Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori 14
1.2. Распространенность и пути передачи инфекции Н. pylori 16
1.3. Факторы вирулентности и патогенности Н. pylori 17
1.4. Резистентность Н. pylori к антибактериальным препаратам . 24
1.4.1. Антибактериальные препараты, используемые для эрадикации Н. pylori 24
1.4.2. Распространенность резистентности Н. pylori к антибактериальным препаратам 26
1.5. Диагностика хеликобактериоза 31
1.6. Реакция Агломерации объемной 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1. Бактериологические методы 39
2.1.1.Штаммы 39
2.1.2. Питательные среды 39
2.1.3. Выделение Н. pylori из биоптатов 39
2.1.4. Определение чувствительности Н. pylori к антибактериальным препаратам 40
2.1.5. Учет результатов определения антибиотикорезистентности 41
2.2. Молекулярно-генетические методы 41
2.3. Биохимические методы 42
2.3.1. Биохимическое типирование выделенных Штаммов Н. pylori 42
2.3.2. Получение растворимого хеликобактерного антигена из бактериальной массы 42
2.4. Серологические методы 43
2.4.1. Иммуноферментный анализ 43
2.4.2. Получение хеликобактерной кроличьей сыворотки 43
2.5. Постановка реакции агломерации объемной 43
2.6. Оценка аналитических операционных характеристик диагностикума 44
2.7. Статистическая обработка результатов и оценка диагностических операционных характеристик сконструированного антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума 45
ГЛАВА 3. Особенности генотипов штаммов я pylori, циркулирующих в г.ростове-на-дону и ростовской области 47
ГЛАВА 4. Мониторинг уровней антибиотикорезистентности региональных штаммов к pylori . 53
ГЛАВА 5. Конструирование антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума 68
5.1. Получение полимерного носителя 68
5.2. Получение растворимого хеликобактерного антигена 69
5.3. Иммобилизация антигенного хеликобактерного комплекса на полимерном носителе 71
5.4. Характеристика растворимого антигенного комплекса 75
5.5. Получение экспериментальных контрольных кроличьих хеликобактерных сывороток 76
5.6. Оценка аналитических характеристик антигенного полимерного хеликобактерного РАО-диагностикума 79
5.7. Лиофилизация антигенного полимерного хеликобактерного РАО-диагностикума 82
5.8. Технологическая схема получения антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума и контрольных кроличьих сывороток 84
ГЛАВА 6. Исследование диагностических операционных характеристик сконструированного антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума 87
6.1. Предварительная оценка эффективности диагностикума для различных точек разделения 88
6.2. Определение диагностического титра 96
ГЛАВА 7. Практическое применение сконструированного антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума 103
7.1. Сравнительный анализ результатов, полученных с помощью бактериологического метода и РАО-диагностикума 103
7.2. Применение РАО-диагностикума в качестве скринингового теста 107
Заключение 110
Выводы 117
Практические рекомендации 118
Список литературы 119
- Факторы вирулентности и патогенности Н. pylori
- Мониторинг уровней антибиотикорезистентности региональных штаммов к pylori
- Иммобилизация антигенного хеликобактерного комплекса на полимерном носителе
- Предварительная оценка эффективности диагностикума для различных точек разделения
Введение к работе
Бактерия Helicobacter pylori сегодня является одной из наиболее изучаемых бактерий в мире. Примерно 60% населения земного шара инфицировано Н. pylori (Кишкун А.А., 2002). Инфицированность взрослого населения России колеблется от 50 до 80%, а в некоторых регионах она приближается к 100% (Григорьев П.Я., с соавт, 1999; Пасечников В.Д. с соавт., 2001; Решетников О.В. с соавт., 2004; Ивашкин В.Т. с соавт., 2005).
Н. pylori не является облигатным патогеном, для большинства инфицированных характерно бессимптомное носительство. Вместе с тем, эпидемиологические данные, полученные в различных странах, свидетельствуют о том, что практически 100% язв двенадцатиперстной кишки и более 80% язв желудка связаны с персистированием Н. pylori (Маев И.В. с соавт., 2006). Сегодня доказано, что инфекция Н. pylori является важнейшим этиопатогенети-ческим фактором не только язвенной болезни, но и хронического гастрита, ассоциированного с Н. pylori в 75-92% случаев, гастродуоденита, MALT-лимфомы и рака желудка (Аруин Л.И.,1999; Исаков В.А. с соавт., 2003; Маев И.В. с соавт., 2006; Howden C.W., 1996; Kusters J.G. et al., 2006). В последние годы установлена связь этой инфекции и с рядом не гастроэнтерологических заболеваний (Бардахчьян Э.А. с соавт., 2005; Корниенко Е.А., 2009).
Н. pylori имеет широкий набор генетических факторов, которые обеспечивают ему способность адаптироваться и выживать в кислой среде, колонизируя слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки, и вызывать заболевание (Шкитин В.А. с соавт., 2002; Kusters J.G. et al., 2006). Основными среди них являются ферменты адаптации, цитотоксин ассоциированный белок CagA, вакуолизирующий цитотоксин VacA, белки, кодируемые генами iceA и ЬаЬА, внешние мембранные протеины.
Определение факторов патогенности штаммов Н. pylori, выделенных от пациентов, проживающих в различных регионах России, расценивается'как одна из определяющих составляющих в эпидемиологии и лечении И. pylori-
7 инфекции (Говорун В.М. с соавт., 2002; Кудрявцева Л.В. с соавт., 2004; Пасечников В.Д. с соавт., 2005; Федоренко СВ., 2006; Абузарова Э.Р.,2008).
Современное лечение больных с хеликобактер-ассоциированными заболеваниями предусматривает проведение антихеликобактерной терапии, которая, как правило, осуществляется без определения чувствительности Н. pylori к антибактериальным средствам. Однако Маастрихтское соглашение-3, основной рекомендательный документ по диагностике и лечению заболеваний, ассоциированных с инфекцией Н. pylori, предполагает эмпирическое применение антибактериальных препаратов для терапии различных линий лишь при определенном, известном уровне резистентности Н. pylori к этим средствам в данном регионе или в данной популяции пациентов (Mal-fertheiner P. et al., 2005), что позволяет достаточно точно прогнозировать эффект терапии. В связи с этим актуальным является определение текущего состояния региональной антибиотикорезистентности Н. pylori для выбора адекватной стартовой антибактериальной терапии (Boyanova L., 2009).
Диагностика хеликобактер-ассоциированных заболеваний осуществляется с помощью многих лабораторно-клинических методов исследования, их оптимальное сочетание для достоверного выявления К pylori остается предметом обсуждения (Кишкун А.А. с соавт., 2003; Барышникова Н.В., 2009; Megraud F. et al., 2007). Самым простым, наименее дорогим и наиболее доступным методом диагностики хеликобактериоза является серологический метод. Он также незаменим и наиболее информативен для выяснения инфи-цированности микроорганизмом больших групп людей при проведении эпидемиологических обследований (Malfertheiner P. et al., 2005).
В настоящее время большое внимание уделяется конструированию диагностических тест-систем на синтетических полимерных носителях для серологической диагностики (Мартынов А.И. с соавт., 2001; Станишевский Я.М., с соавт., 2006; Basinska et al, 2005). Технология конструирования антигенных и антительных полимерных препаратов для диагностики ряда инфекций в реакции агломерации объемной (РАО) была разработана в Рост-
8 НИПЧИ (Наркевич А.Н. с соавт., 1988; Безуглова Е.В. с соавт., 1990; Карбышев Г.Л. с соавт., 2006; Телесманич Н.Р. с соавт., 2006; Симонова И.Р. с соавт., 2007; Веркина Л.М. с соавт., 2008). Диагностикумы на основе РАО дают возможность качественно и количественно оценивать состояние инфекционного процесса, что позволяет широко использовать их как для постановки диагноза, так и для скрининговых исследований. Отмечалось, что в ряде случаев латексные тесты демонстрируют более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с иммуно-ферментным анализом (ИФА) (Mi-dolo P.D. et.al., 1995a). Кроме того, эти тесты являются экспрессными, они не требуют для своей постановки специального оборудования, а результат теста оценивается визуально.
Широкая распространенность хеликобактериоза и наличие опасных осложнений обусловливают необходимость дальнейшего совершенствования методов диагностики заболеваний, ассоциированных с Н. pylori.
Цель работы
Охарактеризовать особенности штаммов Н. pylori, циркулирующих в Ростовской области, и разработать технологию получения антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума для экспрессного определения в реакции агломерации объемной уровня специфических антител в сыворотке крови.
Основные задачи исследования
Исследовать генотипы клинических изолятов штаммов Н. pylori, циркулирующих в Ростовской области, на присутствие генов патогенности cagA, vacA, iceA, babA.
Осуществить мониторинг уровней антибиотикорезистентности региональных штаммов Н. pylori к применяемым антибактериальным средствам в период 2000-2009 гг.
Подобрать эффективные способы получения хеликобактерного клеточного растворимого антигена для конструирования полимерного диагностикума.
Провести оценку эффективности различных способов иммобилизации хеликобактерного растворимого сенситина на полимерном носителе.
Отработать схему получения кроличьей иммунной хеликобактерной сыворотки с высокими титрами специфических антител.
Провести оценку операционных характеристик и определить диагностический титр сконструированного антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума.
Научная новизна
В результате проведенных исследований впервые: проведен анализ встречаемости генов патогенности cagA, vacA, iceA, babA и их сочетаний в штаммах Н. pylori, выделенных от больных с гастро-дуоденальной патологией в Ростовской области; получены антибиотикограммы штаммов Н. pylori, выделенных от гастроэнтерологических больных. Выявлена динамика уровней антибиотикоре-зистентности региональных штаммов в период с 2000 г. по 2009 г. Проанализированы изменения удельного веса чувствительных, моно- и полирезистентных штаммов Н. pylori; разработана технология получения антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови пациентов с гастродуоденальной патологией.
Теоретическая и практическая значимость работы Анализ динамики уровней антибиотикорезистентности региональных штаммов К pylori в период с 2000 г. по 2009 г. осуществлен на' 131 штамме, выделенном от гастроэнтерологических больных. Обнаружено существование в Ростовской области штаммов Н. pylori, обладающих множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам. Показано, что в настоящее время уровень региональной резистентности к кларитромицину не превышает пороговых значений (15 - 20%), определяемых Маастрихтскими рекомендациями, что позволяет эмпирически применять этот антибиотик в схемах антихеликобактерной эрадикационной терапии. Уровень первичной рези-
10 стентности к метронидазолу не превышает порогового значения в 40%, но близок к нему, что требует осторожности при применении этого антибактериального препарата.
В результате проведенного типирования 33 региональных штаммов Н. pylori по генам факторов патогенности (cagA, ісеА, babA и аллелям ml, m2 и si, s2 гена vacA) обнаружено 19 разных генотипов. Доля высокопатогенных штаммов с генотипом vacAsl составила 85%. Инфицирование двумя и более штаммами имело место в 33% случаев.
Полученные новые факты могут быть полезны для более глубокого понимания механизмов патогенеза хеликобактер-ассоциированных заболеваний и выработки оптимальной региональной стратегии эрадикационной терапии.
При конструировании антигенного полимерного хеликобактерного ди-агностикума для определения специфических антител к Н. pylori в сыворотке крови в РАО: определен способ дезинтеграции бактериальной массы референтного штамма H.pylori, обеспечивающий максимальный выход белка; показано, что белковый спектр растворимого антигена, полученного из бактериальной массы референтного штамма, содержит протеины, соответствующие основным факторам патогенности К pylori, что позволяет использовать этот антиген для сенсибилизации полимерных микросфер; отработаны условия сенсибилизации растворимого антигена на полимерном носителе; отработана схема иммунизации кроликов бактериальной массой Н. pylori с целью получения гипериммунной хеликобактерной сыворотки для контроля аналитической чувствительности сконструированного диагности-кума; предложен диагностический набор для определения уровня специфических антител к К pylori в сыворотке крови, состоящий из сконструированного диагностикума и ингредиентов для постановки реакции объемной агломерации; - составлена инструкция по изготовлению и контролю «Диагностикум хеликобактерный антигенный полимерный сухой для РАО», утвержденная директором РостНИПЧИ (протокол № 9 от 18.10.2001).
Диагностические характеристики сконструированного диагностикума, определенные в процессе исследования с использованием сывороток крови 224 гастроэнтерологических больных, позволяют применять его для диагностики хеликобактер-ассоциированных заболеваний и мониторинга больших групп населения с целью раннего выявления хеликобактериоза.
Результаты работы вошли в отчеты по бюджетной теме «Конструирование препаратов для диагностики хеликобактериоза у людей и идентификации возбудителя» за 2002-2005 гг. (рег.№ 01.200.2 12996.), поисковой теме «Генодиагностика Helicobacter pylori по локусам, содержащим вариабельные тандемные повторы VNTR и по генам вирулентости» (№ 091-07), прошли апробацию на базе Ростовского областного консультативно-диагностического центра и используются при чтении лекций и проведении занятий на кафедре микробиологии и вирусологии №2 РостГМУ. Приоритетность, проведенных исследований подтверждена патентами на изобретение №2308949 «Способ лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori» и №2324188 «Способ получения антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума».
Основные положения, выносимые на защиту
В Ростовской области циркулируют штаммы Н pylori различной-генетической структуры, большинство из которых являются патогенными.
Анализ результатов мониторинга уровней антибиотикорезистентно-сти региональных штаммов Н. pylori в период с 2000 г. по 2009 т. дает основание эмпирически использовать кларитромицин в схемах эрадикационной терапии в соответствии с Маастрихтскими рекомендациями в настоящее время. Уровень резистентности к метронидазолу демонстрирует тенденцию к снижению, но остается близким к пороговому.
3. Сконструированный антигенный полимерный хеликобактерный РАО-диагностикум при точке разделения 1:160 обладает чувствительностью 94,9% и специфичностью 79,3%. При точке разделения 1:320 чувствитель ность диагностикума - 84,6%, специфичность - 86,2%.
4. Сконструированный диагностикум может быть использован для вы явления иммунного ответа организма, свидетельствующего о хеликобактер- ной инфекции, и для скрининговых исследований.
Апробация работы:
Результаты исследования по теме диссертации были представлены на: научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2002-2003гг.;
Международной конференции «Проблемы экологической безопасности», Оболенск, 2000г.;
6-й российско-итальянской конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение и профилактика», Санкт-Петербург, 2000г.; научно-практической конференции «Инфекционные болезни в практике терапевта», Харьков, 2001г.;
Десятой и Тринадцатой Российских гастроэнтерологических неделях, Москва, 2004, 2007 гг. - 3-й Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические ас пекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт- Петербург, 2008г.
План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ 8.09.2008 (протокол №11).
Публикация результатов исследования
По теме диссертации опубликованы 14 работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертаций на
13 соискание искомой ученой степени. Получены патенты РФ на изобретение №2324188 от 10.05.2008 г., №2308949 от 19.06.2006 г.
Структура работы
Диссертация изложена на 156 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 332 библиографических источника, из которых 95 - отечественных, 237 - иностранных. Работа проиллюстрирована 25 таблицами и 17 рисунками.
Факторы вирулентности и патогенности Н. pylori
Бактерия, впоследствии получившая название Helicobacter pylori, была впервые выделена из биоптата слизистой оболочки желудка больного с ан-тральным гастритом более 25 лет назад Б. Маршаллом и Д. Уорреном (Warren J.R. et al., 1983). Она первоначально была классифицирована как Campylobacter pylori (С. pylori), но дальнейшее исследование ультраструктуры бактерий С. pylori показало значительные отличия их от рода Campylobacter по ряду параметров, поэтому был образован новый род, получивший название Helicobacter.
Бактерии рода Helicobacter колонизируют желудочно-кишечный тракт человека и животных и ассоциированы с его хроническими заболеваниями (Lee A., et al.,1992; Stanley J. et al.,1993; Fox J.G. et al., 1996; Dubois A., et al., 1998; Patterson M.M. et al., 2000; Fox J.G., 2002). К 2001 г. было известно 23 вида микроорганизмов рода Helicobacter: (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 2001). В настоящее время описано 24 вида хеликобактеров, и около 35 новых представителей рода ждут формального наименования (Fox J.G., 2002). Желудочно-кишечный тракт человека колонизирует вид Helicobacter pylori (Lambert М.А. et al., 1987; Lau P.P. et al., 1987; Thomson L.M. et al., 1988; Goodwin C.S. et al., 1989, 1990; Fox J.G., 2002). Полные последовательности генома определены у четырех штаммов (J99, 26695, HPAG, J27) Я pylori (Tomb J.F. et al., 1997; Aim R.A. et al., 1999, Oh J.D. et al., 2006; Baltrus D.A. et al., 2009). H pylori - это мелкие, изогнутые, S-образные или слегка спиралевидной формы, подвижные, грамотрицательные, неспорообразующие, микроаэ-рофильные бактерии. Толщина бактерии 0,5-1,0 мкм, длина 2-4 мкм, концы бактерии закруглены. Движение клеток осуществляется за счет многочисленных униполярных жгутиков, расположенных на одном или на обоих по 15 люсах клеток, а также латерально и имеющих на концах вздутия (Warren J.R. etal., 1983).
Необходимыми условиями для жизни, роста и размножения микроорганизма считаются: температура +37С и рН среды 5,5-8,0, причем оптимальный рост происходит при нейтральном рН (Scott D.R. et al., 2002; Stingl К. et al, 2002). Для выделения и культивирования хеликобактерий в исследовательской практике используют агар Мюллер-Хинтона, Колумбийский агар, основу №2 кровяного агара, Бруцелла-агар и другие импортные среды, к которым добавляют 5-7% дефибринированной крови, растворимый крахмал, сыворотки, активированный уголь и вещества, инактивирующие или адсорбирующие токсические факторы среды (Тапеега J. et al., 2002). Для создания селективных условий при выделении культуры используются антибактериальные и противогрибковые препараты (Skirrow М.В. 1977; Dent J.C. et al., 1988). В нашей стране также предложены среды для выделения и культивирования хеликобактерий (Сафонова Н.В. с соавт., 1995; Шелохович А.И. с соавт., 1999). Культивирование на этих средах осуществляется в микроаэро-фильных условиях (5% кислорода, 10% углекислого газа и 85% азота).
При длительном культивировании и (или) при неблагоприятных воздействиях факторов внешней среды (изменение температуры, рН, неправильное применение антибиотиков) бактерии H.pylori утрачивают типичную спиралевидную форму и переходят в кокковую форму (Donelli G. et al., 1998; Worku M.L. et al., 1999). При этом бактериальные клетки теряют ферментативную активность, репродуктивную способность, у них редуцируется обмен веществ, что создает благоприятные условия для их сохранения в кишечнике и во внешней среде, откуда они могут передаваться человеку фекально-оральным путём. Попав в желудок, Н. pylori вновь трансформируется в спиралевидные активные формы, способные колонизировать СОЖ. Кокковые формы нечувствительны к действию антибиотиков (Bjorkholm В. et al., 2000). Наличие кокковидных форм Н. pylori может привести к ошибкам в диагностике Н. /ту/оп-инфекции, поскольку эти формы не культивируются, не имеют характерных признаков при световой микроскопии, не продуцируют уреазу или продуцируют ее в малых количествах (Бардахчьян Э.А. с соавт., 2003; Bode G. et al., 1993; Cellini L. et al., 1994; Kusters J.G. et al, 1997; Enroth H. et al., 1999).
Распространенность Н. pylori демонстрирует значительную географическую вариабельность. В ряде развивающихся стран более 80% населения являются Н. #у/е п-позитивными даже в молодом возрасте (Vincent Р., 1993; Perez-Perez G.I. et al., 2004). В этих странах распространенность Н. pylori в различных возрастных группах оказывается неодинаковой: она быстро увеличивается к пятилетнему возрасту и остается высокой в дальнейшем, показывая, что инфицирование происходит в раннем детстве (Fiedorek S.C. et al., 1991).
В развитых странах распространенность Н. pylori обычно не превышает 40% и является значительно более низкой среди детей и подростков, чем среди людей старшего возраста (Щербаков П.Л., 1999; Pounder R.E. et al., 1995; Pretolani S. etal., 1997).
В пределах географичеких областей распространенность Н. pylori демонстрирует обратную корреляцию с социоэкономическим статусом, в частности, с условиями жизни в детском возрасте (Malaty Н.М. et al., 1994).
В западных странах распространенность этой бактерии часто значительно выше среди первого-второго поколений иммигрантов из развивающихся стран (Perez-Perez G.I. et al., 2005; Tsai CJ. et al., 2005).
В то время как распространенность H. /ту/оп -инфекции в развивающихся странах остается относительно постоянной, она быстро уменьшается в развитых странах (Genta R.M., 2002). Последнее обстоятельство объясняется меньшими шансами инфицирования в детстве в связи с хорошими санитарно-гигиеническими условиями и активным устранением носительства с помощью антимикробной терапии. Инфицированность взрослого населения России, по результатам выборочных исследований, колеблется от 50 до 80%, а в некоторых регионах она приближается к 100% (Пархоменко Л.К. с соавт., 1996; Григорьев П.Я. с со-авт., 1999). Особо подчеркивается высокая степень инфицированности жителей мегаполисов, подвергающихся постоянной антропогенной нагрузке (Климанская Е.В. с соавт., 1997).
На развитие Н. /ту/оп-ассоциированной патологии как у детей, так и у взрослых влияют наследственная предрасположенность, сопутствующие заболевания, социально-экономические условия, неблагоприятные факторы внешней среды (Корсунский А.А., 1999).
Мониторинг уровней антибиотикорезистентности региональных штаммов к pylori
Проблема хеликобактериоза является одной из тех проблем, в процессе решения которой демонстрируются преимущества подхода, основанного на принципах доказательной медицины (ДМ) (Флетчер Р. с соавт., 1998; Моисеев С.А., 2000; Власов В.В., 2001; Даис А.Л. с соавт., 2001; Вялков А.И., Воробьев П.А., 2002; Передерни В.Г. с соавт., 2004; Godwin М. et al., 2001).
В области гастроэнтерологии одним из первых рекомендательных документов, соответствующих критериям ДМ, стало Маастрихтское соглашение (2000г.) по диагностике и лечению заболеваний, связанных с инфекцией Я pylori (Malfertheiner P. et al., 2002). В настоящее время действующими являются рекомендации 2005г., «Маастрихт-3» (Malfertheiner P. et al., 2005). В этих рекомендациях предложены соответствующие схемы антихеликобак-терной терапии «первой линии» (ингибитор протонной помпы (Р11Ш), кла-ритромицин и амоксициллин (или метронидазол)), с рекомендацией использовать кларитромицин в тех регионах, где первичная резистентность к нему не превышает 15-20% и использовать метронидазол вместо амоксициллина в тех регионах, где первичная.резистентность к нему не превышает 40%; и «второй линии» - четырехкомпонентная схема, включающая препарат висмута, РШП, тетрациклин и метронидазол; если по какой-либо причине невозможно применение висмутсодержащей схемы, то в качестве альтернативной терапии «второй линии» может быть использована комбинация, включающая РШП, амоксициллин или тетрациклин и метронидазол.
В Маастрихтских рекомендациях подчеркивается, что при отсутствии эффективности повторного курса лечения необходимо определить чувствительность штамма Н. pylori ко всему спектру используемых антибиотиков. В связи с этим бактериологическое исследование приобретает ключевое значение для успеха эрадикационной терапии у конкретного пациента. Вместе с тем, изучение распространенности штаммов Я pylori, устойчивых к определенным антибиотикам, является тем общим фактором, кото 54 рый позволяет достаточно точно прогнозировать результат терапии у данной популяции (Tytgat G.N.J, et al., 1998). Предполагаемая эффективность той или иной схемы лечения должна быть обоснована результатами исследований, которые проводятся в регионе при изучении чувствительности и определения уровня первичной резистентности штаммов Н. pylori к антибиотикам. Перед выбором схемы эрадикации первой линии во всех случаях целесообразно расспрашивать больных о проводимом ранее лечении метронида-золом или кларитромицином по поводу других заболеваний и избегать назначения препаратов, которые уже применялись ранее (Баранская Е.К., 2000). Таким образом, динамические наблюдения за уровнями антибиотико-резистентности Н. pylori создают основу для создания и изменения рекомендаций по лечению заболеваний, ассоциированных с Н. pylori, а также дают возможность предпринять адекватные меры для предотвращения роста уровней антибиотикорезистентности (Кудрявцева Л.В. с соавт., 2004). В настоящей работе определение уровней резистентности штаммов Н. pylori, циркулирующих в Ростовской области, к антибактериальным препаратам (АБП) осуществлялось в период с 2000 г. по 2009 г. В течение этого времени были исследованы 131 штамм, выделенные из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки больных с заболеваниями пищеварительного тракта. Штаммы, выделенные от больных в 2000 г. (31 штамм), были протестированы на чувствительность к амоксициллину (АХС), ампициллину (AMP), кларитромицину (CLR), тетрациклину (TCY), метронидазолу (MTR) и фуразолидону (FRZ). Результаты исследований за 2000 г. представлены в таблице 2. Из 31 выделенного штамма двадцать (65%) были чувствительными ко всем использованным антибактериальным препаратам. Полирезистентные штаммы в 2000 г. зарегистрированы не были - каждый из оставшихся одиннадцати штаммов проявлял резистентность только к одному АБП. В серии экспериментов 2002-2003 гг. к указанным АБП были добавлены препараты, не применяемые для терапии первой и второй линии, но используемые в качестве резервных: азитромицин (AZM), ципрофлоксацин (CIP), рокситромицин (RXT), эритромицин (ERY). Результаты исследований представлены в таблице 3. Всего было выделено 29 штаммов. В отношении амоксициллина 28 (97%) из них оказались чувствительными, 1 (3%) - резистентым. Резистентность к ампициллину была проверена на 28 штаммах, из них резистентными оказались 9 штаммов (32%). Чувствительность к ципрофлоксацину проверяли на 15 штаммах, 3 из них (20%) оказались резистентными к этому АБП.
Иммобилизация антигенного хеликобактерного комплекса на полимерном носителе
Реакция агломерации объемной является одним из видов реакции агглютинации, в которой в качестве носителя антигена или антитела используются синтетические полимерные латексные частицы. Эта реакция применяется с целью: 1) обнаружения антител в сыворотке крови обследуемых лиц; 2) идентификации возбудителя заболевания. Оценка выраженности агглютинации частиц латекса, сенсибилизированных антигенами или антителами против определяемого антитела или антигена, соответственно, осуществляется визуально.
При конструировании диагностикума растворимые мелкодисперсные антигены бактериальной клетки белковой природы адсорбируют на поверхности окрашенных частиц инертного монодисперсного латекса. Наличие альдегидных групп на поверхности латексных частиц позволяет легко образовывать ковалентную связь с аминогруппами белков. Такие нагруженные бактериальным антигеном латексные частицы склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, что приводит к образованию характерного агломерата с неровными краями ("зонтика").
Одна из задач настоящего исследования заключалась в разработке технологии получения латексного (полиакролеинового) антигенного хеликобак-терного диагностикума и оценке его диагностических свойств. При ее решении были отработаны оптимальные условия получения хеликобактерного антигенного растворимого комплекса, условия сенсибилизации носителя антигеном, определены операционные аналитические характеристики полученного диагностикума — аналитическая чувствительность и аналитическая специфичность, а также режимы его лиофилизации.
В работе в качестве носителя сенситина использовали сферические полимерные частицы диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп. Носитель был получен методом анионной полимеризации акролеина в водно-щелочной среде в соответствии с Регламентом производства № 978-00 от 20.06.2000 (Наркевич А.Н. с соавт., 2000). Окрашивание частиц производили добавлением красителя в полимеризационную смесь в процессе синтеза. Носитель для своей сенсибилизации не требовал применения дополнительных «сшивающих» агентов - сенсибилизация осуществлялась без предварительного химического активирования носителя по его реакционно-способным альдегидным группам:
Для конструирования хеликобактерного антигенного диагностикума нами было использовано несколько серий полимерного носителя: серия 4 от 12.03.99 г., серия 6 от 7.06.99 г., серия 11 от 23.03.04 г., серия 14 от 20.12.04 г.
Используемые носители гидрофильны, имеют достаточную скорость седиментации, не имеют сродства к материалу планшетов для постановки серологических реакций, образуют устойчивые взвеси в солевых растворах различной ионной силы и рН как в присутствии стабилизаторов, так и без них. В планшетах для серологических реакций в стандартных разводящих растворах они скатываются на дно лунки и в течение 1,0 - 1,5 часа образуют классические «пуговки» - точки.
Диагностикумы, полученные на носителях указанных серий, демонстрировали при постановке РАО микрометодом картину завершенной серологической реакции с четким переходом от положительного результата к отрицательному, были стабильными и использовались в дальнейших исследованиях.
Для получения бактериальной массы исходную культуру референтного штамма К pylori высевали на питательную среду СЭХ (рН 7,6-7,8) и помещали в микроаэрофильные условия (5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное количество составляет азот) при 37С на 3-5 суток. На засеянных чашках наблюдали рост культуры Н. pylori в виде мелких прозрачных блестящих колоний диаметром 1-3 мм. Чистоту выросших посевов контролировали, окрашивая по Граму (под микроскопом при наличии чистой культуры обнаруживались грамотрицательные изогнутые палочки).
Бактериальную массу смывали с каждой чашки 2,5 мл физиологического раствора с помощью пипетки, переносили в стерильные флаконы и обезвреживали кипячением на водяной бане в течение 10 мин.
Бактериальную массу Н. pylori проверяли на специфическую стерильность и при отсутствии роста применяли для приготовления клеточного ли-зата, который использовали в качестве сенситина для диагностикума.
В серии экспериментов нами была произведена оценка двух способов получения растворимого антигенного комплекса: воздействием на бактериальную массу 1%-ным раствором дезоксихолата (ДОХ) натрия и комбинированной обработкой бактериальной массы ультразвуком и раствором дезоксихолата натрия (УЗ-ДОХ). Отработку оптимальных параметров разрушения бактериальной клетки и максимального выхода иммуногенных белков оценивали по концентрации белка в клеточном лизате. Полученные супернатан-ты обозначали - ДОХ-лизат и УЗ-ДОХ-лизат.
Предварительная оценка эффективности диагностикума для различных точек разделения
Тесты, обеспечивающие четкое разграничение больных и здоровых (наличие признака и его отсутствие), имеют характеристическую кривую, вытянутую в сторону левого верхнего угла графика «чувствительность - специфичность». Для них повышение чувствительности (снижение точки разделения) практически не сопровождается убыванием специфичности вплоть до достижения очень высокого уровня чувствительности. Характеристическая кривая, являясь наиболее полным методом описания эффективности диагностического теста, показывает, насколько сложен компромисс между чувствительностью и специфичностью теста. С помощью этой кривой можно определить оптимальное значение точки разделения. В принципе, точка разделения должна находиться вблизи «плеча» кривой (Флетчер Р. с соавт., 1998). Анализ графика, представленного на рисунке 16, показывает, что в области «плеча» характеристической кривой для антигенного диагностикума находятся две точки разделения: 1:320 и 1:160. Для первой из них чувствительность теста составляет 80,5%, то есть около 20% больных не будут обнаружены диагностикумом. Специфичность теста в этом случае составляет 84,6%, то есть примерно в 15% случаев будет получен ложноположительный результат. Для точки разделения 1:160 чувствительность диагностикума составляет 90,9%, то есть, примерно, в 10% случаев диагностикум дает ложно-отрицательный результат. Специфичность диагностикума при этом составляет 80,5%), то есть примерно в 20% случаев результат является ложноположи-тельным.
Следует отметить, что для точки разделения 1:160 ложноположительный результат в РАО наблюдался в 14 случаях, причем среднегеометрический титр в РАО для указанных случаев составил 1:320, то есть отличался от предложенного в качестве точки разделения всего на одно разведение, что может соответствовать допустимой ошибке метода.
Все ложноположительные результаты были проверены в реакции торможения специфической активности. В реакции торможения наблюдалось специфическое укорочение ряда в 8 из указанных 14 случаев. Этот факт говорит о том, что в большей своей части результаты, которые методом РАО оцениваются как положительные при отрицательном результате ИФА-метода, и в самом деле являются положительными. Использовавшаяся в предварительной серии экспериментов тест-система «ХеликоБест-антитела» имеет широкое применение в лабораторной практике, однако она способна выявлять антитела только к cagA-позитивным штаммам и принципиально не может выявлять антитела к cagA-негативным штаммам Н. pylori. Частичное несовпадение результатов тестирования сывороток крови в предварительной серии экспериментов этой тест-системой и РАО-диагностикумом могло быть обусловлено именно этим обстоятельством, особенно, если учесть, что около 18% штаммов, циркулирующих в ростовском регионе, по нашим данным, являются cagA-негативными.
В связи с этим на следующем этапе оценки эффективности сконструированного антигенного полимерного хеликобактерного РАО-диагностикума в качестве референтных нами были взяты результаты, полученные при одновременном тестировании образцов сывороток крови с помощью тест систем ИФА: «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgA» и «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgG», определяющих, соответственно, иммуноглобулины А и G к суммарным антигенам Н. pylori, и «ХеликоБест-антитела», способной определять специфические иммуноглобулины к антигену CagA Н. pylori. Такой подход позволил включить в группу сравнения и пациентов, инфицированных cagA-негативными штаммами.
Материалом для исследования явились сыворотки крови 82 человек, обратившихся за медицинской помощью к врачу-гастроэнтерологу (таблица 20).
Поскольку тест-системы «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgA» и «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgG» определяют антитела разных классов; результат метода сравнения считался положительным, если положительными были одновременно результаты теста «ХеликоБест-антитела» и, по крайней мере, одного из указанных тестов «ЭКОлаб» (34 случая). Отрицательным результат метода сравнения считался при одновременных отрицательных результатах всех трех референтных тестов (29 случаев).
Обращают на себя внимание пять исследуемых проб (№№ 27, 33, 44, 50, 80), в которых результат тестирования системой «ХеликоБест-антитела» был отрицательным, тогда как результаты и «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgA» и «ЭКОлаб-Хеликобактер-10»-тестов были положительными. Поскольку анализируемый РАО-диагностикум при этом также давал положительный результат, нами в этих случаях была поставлена реакция торможения, которая показала специфическое укорочение ряда на 3-4 лунки. Это позволило считать результаты референтного метода положительными и включить указанные пять случаев в группу сравнения. Таким образом, всего оказалось возможным провести сравнение для 68 образцов сывороток крови, для которых результаты реферетного метода были однозначными. Остальные 14 случаев были исключены из рассмотрения.
Поскольку результаты предварительного анализа диагностических возможностей РАО-диагностикума показали, что вблизи "плеча" характеристической кривой находятся точки разделения 1:160 и 1:320, в данной серии экспериментов характеристики диагностикума (чувствительность и специфичность) рассчитывались именно для этих двух точек разделения. Таблица сопряженности для точки разделения 1:160 представлена ниже (таблица 21).
