Содержание к диссертации
Стр.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1 РАЗВИТИЕ ВЗГЛЯДОВ НА ПОСТРОЕНИЕ СХЕМ КЛАС
СИФИКАЦИИ ЧУМНОГО МИКРОБА, ТАКСОНОМИЧЕ
СКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ
YERSINIA PESTIS ИЗ ЦЕНТРАЛЬНО-КАВКАЗСКОГО ВЫ
СОКОГОРНОГО ПРИРОДНОГО ОЧАГА ЧУМЫ 14
Внутривидовая дифференциация возбудителя чумы и положение штаммов, циркулирующих в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы 14
Молекулярная организация генома чумного микроба различной природно-очаговой принадлежности 21
Биоценотические особенности Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы 35
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
Использованные штаммы микроорганизмов 45
Микробиологические методы исследования 45
Биологические методы исследования 50
Изучение вирулентности штаммов чумного микроба для лабораторных животных 50
Изучение выживаемости штаммов чумного микроба в
организме блох 51
2.4 Молекулярно-биологические методы исследования 52
Плазмидный скрининг 52
Полимеразная цепная реакция 53
2.4.3 Генетическое типирование 55
2.5 Методы статистической обработки материала 56
Глава 3 СОВРЕМЕННОЕ РАСПРОСТРАНЕНИЕ ШТАММОВ ЧУМ
НОГО МИКРОБА В ЦЕНТРАЛЬНО-КАВКАЗСКОМ ВЫСО
КОГОРНОМ ПРИРОДНОМ ОЧАГЕ ЧУМЫ 59
Особенности фенотипических свойств и плазмидного состава штаммов чумного микроба, циркулирующих в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге 61
Анализ распределения штаммов Y. pestis двух плазмидова-ров в зависимости от источника и сезона выделения на территории Центрально-Кавказского высокогорного очага
чумы 65
3.3 Генетическое типирование штаммов Y. pestis из Центрально-
Кавказского высокогорного очага по хромосомному локусу
С AAA с вариабельным числом тандемных повторов 70
3.4 Многолокусный анализ областей генома с вариабельным
числом тандемных повторов (MLVA) и филогенетический
анализ штаммов Y. pestis из Центрально-Кавказского высо
когорного очага 74
Глава 4 ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕДАЧИ ШТАММОВ ЧУМНОГО
МИКРОБА РАЗНЫХ ПЛАЗМИДОВАРОВ БЛОХАМИ
CITELLOPHILUS TESQUORUMЖИВОТНЫМ В ОТЛИ
ЧАЮЩИХСЯ УСЛОВИЯХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ 79
Анализ частоты выделения штаммов чумного микроба обоих плазмидоваров от блох разных видов в течение периода изучения очага (с 1971 г. по 2001 г.) 79
Длительность сохранения возбудителя чумы двух плазмидоваров из Центрально-Кавказского высокогорного природного очага в организме массового вида блохи С. tesquorum и возможность их передачи лабораторным животным 83
4.3 Адаптационная способность штаммов чумного микроба
двух плазмидоваров к существованию в организме блохи
С. tesquorum при разных температурных условиях содержа
ния 90
Глава 5 ВЛИЯНИЕ МИКСТ-ИНФИЦИРОВАНИЯ Y. PESTIS И
LISTERIA MONOCYTOGENES БЛОХ С. TESQUORUMHA ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСМИССИИ И ДЕТЕКЦИИ
ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ 96
5.1 Влияние температурных условий внешней среды на выживаемость чумного микроба и листерий при одновременном
пребывании их в организме блохи С. tesquorum 96
5.2 Детекция чумного микроба в блохах, инфицированных возбудителями чумы и листериоза, с помощью полимераз-ной цепной реакции и комбинированное использование
магноиммуносорбентов и ПЦР 105
Глава 6 ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЦЕНТРАЛЬНО-
КАВКАЗСКОГО ВЫСОКОГОРНОГО ПРИРОДНОГО ОЧА
ГА И ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИКИ
ЧУМЫ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ 111
Эпизоотическая активность очага в современных условиях.. 111
Особенности хозяйственной деятельности населения на тер- 119 ритории Центрально-Кавказского высокогорного природного очага
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 139
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЕ
МИС - магноиммуносорбент
м.к. - микробная клетка
м.м. - молекулярная масса
П 1 - первый плазмидовар
П 2 - второй плазмидовар
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
FI - капсульный антиген
MLVA - многолокусный анализ областей генома с вариабельным
числом тандемных повторов
pFra - плазмида, детерминирующая FI и "мышиный токсин"
pCad - плазмида, детерминирующая признак кальциизависимости
при 37 С, продукцию VW-антигенов, синтез термоиндуци-
бельных белков наружной мембраны
pPst - плазмида, детерминирующая пестицин I, фибринолитиче
скую и плазмокоагулазную активность
р 4 Md - криптическая плазмида с м.м. 4 Md
Рго+ - фенотипический признак независимости от пролина
Pro" - фенотипический признак зависимости от пролина
Psb+ - фенотипический признак способности к пигментсорции
Psb" - фенотипический признак неспособности к пигметсорбции
VNTR - Variable number tandem repeat - вариабельное число
тандемных повторов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Период активного изучения Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы составляет относительно короткий (по сравнению с равнинными природными очагами Европейской части России) промежуток времени - 30 лет. Однако за эти годы были проведены фундаментальные исследования, которые позволили охарактеризовать его ландшафтно-биоценотическую структуру, выявить особенности этологии и экологии основного носителя чумного микроба — горного суслика, определить спектр переносчиков возбудителя чумы и дифференцировать степень их участия в поддержании эпизоотического процесса, изучить свойства штаммов чумного микроба, циркулирующих на разных участках очаговости. Полученные в результате эпизоотологического обследования и экспериментальных наблюдений сведения позволяют утверждать, что Центрально-Кавказский высокогорный природный очаг чумы, характеризуясь в целом постоянством эпизоотической активности на протяжении многих лет и невысокой эпидемичНо-стью, обладает уникальными особенностями: ландшафтно-географической изолированностью и мозаичностью поселений основного носителя; широким диапазоном его чувствительности к чумному микробу; гетерогенностью штаммов возбудителя чумы, циркулирующих на разных участках очаговости, по признаку ауксотрофности в отношении пролина и ряду других свойств [Акиев А.К. с соавт., 1972,1978; Дятлов А.И. с соавт., 1979, 1990, 2001; Куклев Е.В. с соавт., 2001 и др.]. Со времени последнего систематического изучения всех вышеперечисленных характеристик прошло около 10 лет. За это время многие свойства компонентов природного очага могли претерпеть существенные изменения и поэтому нуждаются в новом исследовании. Вместе с тем, многие важные аспекты в характере проявления эпизоотии Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы остаются невыясненными. Так, мало изучен генетический полиморфизм выделенных в очаге штаммов Yersinia pestis. Важным для познания механизмов взаимодействия сочленов биоценоза является анализ
накопленных в течение последнего десятилетия фактических данных о характере распространения штаммов чумного микроба по ландшафтно-географическим районам, о колебаниях численности основного носителя, а также изучение активности передачи блохами штаммов с разными свойствами. Требуют уточнения моменты, касающиеся современных социальных условий жизни местного населения, характера хозяйственной деятельности человека на территории очага и обусловленного ими реального эпидемиологического риска. Для решения этих вопросов очевидна необходимость анализа параметров эпизоотического процесса в современный период времени, оценки факторов (антропогенного воздействия, социальных явлений), обусловливающих контакт человека с очагом. Наряду с этим, актуальным является изучение штаммов чумного микроба, циркулирующих в очаге, с привлечением новых молекуляр-но-биологических методов исследования; уточнение его ареала, а так же исследование условий передачи возбудителя чумы блохами, и конкурентоспособности разных фенотипов Y. pestis в организме переносчика. Следует отметить, что характер влияния абиотических факторов (в частности, температуры окружающей среды) на реализацию векторной функции блох - переносчиков Y. pestis в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы еще не в полной мере ясен. Недостаточно изучены взаимоотношения фенотипически отличающихся штаммов чумного микроба из этого очага и микробных сообществ, ассоциированных с Y. pestis, в организме блох. Существование перечисленных выше проблем определяет актуальность выбранного направления исследований. Полученные при их выполнении результаты позволят с большей степенью достоверности осуществлять дифференциацию штаммов Y. pestis при проведении идентификации возбудителя, дополнить знания о закономерностях эпизоотического процесса в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы, а также оценить реальную степень риска инфицирования человека при контакте с природным очагом.
Цель исследования. Изучение микробиологических аспектов биоцено-тической структуры Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы и факторов, обусловливающих его активность в современных условиях.
Задачи исследования:
Изучить фенотипические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в последние годы в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге.
Сравнить плазмидный состав изолятов Y. pestis из Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы и оценить геноти-пический полиморфизм штаммов по хромосомному локусу с вариабельным числом тандемных повторов (CAAA)N.
Провести многолокусный анализ областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) и филогенетический анализ штаммов Y. pestis из Центрально-Кавказского высокогорного очага.
Определить современную структуру ареала возбудителя чумы в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге на основании полученных экспериментальных данных и многолетних результатов эпи-зоотологического обследования.
Оценить в экспериментальных условиях эффективность передачи возбудителя чумы двух плазмидоваров блохами Citellophilus tesquorum белым мышам.
Изучить длительность сохранения возбудителей чумы двух плазмидоваров и листериоза при заражении блох С. tesquorum моно - и смешанными культурами микроорганизмов при содержании насекомых в различных температурных режимах.
Определить диагностическую ценность и возможности усовершенствования ПЦР - анализа блох на чуму при микст-инфицировании их чумным микробом и листериями.
Проанализировать современное состояние основных параметров эпи-
зоотической активности Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы. 9. Выяснить современные тенденции в характере социальных предпосылок эпидемичности чумы в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге.
Научная новизна
Определены основные характеристики возбудителя чумы из Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы на нынешнем этапе, соответствующие его разделению на два плазмидовара. Представлен ареал возбудителя чумы каждого из двух плазмидоваров на территории Центрально-Кавказского высокогорного природного очага.
Впервые выявлена гетерогенность циркулирующих в очаге штаммов Y. pestis по VNTR - профилю и MLVA генотипам, дана оценка генетической вариабельности и территориального распределения штаммов с разными генотипами в целом по очагу и отдельным ландшафтно-географическим районам.
Выявленные молекулярно-генетические характеристики сопряжены с приуроченностью Y. pestis к конкретным ландшафтно-географическим районам очага и подтверждают ранее выявленные особенности его биоценотической структуры, связанные с циркуляцией гетерогенных по признаку пролинзависи-мости, вирулентности для лабораторных животных и наличию плазмиды p4Md штаммов чумного микроба. Скорректирована структура ареала возбудителя чумы в конкретных ландшафтно-географических районах Центрально-Кавказского высокогорного природного очага на основании данных о феноти-пической гетерогенности и генетическом полиморфизме циркулирующих на его территории штаммах.
Впервые выявлены закономерности доминирования каждого из плазмидоваров Y. pestis в организме эффективного переносчика С. tesquorum, связанные с температурными условиями содержания блох, а также особенности передачи возбудителя чумы лабораторным животным. Впервые в опытах, модели-
рующих температурный режим их существования в летний и зимний сезон, получены данные о сохраняемости чумного микроба двух плазмидоваров, циркулирующих в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге и листе-рий в организме блох, в зависимости от температурных условий содержания С. tesquorum. Установлено преимущество применения магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из зараженных микстами (чумным микробом и листе-риями) блох для ПЦР-анализа, заключающееся в сокращении времени исследования.
Впервые проведен анализ активности основных эпизоотологических факторов в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы в современный период времени, позволивший вскрыть причины резкой неравномерности интенсивности эпизоотических проявлений на отдельных ландшафт-но-географических участках очаговости чумы при невысокой экстенсивности эпизоотии в целом по очагу.
Впервые охарактеризованы современные особенности антропогенного влияния на природно-очаговой по чуме территории: интенсификация освоения Центрального Кавказа человеком, завоз серой крысы в населенные пункты, непосредственно примыкающие к участкам очага с постоянной эпизоотической активностью, инфестированность (несмотря на проведение дератизационных работ) закрытых стаций мышевидными грызунами.
Практическая значимость
На основании полученных данных генетическое типирование, основанное на анализе областей генома с вариабельным числом тандемных повторов, и филогенетический анализ рекомендованы нами в качестве дополнительных методов дифференциации циркулирующих в очаге штаммов возбудителя чумы.
При участии автора составлен атлас Центрально-Кавказского (Приэльб-русского) природного очага чумы (справочно-кадастровые карты), изданный СтавНИПЧИв 1999 г.
Материалы исследований легли в основу трех методических рекомендаций: "Применение магноиммуносорбентов в методах экспресс-диагностики чумы", одобренных Ученым Советом, утвержденных директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 22.09.99 г. (протокол № 9) и утвержденных директором Всекитайского Центра по чуме и бруцеллезу 15.10.99 г., "Методические рекомендации по изучению свежевыделенных штаммов чумного микроба из Центрально-Кавказского природного очага чумы", одобренных Ученым Советом и утвержденных директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 30.05.02 г. (протокол № 5), "Методические рекомендации по оптимизации эпизоотологическо-го обследования Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы", одобренных Ученым Советом и утвержденных директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института 25.05.04 г. (протокол № 5).
Основные положения, выносимые на защиту:
Циркулирующие в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге штаммы чумного микроба относятся к двум инфраподвидовым группам, отличающимся между собой генетическими характеристиками по результатам VNTR, MLVA и филогенетического анализа.
Современная структура ареала возбудителя чумы в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы характеризуется расширением территории с циркуляцией штаммов второго плазмидовара в существующих границах очага.
В организме эффективного переносчика С. tesquorum доминирование каждого из двух плазмидоваров Y. pestis имеет температурозависимыи характер и обнаруживается как при раздельном, так и при совместном их существовании в блохе.
Конкурентоспособность чумного микроба из Центрально-Кавказского высокогорного природного очага и листерий в организме блох имеет темпера-турозависимый характер.
Проникновение и укоренение серой крысы в населенные пункты на эн-зоотичной по чуме территории, а также обмен блохами между горным сусликом, синантропными грызунами и мелкими млекопитающими обусловливает увеличение эпидемической опасности отдельных участков очага в современных условиях.
Антропогенное влияние в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы характеризуется в последние годы ростом масштабов освоения его территории, в том числе и на участках с постоянной эпизоотической активностью, что увеличивает вероятность контакта человека с носителями и переносчиками и закономерно увеличивает риск его заражения чумой.
Апробация работы и публикации результатов исследований
Основные результаты диссертационной работы доложены на:
-Межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Алма-Ата, 1994);
-Научно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994);
-Научно-практической конференции, посвященной 60-летию противочумной службы Кавказа (Ставрополь, 1995);
-Первой Всероссийской научно-практической конференции по генной диагностике особо опасных инфекций (Саратов, 2000);
-Международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию независимости Казахстана (Талдыкорган, 2001);
-Научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской противочумной станции (Махачкала, 2002);
-Юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Став-
ропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 2002);
- IV Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002);
-Научно-производственной конференции Кабардино-Балкарской противочумной станции (Нальчик, 2003);
-Научно-практической конференции медицинской службы Северо-Кавказского регионального погрануправления Федеральной службы безопасности "Актуальные вопросы медицинского обеспечения контртеррористической операции" (Кисловодск, 2003).
По материалам диссертационной работы опубликованы 22 печатные работы.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 168 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами. Список использованной литературы включает 197 работ отечественных и 47 зарубежных источников.
