Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления об адгезивной способности бактерий 10
1.2. Адгезивные свойства чумного микроба 21
1.3. Методы изучения адгезии бактерий к клеткам макроорганизма 28
2. Собственные исследования 34
2.1. Материалы и методы исследований 34
2.1.1. Объекты исследований 34
2.1.2. Основные реактивы, используемые в работе 34
2.1.3. Оборудование и техника измерений 36
2.1.4. Приготовление суспензии бактерий 36
2.1.5. Приготовление суспензии эритроцитов 37
2.1.6. Обработка эритроцитов формалином и танином 37
2.1.7. Получение сыворотки и плазмы крови человека 38
2.1.8. Оценка адгезивной способности бактерий на модели эритроцитов традиционными методами 38
2.1.9. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток 40
2.1.10. Оценка гемагглютинирующей активности бактерий 40
2.1.11. Обработка бактерий трипсином : 41
2.1.12. Обработка экспериментальных данных 41
2.2. Результаты исследований 42
2.2.1. Оценка адгезивных свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов при помощи традиционных методов 42
2.2.2. Разработка фотоколориметрического метода оценки адгезивных свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов человека 46
2.2.2.1. Выявление возможности регистрации адгезии бактерий к эритроцитам с помощью фотоколориметрии 46
2.2.2.2. Выбор оптимальных и стандартных условий для оценки адгезивной активности штамма Y. pestis EV НИИЭГ 52
2.2.3. Исследование влияния условий культивирования бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и физиологического состояния микробной культуры на адгезивные свойства штамма 59
2.2.4. Определение гидрофобных свойств бактерий Y. pestis EV НИИЭГ 63
2.2.5. Сравнение адгезивности и гемагглютинирующей активности бактерий Y pestis EV 1-тИЭГ 64
2.2.6. Оценка влияния трипсина и высокой температуры на адгезивную способность бактерий Y. pestis EV НИИЭГ 66
2.2.7. Адгезивные свойства штамма Y. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов различных доноров 67
2.2.8. Адгезивные свойства штамма Г. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов различных видов животных 69
2.2.9. Влияние антибиотиков па адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека 73
2.2.10. Влияние плазмы и сыворотки крови, а также их отдельных компонентов на адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека 75
2.2.11. Исследование механизма действия сыворотки крови и её компонентов на адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека 77
3. Обсуждение результатов 80
4. Выводы 96
5. Список литературы 98
- Современные представления об адгезивной способности бактерий
- Оценка адгезивной способности бактерий на модели эритроцитов традиционными методами
- Оценка адгезивных свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов при помощи традиционных методов
- Адгезивные свойства штамма Г. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов различных видов животных
Введение к работе
Актуальность темы. Чума является зооантропонозным инфекционным заболеванием бактериальной природы, характеризующимся контагиозностью, тяжелым течением и высокой летальностью (Смирнова, Кутырев, 2006; Трухачев, Лебедев, 2006). Став в прошлом причиной гибели миллионов людей, упадка государств и цивилизаций, чума и на сегодняшний день сохраняет высокий эпидемический потенциал (Анисимов, 2002; Кутырев, 2008). Реальную угрозу появления вспышек болезни в современном мире создает активизация природных и антропургических очагов чумы, занимающих значительные территории, усиление миграционных процессов, а также возможность использования возбудителя (Yersinia pestis) биотеррористами (Lippi, Conti, 2002; Riedel, 2005; Попов с соавт., 2007).
В последние годы достигнуты значительные успехи в исследовании физиологических и биохимических особенностей чумного микроба, обуславливающих его патогенность. Достаточно полно охарактеризованы факторы агрессии Y. pestis, подавляющие защитные реакции хозяина и обеспечивающие выживание популяции в условиях макроорганизма (Viboud, Bliska, 2005; Knirel et al., 2006; Афанасьева с соавт., 2008). В то же время слабо освещенными остаются вопросы, касающиеся адгезивной способности чумных бактерий в отношении эукариотических клеток (Huang, Lindler, 2004; Liu et al., 2006).
По современным представлениям, адгезия возбудителя играет ключевую роль в развитии любого инфекционного процесса, во многом определяя его начало, характер и течение (Boyle, Finlay, 2003; Labbate et al., 2007). В микробной клетке функцию распознавания и связывания с клетками-мишенями выполняют поверхностные субстанции, так называемые адгезины, которые могут быть представлены белками наружной мембраны, а также специализированными органеллами – пилями (Сидоренко, 2001; Мавзютов с соавт., 2007). Структуры, подобные пилям ряда прокариот, выявлены и у чумных бактерий (Lindler, Tall, 1993). Установлено, что клетки Y. pestis обладают способностью прикрепляться к искусственным поверхностям (Дятлов с соавт., 1991) и культивируемым эпителиальным клеткам дыхательного тракта человека (Thomas, Brooks, 2004; Бахтеева, 2008). Однако эти сведения не позволяют оценивать адгезивный потенциал возбудителя чумы в полной мере.
Анализ литературы (Поспелова с соавт., 1998; Телесманич с соавт., 2004; Зайцева, Сомов, 2006) свидетельствует о том, что универсальной моделью для исследования адгезии бактерий являются эритроциты, что связано с присутствием на их поверхности гликофорина, идентичного гликокаликсу эпителиоцитов, на котором расположены рецепторы для микроорганизмов. Исходя из этого, изучение возможности применения эритроцитов при оценке адгезивных свойств чумного микроба является весьма актуальным. Кроме того, учитывая присутствие патогена в кровеносном русле на стадии бактериемии (Perry, Fetherson, 1997; Анисимов, 2002), определение характера взаимодействия Y. pestis c эритроцитами как самыми многочисленными форменными элементами крови представляет самостоятельный интерес.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось определение адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ в тесте in vitro с использованием эритроцитов в качестве клеток-мишеней.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Определить возможность оценки адгезивной активности штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов человека традиционными методами.
2. Разработать метод оценки связывания клеток Y. pestis EV НИИЭГ с эритроцитами человека при помощи фотоколориметрии.
3. Определить влияние условий выращивания бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и физиологического состояния микробных клеток на их адгезивные свойства.
4. Оценить адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам людей с различными группами крови по системам АВ0 и Rh, а также к эритроцитам разных видов лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных.
5. Исследовать влияние антибиотиков, а также плазмы и сыворотки крови на проявление клетками Y. pestis EV НИИЭГ адгезивной активности в отношении эритроцитов человека.
Научная новизна. Впервые для оценки адгезивного потенциала чумного микроба на модели эритроцитов предложен фотоколориметрический метод (патент РФ на изобретение №2360969 «Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов» от 06.11.2007 г.).
Впервые осуществлена комплексная оценка влияния режима культивирования и физиологического состояния клеток Y. pestis EV НИИЭГ на их способность прикрепляться к эритроцитам. Проведено сопоставление адгезивных, гидрофобных и гемагглютинирующих свойств культур чумного микроба, выращенных в различных условиях.
Выявлено, что уровень адгезии бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека не зависит от группы крови донора по системам АВ0 и Rh, но в то же время зависит от индивидуальных особенностей эритроцитов. Впервые установлены существенные различия в способности чумного микроба прикрепляться к эритроцитам разных видов млекопитающих.
Показано отсутствие влияния терапевтических и субтерапевтических концентраций антибиотиков (гентамицина, доксициклина, цефотаксима и ампициллина) на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека. В то же время обнаружено, что плазма и сыворотка крови человека, а также их отдельные белковые компоненты обладают выраженными антиадгезивными свойствами в отношении чумных бактерий.
Практическая значимость работы.
Полученные в работе результаты вносят значительный вклад в раскрытие феномена адгезивной активности чумного микроба, и как следствие, способствуют пониманию основ его патогенности.
Предложен информативный и доступный для практического применения метод определения адгезивной способности бактерий Y. pestis на модели эритроцитов при помощи фотоколориметрии. Метод может быть использован для изучения механизмов, участвующих в прикреплении патогена к клеткам хозяина, и поиска соединений, способных блокировать данный процесс. Кроме того, разработанный фотоколориметрический метод может найти применение при оценке адгезивных свойств других микроорганизмов бактериальной природы.
Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись лично автором или при его непосредственном участии в составе научной группы, возглавляемой к.м.н., доцентом В.А. Обориным. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанный фотоколориметрический метод регистрации прикрепления бактерий Y. pestis к эритроцитам в условиях in vitro позволяет оценивать адгезивные свойства чумного микроба.
2. Экспрессия бактериями Y. pestis EV НИИЭГ факторов адгезии в значительной степени зависит от состава питательной среды и температуры выращивания микробной культуры. Оптимальная по составу питательная среда обеспечивает стабильность адгезивной активности микробных клеток как в ходе пассажей in vitro, так и после лиофильного высушивания.
3. Внутривидовые и межвидовые различия в устойчивости эритроцитов к прикреплению бактерий Y. pestis EV НИИЭГ свидетельствуют о роли рецепторных структур клеток-мишеней в реализации чумным микробом адгезивной способности.
4. Сыворотка (плазма) крови человека, а также её отдельные компоненты препятствуют проявлению клетками Y. pestis EV НИИЭГ адгезивных свойств в отношении эритроцитов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научно-практической конференции и школе по инфекционной патологии (с международным участием) (Москва, 2007), международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологии в Кировской области» (Киров, 2008), 8-й научной конференции аспирантов и соискателей «Науке нового века – знания молодых» (Киров 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Достижения ветеринарной науки и практики» (Киров, 2008), Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора П.Г. Петского «Современные научные тенденции в животноводстве» (Киров, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен 1 патент РФ на изобретение.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., профессору В.Е. Романову, к.м.н., доценту В.А. Оборину за формирование научной концепции работы и методические консультации при её выполнении, а также аспирантам кафедры микробиологии ГОУ ВПО «ВятГУ» О.В. Вылегжаниной и Ф.И. Лянгасовой за помощь при проведении экспериментальных исследований.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 221 источников, в том числе 112 зарубежных. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 12 таблицами.
Современные представления об адгезивной способности бактерий
Микроорганизмы — самая древняя форма организации жизни на нашей планете, представляющая собой многочисленную и разнообразную группу. В процессе эволюции представители основной такономической группы микроорганизмов - бактерии приспособились к существованию в различных абиотических (почве, воде, воздухе) и биотических (простейших, растениях, организме животных и человека) экологических нишах (Воробьев с соавт., 2000; Анисимов, 2002). Колонизация бактериями той или иной среды обитания возможна только благодаря их способности к адгезии, то есть прикреплению к поверхностям различной природы с последующим размножением (Donlan, Costerton, 2002).
В настоящее время считается, что с закреплением на каких-либо субстратах связан образ жизни большинства микроорганизмов. Размножение в бульонной культуре, используемое в лабораторных условиях, является скорее исключением, чем «правилом» в жизни бактерий (Сидоренко, 2001). Среди множества факторов, приносящих очевидную пользу прикреплению, выделяют следующие: - адгезия микробных клеток к субстрату создает более выгодные условия существования: облегчает доступ к питательным веществам, противодействует механическому удалению из макроорганизма; - на адгезированные бактерии в меньшей степени воздействуют токсичные соединения, так как они диффундируют лишь с одной стороны и нейтрализуются всем микробным сообществом, а не одиночной клеткой; - в прикрепленных микробных сообществах больше возможностей для обмена генетическим материалом (плазмидами), в том числе информации о детерминантах резистентности; -для анаэробных форм расположение в глубоких слоях колоний (или тканях) является условием вегетирования (Shink, 1998). Адгезивная активность необходима микроорганизмам при сапрофитическом образе жизни, в то же время она служит первым, хотя и недостаточным, условием осуществления перехода гетеротрофов к паразитическому способу существования (Литвинов, 1998). Именно у болезнетворных бактерий адгезивность достигает высокой степени специфичности. Прикрепление патогенов к эукариотическим клеткам служит пусковым этапом в колонизации тканей хозяина и начальным звеном в развитии инфекции (Юринова с соавт., 2001; Boyle, Finlay, 2003; Зайцева с соавт., 2006; Labbate et al., 2007; Арасланова, 2009; Благонравова с соавт., 2009). Известно, что 80% инфекционных заболеваний человека начинается с колонизации бактериями открытых частей тела - кожи и слизистых оболочек полостей, сообщающихся с внешней средой (Петровская, 1980). При трансмиссивном механизме передачи, то есть при кровяных инфекциях, также сначала возникает очаг колонизации эндотелия сосудов (Walker, 1984).
Адгезию патогенных микроорганизмов следует рассматривать как приспособительную реакцию, направленную на противостояние механическому удалению и выживание в тканях макроорганизма (Dubreuil et al., 2002). Прикрепление возбудителей к клеткам-мишеням и последующее установление взаимоотношений между патогеном и хозяином существенно интенсифицируют основные физиологические процессы в микробной клетке, меняют размеры и морфологию бактерий, увеличивают скорость их размножения, способствуя дальнейшей инвазии в ткани макроорганизма (Еропкина, Афиногенов, 1994).
В отличие от возбудителей инфекционных болезней высокая адгезивность представителей нормальной микрофлоры полезна для организма, так как она во многом обеспечивает его колонизационную резистентность (Колганова с соавт., 2002). Нормофлора человека и животных в биотопе может находиться либо в свободном состоянии, либо в прикрепленном, образуя биопленку. Нефиксированная микрофлора слущивается с поверхности слизистой и выбрасывается во внешнюю среду с выделениями (слюной, испражнениями, мочей). Микрофлора, формирующая биопленку, создает конкуренцию за сайты адгезии с инфекционными агентам и, тем самым, защищает организм хозяина от колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами (Costerton et al., 1999, 2003; Симонова, Пономарева, 2008).
Адгезивный процесс преимущественно изучен при колонизации бактериями слизистых оболочек пищеварительного, дыхательного и урогенитального трактов (Костюкова, 1989; Сидоренко, 2001; Мавзютов с соавт., 2007; Saldana et al., 2009). Прикреплению микробных клеток к эпителию предшествует фаза приближения, в которой у подвижных форм микроорганизмов играют роль хемотаксис и жгутики (Otterman, Miller, 1997). Для расщепления слоя слизи, покрывающего эпителий, бактерии вырабатывают целый ряд ферментов - гиалуронидазы, нейраминидазы, протеазы, дезоксирибонуклеазы (Дмитриева с соавт., 2009).
По мнению большинства исследователей, адгезия протекает в две стадии. Первая (неспецифическая) стадия осуществляется с помощью физико-химических факторов, удерживающих бактерии на поверхности клеток хозяина. В ней принимают участие гидрофобные и электростатические силы, а также силы ван-дср-Ваальса и водородные связи (Езепчук, 1985; Carpentier, Cerf, 1993; An et al., 2000; Dubreuil et al., 2002; Dunne, 2002). При этом электростатический барьер, существующий за счет отрицательного заряда, как микробной, так и эукариотической клеток, преодолевается благодаря гидрофобности поверхностных структур микроорганизмов (Дмитриева, 2007) и притяжению на основе сил Дерюгина-Ландау (Jones, Isaacson, 1983). Кроме того, катионы Са"+, Мп2+, и Fe3+ могут играть роль ионных мостиков между отрицательно заряженными поверхностными молекулами (Plotkin, Bemis, 1984). Неспецифическая адгезия является обратимой, так как физико-химическая связь с клетками ещё недостаточно прочна (An et al., 2000).
Оценка адгезивной способности бактерий на модели эритроцитов традиционными методами
На сегодняшний день определение адгезивых свойств микроорганизмов занимает прочное место в микробиологических исследованиях (An et al., 2000; Sahly et al., 2000; Курилова с соавт., 2004; Pultz et al., 2006; Колякина, 2009; Saldana et al., 2009). Для оценки связывания бактерий с эукариотическими клетками предложены методы как in vivo, так и in vitro (Телесманич с соавт., 2004; Смолина с соавт., 2006; Chakraborty et al., 2008).
Методы in vivo, в основном, применяются при определении адгезивности возбудителей кишечных инфекций и включают использование моделей петель кишечника кроликов-сосунков, телят, поросят (Агр, 1988; Король с соавт., 1989), а также белых крыс и мышей (Ефремов соавт., 1981; Горская с соавт., 1989). Исследование адгезии бактерий в условиях организма чувствительных экспериментальных животных наиболее правомерно, так как позволяет учитывать особенности патогенеза заболевания, оценивать взаимосвязь адгезивных свойств с прочими факторами патогенности. Однако, несмотря на высокую информативность, методы in vivo трудоемки, дорогостоящи, длительны, непригодны для изучения большого количества штаммов, доступны не каждой лаборатории, а кроме того, исключают возможность работы с клетками и тканями человеческого происхождения (Телесманич с соавт., 2004).
В связи с этим наибольшее распространение получили методы оценки адгезии in vitro (Макаренкова с соавт., 1999; Sahly et al., 2000; Labbate et al., 2007; Благонравова с соавт., 2009). Их использование создает возможность экспресс-анализа, решает этические проблемы использования лабораторных животных, позволяет проводить оценку адгезии на клетках человека (Афиногенов с соавт., 1996; Телесманич с соавт., 2004).
Методы in vitro заключаются в совместной инкубации бактерий с суспензиями эукариотических клеток, культурами клеток и тканей с последующим учетом прикрепившихся микроорганизмов методом световой микроскопии (Колганова с соавт., 2002; Зайцева, Сомов, 2006; Смолина с соавт., 2006; Ананьева с соавт., 2007), радиометрическим методом (Базеров с соавт., 1993; Бондаренко с соавт., 1996) или путем высева на агаризованную среду (Бахолдина с соавт., 2005; Chakraborty et al., 2008). При этом радиометрический (изотопный) метод не получил широкого распространения в силу отсутствия в большинстве лабораторий необходимого оборудования. стоимостью работ. Помимо этого, при использовании стандартных клеточных культур невозможно учитывать индивидуальные особенности рецепторов клеток макроорганизма.
Альтернативой эпителиоцитам при оценке адгезии являются эритроциты (Брилис с соавт., 1986; Булатов, 2003; Богданова с соавт., 2006; Зайцева, Сомов, 2006; Ананьева с соавт., 2007; Харсеева с соавт., 2009). Эти клетки обладают необычайно активной мембраной с мощным рецепторным аппаратом, что дает им возможность принимать участие в самых разнообразных процессах, протекающих в организме (Мушкамбаров, Кузнецов, 2003). Известно, что гликофорин - один из основных гликопротеидов мембраны эритроцитов (сиалогликопротеид) - идентичен поверхностному слою эпителиальных клеток (гликокаликсу), на котором расположены рецепторы для адгезинов микробных клеток. Данное сходство, а также простота получения эритроцитов в необходимых количествах делает их удобной и информативной моделью для изучения адгезивных свойств микроорганизмов (Поспелова с соавт., 1998; Телесманич с соавт., 2004; Зайцева, Сомов, 2006).
Как метод оценки адгезивности микробных клеток на модели эритроцитов применяется реакция гемагглютинации (РГА) (Макаренкова с соавт., 1999; Смирнова с соавт., 2000; Sahly ct al., 2000; Харсеева с соавт., 2009). Впервые факт склеивания эритроцитов бактериями был установлен еще в начале 20 века. С этого времени гемагглютинирующая активность микроорганизмов рассматривалась как индикатор их адгезивности (Агр, 1988). Способность бактерий склеивать эритроциты облегчила классификацию адгезинов и микробных штаммов (Evans et al., 1980). Ингибирование гемаггютинирующей активности пилей I типа D-маннозой явилось свидетельством того, что данный моносахарид является компонентом рецепторов для этих пилей (Бухарин, Усвяцов, 1996).
Вместе с тем в литературе еще в 70-80 годах 20 века появились сообщения об отсутствии корреляции между гемагглютинирующей активностью и адгезивностыо бактерий. Согласно Дагуид с соавторами, из обнаруженных у энтеробактерий шести типов фимбрий только три обуславливали положительную РГА (Duguid et al., 1979). Восбек с соавторами при сравнении адгезивной активности Е. coli к эпителиоцитам человека с их способностью склеивать эритроциты и наличием пилей установили, что данные свойства проявлялись независимо одно от другого (Vosbeck et al., 1980).
Кроме РГА предложены и другие методы исследования адгезивной активности бактерий с использованием эритроцитов. Метод, разработанный Брилис с соавторами, заключается в совместной инкубации бактерий с эритроцитами и последующей оценке результатов взаимодействия между клетками с помощью световой микроскопии (Брилис с соавт., 1986). Эффективность метода была показана авторами в сравнительных исследованиях с использованием тканевых культур и изолированных эпителиальных клеток. Данный метод полностью себя оправдал при исследовании адгезии более 4000 штаммов различных видов лактобацилл, энтеробактерий, стафилококков и стрептококков. Как правило, именно методом Брилис пользуются отечественные авторы при определении адгезивных свойств микроорганизмов (Макаренкова с соавт., 1999; Курилова с соавт., 2004; Телесманич с соавт., 2004; Зайцева, Сомов, 2006; Смолина с соавт., 2006; Евтеева, 2009; Колякина, 2009). При этом отмечается, что уровень адгезии, проявляемой бактериями в отношении эритроцитов и эпителиоцитов, имеет прямую корреляцию.
Оценка адгезивных свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов при помощи традиционных методов
При установлении возможности оценки связывания микроорганизмов с эритроцитами предложенным методом применяли культуру У. pestis EV НИИЭГ I генерации, выращенную на ГРМ-агаре с добавлением ГВ. В качестве сравнения был использован музейный штамм S. epidermidis (неадгезивный микроорганизм).
Бактерии суспендировали в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2). О концентрации клеток в суспензии судили по величине её ОП. Концентрация бактерий во всех опытах была постоянной и соответствовала 1,0 единице ОП. Для соблюдения стандартных условий эксперимента на данном этапе исследований применяли эритроциты только одного донора 0(1) Rh+ группы крови.
В центрифужные пробирки вносили по 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл суспензии эритроцитов в концентрации 0,1хЮ9/мл. Контролем служили пробы, содержащие 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольная проба №1) и 1,0 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольная проба №2). Опытные и контрольные пробы инкубировали при температуре (37±1)С на вращающейся платформе в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 80 g в течение 1,5 мин для осаждения эритроцитов. После этого из проб отбирали надосадочную жидкость в объёме 2,0 мл и измеряли её ОП. Степень адгезии бактерий рассчитывали по видоизмененной нами формуле определения гидрофобных свойств микробных культур: где ПА - показатель адгезии (первоначальное название - показатель бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ)), Дк) - ОП надосадочиой жидкости в контрольной пробе №1, Дк2 - ОП надосадочной жидкости в контрольной пробе №2, Доп - ОП надосадочной жидкости в опытной пробе. Полученные в эксперименте значения ОП надосадочной жидкости проб, а также рассчитанные с их помощью показатели, харатеризующие уровень адгезии тестируемых культур бактерий, приведены в табл. 2. Показатели, используемые при оценке адгезии бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и S. epidermidis к эритроцитам человека фотоколориметрическим методом (М±т; п=5) Величина ПА штамма Y. pestis EV НИИЭГ составила 26,5±3,6%, что свидетельствовало о прикреплении к эритроцитам соответствующего процента микробных клеток. Близкое к нулю значение ПА штамма S. epidermidis свидетельствовало об отсутствии у него адгезивной активности. Для визуализации процесса взаимодействия между бактериями и эритроцитами использовали метод «раздавленной капли». Для этого на хорошо обезжиренные предметные стекла наносили небольшое количество осадка из опытных проб после центрифугирования. Препараты накрывали покровными стеклами и исследовали в иммерсионной системе микроскопа. І Іри микроскопии осадка пробы, содержащей смесь эритроцитов и клеток У. pest is EV ЫИИЭГ, на поверхности почти каждого эритроцита были видны прикрепившиеся микроорганизмы (рис. 5 А) в количестве от 1 до 10. На некоторых эритроцитах бактерии располагались конгломератами из 20 и более клеток. При просмотре под световым микроскопом препаратов с культурой S. epidermidis наблюдали отдельно расположенные эритроциты, в пространстве между ними - многочисленные микробные клетки шаровидной формы (рис. 5 Б). Бактерий, прикрепившихся к эритроцитам, в поле зрения видно не было. Таким образом, световая микроскопия подтверждала результаты фотоколориметрической оценки адгезии. Далее нами был проведен выбор оптимального соотношения микробных и эукариотических клеток. Для этого готовили суспензии эритроцитов в концентрации 0,1x109, 0,25x109- 0,5x109, 1,0x10Ч, 2,0x109/мл, которые инкубировали с микробной суспензией, стандартной по количеству клеток, после чего определяли ПА (рис. 6). Показатель адгезии бактерий У. pestis EV НИИЭГ и S. epidermidis к эритроцитам человека в зависимости от концентрации эритроцитов Увеличение концентрации эритроцитов в пробах приводило к существенному повышению ПА клеток Y. pestis EV НИИЭГ и не влияло на регистрируемый уровень адгезии клеток S. epidermidis. Вместе с тем при использовании суспензии эритроцитов в концентрации 2,0х109/мл значение ПА вакцинного штамма чумного микроба приближалось к 100%, что свидетельствовало о прикреплении к эритроцитам практически всех микробных клеток, находящихся в суспензии. Поэтому для проведения дальнейших исследований выбрали концентрацию эритроцитов 1,0 109/мл. При этом величина ПА культуры Y. pestis EV НИИЭГ была достаточно высокой - на уровне 80%, но в то же время в пробах оставались микробные клетки, не связанные с эритроцитами (около 20% от общего количества). Для оценки адекватности результатов, получаемых фотоколориметрическим методом, определяли ПА штамма Y. pestis EV НИИЭГ, а также ряда микробных штаммов различного происхождения (пробиотических, клинических, музейных). Установленные значения сопоставляли с показателями адгезивности этих же штаммов, полученных по методу Брилис (табл. 3).
В проведенном эксперименте величина ПА штамма Y. pestis EV НИИЭГ составила 76,0±4,8%. Значения ПА пробиотических штаммов варьировали от 0,7±2,5 до 7,3±2,2%, клинических штаммов - от 2,6±1,4 до 28,1 ±3,2%, музейных штаммов - от 0,2±2,5 до 11,6±2,8%.
Адгезивные свойства штамма Г. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов различных видов животных
Несмотря на достижения последних лет в изучении патогенеза чумной инфекции, а также биохимии и генетики самого возбудителя (Анисимов, 2002; Федорова, Голова, 2005; Viboud, Bliska., 2005; Zhou et al., 2006), ряд вопросов, касающихся физиологии Y. pestis, остаётся открытым. В частности, недостаточно исследована способность чумного микроба прикрепляться к эукариотическим клеткам, до конца не выяснена природа факторов адгезии, экспрессируемых бактериями (Водопьянов, Мишанькин, 1985; Liu et al., 2006; Бахтеева, 2008). Вместе с тем, установление взаимоотношений между возбудителем и клеткой хозяина при формировании межклеточных контактов рассматривается в настоящее время как важное звено в ходе патогенетических событий, определяющих течение любого инфекционного заболевания бактериальной природы (Еропкина с соавт., 1995; Labbate et al., 2007).
Цель наших исследований состояла в определении адгезивной активности чумного микроба в тесте in vitro на модели эритроцитов. В работе использовали штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ, составляющий основу живой чумной вакцины, успешно применяемой как в нашей стране, так и за рубежом на протяжении более 70 лет, и являющейся в настоящее время единственной лицензируемой отечественной чумной вакциной. Высокая иммуногенность, стабильность культуралыю-морфологических признаков, а также безвредность данной линии вакцинного штамма Y. pestis подтверждена многолетними исследованиями (Салтыков, Файбич, 1975), наряду с этим, штамм обладает почти всеми основными детерминантами вирулентности (Федорова с соавт., 2007).
Выбор эритроцитов в качестве субстрата адгезии был обусловлен следующим. Во-первых, в настоящее время эритроциты считаются «универсальной» моделью эукариотических клеток для выявления адгезивных свойств у бактерий в условиях in vitro, что связано с их доступностью, а также высоким сходством поверхностных гликопротеидов эритроцитов и эпителиоцитов (Поспелова с соавт., 1998; Телесманич с соавт., 2004; Зайцева с соавт., 2006). Во-вторых, принимая во внимание присутствие возбудителя в кровеносном русле на стадии бактериемии при чумной инфекции (Репу, Fetherson, 1997; Домарадский, 1998; Аписимов, 2002), определение характера взаимодействия Y. pestis с самой многочисленной группой форменных элементов крови представляло самостоятельный интерес.
На момент начала настоящих исследований было известно о наличии у клеток чумного микроба и их отдельных компонентов гемагглютинирующей активности (Bichowsky-Slomniski, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов, Мишанькин, 1985; Волох, Дятлов, 2003; Makoveichuk et al., 2003). Кроме того, согласно Федоровой и Девдариани чумные бактерии обладали инвазивной способностью в отношении эритроцитов (Федорова, Девдариани, 2007). Однако вопросы адгезии, предшествующей инвазии микроорганизмов в эритроциты, авторами не рассматривались.
Первоначально определяли возможность оценки адгезивных свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели нативных эритроцитов человека группы крови ЛВ(1) Rh+ традиционными методами. При этом использовали метод Брилис, заключающийся в определении уровня адгезии после смешивания бактериальных клеток и эритроцитов, и метод Гизатулиной, основанный на установлении факта связывания эритроцитов с микробными колониями.
Нами было установлено, что метод Брилис позволял оценивать прикрепление клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека, но обладал существенными недостатками, к которым относились трудоемкость подсчета адгезированных бактерий, ограниченное количество исследуемых эритроцитов, а іакже субъективность получаемых результатов в связи с невозможностью дифференцировать микробные клетки, прикрепившиеся к эритроцитам и расположенные на их фоне. Не исключено, что на архитектонику клеток могло влиять применение жидкого фиксатора (смесь Никифорова) и анилиновых красителей при приготовлении препаратов для микроскопии. При использовании метода Гизатулиной адгезивно-активных колоний бактерий Y. pestis EV НИИЭГ не обнаружили, следовательно, данный метод был непригоден для выявления у чумного микроба адгезивной активности. Таким образом, результаты начального этапа исследований свидетельствовали о необходимости разработки новых подходов к оценке адгезии микроорганизмов in vitro на модели эритроцитов.
Нами был предложен метод определения уровня адгезии, основанный на фотоколориметрической регистрации прикрепления бактерий к эритроцитам после их совместной инкубации на вращающейся платформе при температуре (37±1)С в течение 30 мин и последующего осаждении эритроцитов путем центрифугирования. При этом уменьшение ОП суспензии микробных клеток после её инкубации с эритроцитами и осаждения последних по сравнению с ОП исходной микробной суспензии свидетельствовало о прикреплении к эритроцитам определенного процента микроорганизмов, находящихся в пробе. Показатель адгезии (ПА) рассчитывали по видоизмененной нами формуле определения гидрофобных свойств микробных клеток и выражали в процентах.
В предварительных опытах было показано, что фотоколориметрический метод позволял регистрировать адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к нативным эритроцитам человека AB(I) Rh+ группы крови. В то же время, у музейного штамма S. epidermidis, используемого в качестве отрицательного контроля (неадгезивный микроорганизм), адгезивная активность , не выявлялась. Данные световой микроскопии содержимого проб подтверждали результаты, полученные при помощи фотоколориметрии.
При проведении экспериментов обнаружили, что величина ПА клеток Y. pestis EV НИИЭГ в значительной степени зависела от концентрации эритроцитов в пробах. Для дальнейших исследований нами была выбрана концентрация эритроцитов, при которой ПА был достаточно высоким (на уровне 80%), но в то же время в пробах оставались микробные клетки, не связанные с эритроцитами (около 20% от общего количества).
В дальнейшем при использовании штамма Y. pestis EV НИИЭГ, а также пробиотических, клинических и музейных штаммов микроорганизмов, нами была показана сопоставимость показателей адгезии, получаемых фотоколориметрическим методом и методом Брилис. Однако применение фотоколориметрии для определения адгезивности бактерий обладало значительным преимуществом. Данный метод метод являлся менее трудоемким, а также позволял определять процент клеток в микробной культуре, фиксированных на поверхности эритроцитов, одномоментно оценивая взаимодействие миллионов бактерий и эукариотических клеток, что давало более объективную характеристику адгезивной способности микробных штаммов. В отличие от традиционных методик, основанных на визуальной оценке адгезии, результаты, получаемые предложенным нами методом, базировались на показаниях прибора.
