы.
-
Выявить изменения в генах Y. pestis, детерминирующих ферментацию мелибиозы и продукцию изоцитрат-лиазы, лежащих в основе дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.
-
Определить питательные потребности штаммов Y. pestis кавказского подвида и установить генетические основы их ауксотрофности.
-
Оценить перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis и установления основных направлений внутривидовой эволюции этого возбудителя.
Научная новизна работы. На основании данных комплексного микробиологического, биохимического и генетического анализа установлено, что штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.
Впервые показано, что причиной отсутствия нитратредуцирующей активности у части штаммов основного подвида, циркулирующих на территории РФ и ближнего зарубежья, является наличие замены единичного нуклеотида G —»Т в позиции 613 гена периплазматической нитратредуктазы - парА, что доказывает принадлежность этих штаммов к средневековому биовару. Отсутствие экспрессии этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов вызвано вставкой тимшювого нуклеотида (+Т) в 302 позиции другого гена - ssuA, которая приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры кодируемого транспортного белка - SsuA, также участвующего в восстановлении нитратов.
Впервые установлено, что отсутствие ферментации арабинозы у штаммов ] pestis алтайского и гиссарского подвидов связано с наличием мутации в регулято{ ном гене арабинозного оперона - агаС, который содержит инсерцию гуаниновог нуклеотида (+G) в позиции 773 от начала гена, приводящую к сдвигу рамки считьіві ния и нарушению структуры регуляторного белка АгаС, необходимого для инициі ции транскрипции генов арабинозного оперона.
Впервые установлена генетическая основа различной продукции изоцитра-лиазы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, связанная наличием вставки двух нуклеотидов (+СС) в регуляторном гене iclR в позиции 26! 270, которая приводит к инактивации кодируемого им белка-репрессора ацетатної оперона IclR и является причиной конститутивного синтеза фермента изоцитра лиазы у штаммов основного подвида. Штаммы неосновных подвидов содержат ш тактный ген iclR и не способны к конститутивному синтезу изоцитрат-лиазы.
Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов Y. pestis осної ного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности IS285 ген melB, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подві дов вставка IS2&5 в гене melB отсутствует.
Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказскої подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей IS100 гены argA и aroF, вставкой 10 п.н. в ген aroG, инсерцией тиминового нуклеотида ген thiHv. делецией 13 п.н. в гене thiG.
Полученная молекулярная характеристика штаммов Y. pestis основного и нео новных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в осн ве деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической сх мы внутривидовой классификации возбудителя чумы.
По результатам работы оформлены заявки на изобретение «Способ определ ния подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы методом секвениров ния» (№2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено решение о выдаче патент и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультил кусного сиквенс - типирования (№2009146094. Приоритет от 11.12.2009).
Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и у верждены методические рекомендации «Определение подвидовой принадлежнос штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов rhaS и агаС, контрол рующих ферментацию рамнозы и арабинозы» (утверждены директором РосНИПЧ «Микроб». Протокол № 6 от 16 июня 2009) и «Определение подвидовой принадле;
7 ности штаммов Yersinia pestis методом мультилокусмного сиквенс - типирования (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 1 от 23 февраля 2010).
В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штамма: Y. pestis КМ 910 алтайского, КМ 596 гиссарского и КМ 1861 улегейского подвидов в качестве референс-штаммов этих подвидов.
Полученные в ходе выполнения исследования данные по генетической организации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации и повышения квалификации при РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту:
-
Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохимических и генетических свойств этих штаммов.
-
В основе разного проявления биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в генах, кодирующих эти признаки. Отсутствие способности к редукции нитратов у штаммов основного подвида средневекового биовара связано с наличием нонсенс-мутации (G — Т) в гене парА периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов - с инсерцией единичного нуклеотида в ген ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена агаС.
-
Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией кодирующих их генов у основного подвида и их интактностью у неосновных подвидов. Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено внедрением в ген melB галактозидпермеазы, а конститутивный синтез изоцитрат-лиазы у штаммов этого подвида - вставкой двух нуклеотидов (СС) в последовательность регуляторного гена iclR. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены melB и iclR.
-
Причиной множественных питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказского подвида является инактивация у них ряда генов биосинтеза аминокислот и витаминов. Зависимость штаммов этого подвида по аргинину вызвана инсерцией IS70O в ген argA, по фенилаланину - вставкой 10 п.н. в ген aroG, по тирозину - внедрением IS100 в ген aroF, по тиамину (ВО делецией 13 п.н. - в ген thiG и инсерцией единич-
8 ного нуклеотида в МН. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штаи мов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определен характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетическс схемы внутривидовой классификации Y. pestis.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены н IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участнико СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфек ционными болезнями на территории государств - участников содружества независ» мых государств», Волгоград, 2008; VI Международной конференции «Молекулярна диагностика и биобезопасность», М., 2009; научно-практической школь конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технолс гии обеспечения биологической безопасности», 25 - 27 мая 2010 г.; на ежегодны итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов 2008 - 2010 гг.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналої рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России...».
Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 157 страт цах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти гла собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 11 та( лицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 отечественны и зарубежных источников.
