Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 11
1.1 Результаты микробиологического мониторинга нозокомиальной синегнойной инфекции. 11
1.2 Основные биологические свойства P. aeruginosa. 16
1.3 Отношение к антибактериальным препаратам планктонных и сесильных форм P. aeruginosa. 22
1.4 Влияние озона на бактериальные клетки. 28
ГЛАВА II Материалы и методы исследования 32
2.1 Объекты исследования. 32
2.2 Методы исследования. 33
2.3 Изучение взаимного влияния микробных культур . 3 8
2.4 Изучение влияние абиотических факторов. 40
2.5 Методы статистической обработки. 42
ГЛАВА III Анализ распространенности и биологических особенностей нозокомиальных штаммов P. Aeruginosa 43
3.1 Многолетняя динамика инфицированности пациентов ЛПУ
P. aeruginosa. 43
3.2 Динамика уровня обсемененности различного клинического материала. 45
3.3 Основные биологические особенности изученных штаммов P. aeruginosa . 47
3.3.1 Изучение морфо-функциональных характеристик. 47
3.3.2 Спектры антибиотикочувствительности штаммов, изолированных
в отделениях разного профиля. 58
3.3.3 Изучение сочетания свойств у выделенных штаммов. 62
ГЛАВА IV Пленкообразующая способность штаммов p. aeruginosa как возможная мишень и средство оценки воздействия различных факторов 68
4.1 Изучение взаимного влияния микробных культур. 68
4.2 Сравнение эффективности действия антибиотиков на структурированные и планктонные формы бактерий. 73
4.3 Изменение численности, пленкообразующей активности и чувствительности к антибиотикам штаммов P. aeruginosa под влиянием озона . 80
4.3.1 Выбор времени экспозиции. 81
4.3.2 Выбор концентрации озонированного физиологического раствора. 85
4.3.3 Изменение чувствительности к антибиотикам под влиянием ОФР. 89
Заключение 97
Выводы 106
Список литературы
- Отношение к антибактериальным препаратам планктонных и сесильных форм P. aeruginosa.
- Изучение взаимного влияния микробных культур
- Основные биологические особенности изученных штаммов P. aeruginosa
- Изменение численности, пленкообразующей активности и чувствительности к антибиотикам штаммов P. aeruginosa под влиянием озона
Введение к работе
Актуальность проблемы. Pseudomonas aeruginosa (синегнойная
палочка) распространена повсеместно, чему способствует высокая
устойчивость этих бактерий к неблагоприятным условиям внешней среды,
выраженная антагонистическая активность и резистентность к широкому
спектру природных биологически активных веществ и антимикробных
средств, применяемых в медицинской практике [Veesenmeyer, 2009;
Пруцаков, 2011]. Для человека синегнойная палочка считается условно
патогенной, так как далеко не во всех случаях при ее попадании в организм
развивается заболевание. Вероятность инфекции значительно повышается
при большом количестве возбудителя, попавшего в организм, а также в
случае иммунодепрессии или иммунодефицита у ослабленных, истощенных
людей, на фоне влияния стрессовых факторов, сопровождающих травмы,
ожоги, различные хирургические вмешательства и тяжелую соматическую
патологию. С учетом этих двух составляющих, а также высокой
резистентности P. aeruginosae к противомикробным препаратам, заражение
человека чаще всего может произойти во время пребывания именно в
лечебном учреждении. Во всем мире прослеживается тенденция к
увеличению удельного веса заболеваний, вызванных синегнойной палочкой,
в общей структуре внутригоспитальных гнойно-септических инфекций
[Mesaros, 2007; Голубкова, 2011; Свистунов, 2011]. Устойчивость
P. aeruginosae во внешней среде, непритязательность к условиям питания,
наличие мощных факторов вирулентности, природная резистентность к
соединениям с антибиотической активностью определяют широту ее
распространения и формирования госпитальных штаммов, что зачастую
превращает стационар в «эпидемический очаг» синегнойной инфекции
[Азолов, 1999; Komolafe, 2003; Шагинян, 2005; Покровский, 2006;
Туркутюков, 2006; Коршунова, 2007; Nemec, 2010]. Инфекционные
осложнения, возникающие у госпитализированных больных, отягощают
течение основного заболевания, увеличивают длительность стационарного
5 лечения и повышают число неблагоприятных исходов [Руднов, 2002; Азолов,
2004; Сидоренко, 2005]. Широкое распространение (до 75%) атипичных
форм возбудителя затрудняет постановку диагноза, препятствует
своевременному проведению лечебных и противоэпидемических
мероприятий [Мороз, 1988; Зубков, 2003; Пыж, 2011]. Все это обусловливает
необходимость поиска информативных методов диагностики синегнойной
инфекции с вычленением тестов, способствующих дифференциации
госпитальных и внебольничных штаммов.
Нерешенность проблемы борьбы с госпитальной синегнойной
инфекцией с помощью химиотерапевтических препаратов побуждает
проводить поиск дополнительных методов и средств, повышающих ее
эффективность. В последние годы разрабатываются и внедряются новые
технологии, способные, с одной стороны, подавлять вирулентность
госпитальной микрофлоры, с другой - нивелировать ее устойчивость к
антибиотикам. В этом плане возрастает интерес к озонотерапии. Обладая
высоким окислительным потенциалом, озон проявляет бактерицидные
свойства. Однако сведения о влиянии небактерицидных концентраций озона
в физиологическом растворе, применяемых для парентеральной
озонотерапии инфекционных осложнений, на патогенные свойства
P. aeruginosae, в том числе на ее пленкообразующую активность и
антибиотикочувствительность, весьма немногочисленны. Вместе с тем
технология системного использования озона, концентрация которого в
физиологическом растворе не превышает 10 мг/л, существенно расширяет
спектр его лечебных возможностей, в частности, при инфекционных
осложнениях, за счет оптимизации нарушенного кислородного гомеостаза
организма больного [Rischbieter, 2000; Белых, 2004; Кувакина, 2006; Фисталь,
2006; Бокерия, 2007; Верхулецкий, 2007; Стручков, 2007; Уметалиев, 2007;
Винник, 2008; Водякова, 2009; Дмитриева, 2009; Burgassi, 2009].
6 Цель исследования - изучение фенотипических особенностей
нозокомиальных штаммов, как основы для оптимизации
микробиологической диагностики и способов воздействия на P. aeruginosa.
Основные задачи исследования:
На основании ретроспективного анализа (5 лет) установить частоту встречаемости P. aeruginosa в стационарах различного профиля.
Изучить основные биологические свойства P. aeruginosa, определяющие патогенный потенциал изолируемых штаммов.
Определить наиболее распространенные фенотипы антибиотикорезистентности в сочетании с экспресируемыми факторами патогенности изолятов P. aeruginosa.
Разработать и усовершенствовать дифференцирующие тесты, позволяющие с большей эффективностью определять природу штаммов P. aeruginosa, изолируемых в ЛПУ.
Оценить влияние абиотических и микробных факторов на уровень пленкообразующей активности штаммов P. aeruginosa в условиях эксперимента.
Научная новизна. Впервые охарактеризована динамика распространенности P. aeruginosa и инфицированности пациентов ЛПУ г.Перми в 2006-2010 гг. Определены типичные фенотипы P. aeruginosa с учетом спектров их антибиотикочувствительности. Предложен и экспериментально обоснован набор биологических характеристик, способствующих дифференцировке госпитальных и внебольничных эковаров P. aeruginosa. В условиях эксперимента впервые показана неоднозначность действия озонированного физиологического раствора с различным содержанием озона на планктонные и сесильные формы синегнойной палочки, его способность потенцировать бактерицидный эффект антибиотиков различных классов. Подтверждена высокая антагонистическая активность нозокомиальных культур P. aeruginosa и предложен способ оценки характера их взаимоотношений при формировании бипленок с
7 наиболее часто встречающимися ассоциантами (приоритетная справка
№ 2010127885 от 06.07.2010).
Теоретическая и практическая значимость работы. Определение основных фенотипов в комплексе с антибиотикорезистентностью штаммов P. aeruginosa, циркулирующих в стационарах различного профиля, будет способствовать оптимизации в них эмпирической антибиотикотерапии и проведению противоэпидемических мероприятий, как в конкретном отделении, так и в ЛІТУ в целом. Выявленные биологические особенности, в том числе способность к пленкообразованию изолируемых штаммов, предложенные оригинальные и модифицированные диагностические тесты (рацпредложение № 2549 от 07.06.2011 г.) позволят рационализировать методические подходы к оценке антибиотикочувствительности и принадлежности изолятов к госпитальным либо внебольничным эковарам. Установленные эффекты озонированного физиологического раствора на планктонные и структурированные в биопленки формы P.aeruginosa (патент на изобретение №2425888 от 22.08.2011 г. «Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора»), а также его сочетаний с антибиотиками различных классов демонстрируют целесообразность использования озона в комплексной терапии внутрибольничной синегнойной инфекции с учетом индивидуальных особенностей изолируемых штаммов.
Положения, выносимые на защиту:
В многолетней динамике (2006-2010 гг.) наблюдается тенденция к росту инфицированности пациентов стационаров различного профиля представителями P. aeruginosa, среди которых доминируют штаммы, полирезистентные к регламентированному набору антисинегнойных препаратов.
Проявление биологических свойств штаммами P.aeruginosa, изолируемыми в различных стационарах, в значительной степени варьирует. Преимуществом при колонизации любых экологических ниш с
8 последующим закреплением и распространением в стационаре обладают
изоляты, отличающиеся высокой пленкообразующей способностью,
антибиотикорезистентностью, антагонистической активностью и широким
набором факторов вирулентности.
3. Пленкообразующая способность P.aeruginosa в контексте
нозокомиальной синегнойной инфекции может рассматриваться как возможная мишень и средство оценки эффективности мер воздействия различных факторов на нозокомиальные штаммы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: краевой конференции «Проблема синегнойной инфекции в реанимационных отделениях ЛПУ» (Пермь, 2009), VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), V Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), научной сессии ПГМА (Пермь, 2010), XIII Международном конгрессе по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID (Москва, 2011), 4th Congress of European Microbiologists FEMS (Geneva, Switzerland, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Внедрение в практику. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами, врачами-интернами на кафедрах микробиологии и вирусологии, общей хирургии Пермской государственной медицинской академии, а также в клинической практике ГКБ №4.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с общим планом НИР ГБОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, номер государственной регистрации 01.2.00709668.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы,
Отношение к антибактериальным препаратам планктонных и сесильных форм P. aeruginosa.
В целом, частота развития синегнойной инфекции во многом определяется нозологической структурой пациентов, тяжестью их исходного состояния," распространенностью инвазивных процедур. [Руднов, 2002]. Поэтому P. aeruginosa — основной возбудитель нозокомиальных пневмоний, приобретенных в ОРИТ (25-41 %), внутрибольничных инфекций мочевыводящих путей (25-31 %), один из основных возбудителей групповых вспышек ВБИ в родовспомогательных учреждениях [Эйделыдтейн, 2005; Bertrand, 2001; Kohlenberg, 2010].
. Оценивая этиологическую структуру нозокомиальных инфекций в г. Владивостоке, В.Б. Туркутюков и соавторы отметили, что P. aeruginosa, вызывая треть всех внутрибольничных пневмоний в ОРИТ, занимала также главенствующее место (31% среди остальных выделенных штаммов) в этиологии данной инфекции и у пациентов с черепно-мозговыми травмами. [Туркутюков, 2006]. Данному " микроорганизму также принадлежит лидирующее место (25,9 %) среди возбудителей, наиболее часто вызывающих пневмонии у недоношенных новорожденных в условиях отделения реанимации [Кузнецова, 2006; Кафарская, 2010; Клименко, 2010].
Доля P. aeruginosa в структуре возбудителей нозокомиальных инфекций наиболее значительна в отделениях неонатологии, трансплантологии и ожоговых отделениях — 38-41 % от числа всех нозокомиальных инфекций, несколько ниже в отделениях урологии - 22,2-23,3 %, и редко выделяется в терапевтических отделениях (6,2 -12,5 %,) [Андреева, 2007].
При изучении штаммов уропатогенов, выделенных от больных, имеющих признаки инфекции мочевыводящих путей в раннем послеоперационном периоде, С.А. Божкова и Е.Г. Афиногенов (2005) установили, что P. aeruginosa являлась возбудителем в 10% случаев. По результатам исследования этиологической структуры инфекций мочевыводящих путей, проведенного в 2004 г. в ЛПУ опорных баз Центра мониторинга резистентности клинически значимых микроорганизмов Республики Беларусь, P. aeruginosa также была отнесена к основным возбудителям (11,8 %) [Ермакова, 2005].
В 2005 году в родовспомогательных учреждениях Российской Федерации зарегистрировано 9229 случаев ВБИ (2004 г. - 11303 случая), показатель на 1000 пациентов - 3,2 (2004 г. - 3,8) [Коршунова, 2007]. Частота выделения P. aeruginosa в Харьковском городском родильном доме с неонатологическим стационаром в , 2003-2008 годах снизилась среди недоношенных с 7,5 до 5,3 %, среди доношенных — с 5,5 до 3,3 % [Клименко, 2010]. При анализе микробного пейзажа бронхиального секрета пациентов Республиканского центра муковисцидоза Удмуртской Республики выявлено преобладание P. aeruginosa, хроническое инфицирование респираторного тракта которой диагностировано у 39,3% больных [Симанова, 2010] .
Анализ этиологической значимости инфекционных агентов при бактериемии и сепсисе за 2000-2004 гг. у тяжелобольных Российского ожогового центра (г. Нижний Новгород) показал, что одно из лидирующих мест принадлежит P. aeruginosa, выделенной в 12,5% случаев [Кувакина, 2006]. В 2004 г. среди наиболее часто обнаруживаемых микроорганизмов, выделенных в лаборатории микробиологии ГУН ЦИТО из образцов материала от травматолого-ортопедических больных, присутствует и P. aeruginosa (8,3%) [Пхакадзе, 2005]. В последние десятилетия появились дополнительные факторы, способствующие росту заболеваемости ВБИ. К ним относятся: значительный рост, антибиотикорезистентных -госпитальных штаммов, обладающих устойчивостью к воздействию антибиотиков последнего поколения; сложность проведения дезинфекции и стерилизации дорогостоящей медицинской аппаратуры (в том числе эндоскопической техники); ухудшение социально-экономического положения населения страны, косвенно негативно влияющее на качество оказываемой медицинской помощи [Брусина, 2008].
Широкий спектр механизмов устойчивости P. aeruginosa обусловливает высокий уровень резистентности этого возбудителя к антимикробным препаратам. По результатам многоцентрового международного исследования SENTRY среди 11 968 клинических штаммов, выделенных в 1997-1998 гг., резистентность к цефепиму составлялала 10 %. Несколько реже (в 8 % случаев) выявлялась устойчивость к амикацину, для остальных антисинегнойных препаратов частота приобретенной резистентности была либо одинаковой с цефепимом (меропенем - 10 %), либо более высокой (пиперациллин/тазобактам - 15 %, цефтазидим - 18 %, фторхинолоны - 22-24 %) [Gales, 2000]. Изучение клинических изолятов, выделенных в рамках программы исследования по контролю над резистентностью в США, показали, что за период с 2001 по 2003 год уровнь чувствительности к гентамицину уменьшился на 3,2% (с 75,5 % до 72,3 %) к имипенему - на 5,6 % (с 84,4 % до 78,8 %). Уровень множественной лекарственной устойчивости увеличился с 7,2 % в 2001 году до 9,9 % в 2003 [Karlowsky, 2004].
В России уровень устойчивости P. aeruginosa к цефепиму составил 13,5%, несколько более высокая резистентность была характерна для имипенема, а частота выявления штаммов, устойчивых к ципрофлоксацину, оказалась существенно выше [Страчунский, 2003]. По данным многоцентровых исследований «РЕЗОРТ» и «Металл», в период с 2002 по 2007 гг. штаммы P.aeruginosa, продуцирующие металло-Р-лактамазы, выявлены в 23 стационарах 9 городов - [Шевченко, 2007]. По данным многоцентрового исследования по изучению резистентности нозокомиальных штаммов P.aeruginosa, проводимого в рамках программы «РЕЗОРТ»,в 2002-2004 гг. в 31 ЛПУ различных городов РФ, нозокомиальные штаммы P.aeruginosa характеризовались высокой частотой резистентности ко всем антимикробным; препаратам (от 39 0%. до 74,7%); за исключением полимиксина [Решедько, 2006].
Изучение трехлетней динамики чувствительности к антибиотикам клинических штаммов P. aeruginosa, выделенных в г. Караганда (Республика Казахстан) в период с 2003 по 2005 гг., выявило нарастание доли устойчивых изолятов с одновременным увеличением уровня резистентности. Так, если в 2003году доля штаммов; устойчивых.к.цефтазидиму, составляла 21,4%, то в 2004;году цефтазидимустойчивые штаммы былшвыделеньБВ;25%,.а в 2005 — в 29,4% случаев; При; этом 10% штаммов;являлось продуцентами металло-бетта-лактамаз, что расценивалось как неблагополучный, эпидемиолого--прогностический признак. Отмечался- также: рост уровня? устойчивости к антимикробным препаратам других групп в 2003-2005 гг. [Азизов; 2006];
По результатам многоцентрового ретроспективного эпидемиологического исследования, проведенного в. 9 ОРИТ стационаров: г. Минска, госпитальные штаммы. Р: aeruginosa демонстрировали высокие уровни резистентности к наиболее распространенным антибактериальным препаратам: к меропенему (64,6%),. амикацину (43,2%), цефепиму (78,7%), цефтазидиму (48,1%), цефтриаксону (75,6%), цефотаксиму (88,9%), ципрофлоксацину (72,6%), левофлоксацину (77,6%), имипенема 30,1% [Илюкеви, 2009];
Изучение взаимного влияния микробных культур
В связи с тем, что взаимное влияние микроорганизмов может в значительной степени влиять на их способность к пленкообразованию, нами. была разработана и апробирована оригинальная методика, основанная на формировании смешанных биопленок (заявка на«изобретение «Способ оценки характера межмикробных взаимодействий» приоритетная справка
-Ночные бульонные культуры P. aeruginosa и бактериальных тест-штаммов стандартизировали до 0,5 ед. по МФ, культуру С. albicans до 5 ед. по МФ. Готовили разведения 1/100 и вносили в лунки по 100 мкл инокулюма каждого вида в сочетаниях: P. aeruginosa + Е. coli, P. aeruginosa + К. pneumoniae, P. aeruginosa + S. aureus, P. aeruginosa + S. haemolyticus, P. aeruginosa + C. albicans. Контролем служили лунки с бульонной культурой каждого вида (монопленки) и лунки со стерильным LB-бульоном. Закрытые планшеты выдерживали в термостате при 37С в течение 48 часов и определялипоказатели ОП о Затем сравнивали усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур. Если наблюдали аддитивный эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (OITmjX) достоверно не отличался от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОПі+ОП2) — регистрировали нейтральный характер, если показатель ОПтіХ ОПі+ОП2 -синергический характер, если показатель ОП тіх ОПі+ОП2 -антагонистический характер в межмикробном взаимодействии.
Также изучали влияние экзометаболитов тест-штаммов на формирование биопленок P. aeruginosa. Для этого 18-ти часовые тест-культуры бактерий и грибов смывали с агаровой, среды, бактериальную взвесь доводили стерильным стерильным LB-бульоном до 0,5 ед. мутности по МФ, а взвесь с С. albicans - до 5 ед. мутности по МФ. После культивирования в течение 18 часов при Т = 37С культуральную жидкость отделяли фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Для определения показателя пленкообразования в присутствии микррбных метаболитов готовили смесь из 100 мкл суспензии P. aeruginosa и 100 мкл культуральной жидкости тест-культуры. Для оценки изменения степени пленкообразования полученные показатели сравнивали с оптической плотностью раствора генцианвиолета, полученного при изучении монокультур. Дополнительным контролем служили лунки с бульонной культурой микроорганизмов каждого вида.
Изучали действие озонированного физиологического раствора (ОФР) на рост, пленкообразующую способность и антибиотикорезистентность штаммов синегнойной палочки. Также изучали разрушение биопленок, сформированных P. aeruginosae, под влиянием озона. Все эксперименты проводили по оригинальной методике, изложенной в главе 5 (патент на изобретение №2425888 зарегистрировано 22,08,2011 г.). Рис. 2.2 Аппарат для газовой озонотерапии квазар ME 34, Россия.
Для получения озонированного физиологического раствора использовали медицинский озонатор (аппарат для газовой озонотерапии квазар ME 34, Россия) (рис. 2.2) с широким диапазоном регулирования концентрации озонокислородной смеси. Физиологический раствор озонировали путем барботажа до получения необходимой концентрации.
Определение антибиотикоустойчивости проводили методом двукратных серийных разведений на планшетах и диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтона в соответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04, 2004). Использовали диски с антибиотиками (амикацин, гентамицин, имипенем, дорипенем, меропенем, левофлоксацин, цефепим, цефтазидим, ципрофлоксацин производства НИЦФ г. С.-Петербург и норфлоксацин производства БиоМерье, Франция) и микробную взвесь, стандартизованную по мутности. Определение результатов проводили в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам CLSI (ранее NCCLC) США.
Разработана и апробирована модифицированная методика оценки антибиотикочувствительности микроорганизмов с учетом восприимчивости структурированных в биопленку форм (рац. предл. «Способ определения степени антибиотикочувствительности микробных культур» №2549 от 07,06,2011). Модификация основана на сравнительном анализе зоны задержки роста при размещении соименных дисков с антибиотиками на «газонном» посеве культуры через 30 минут (традиционно) и после 10-ти часовой термостатной выдержки.
Для определения минимальной подавляющей концентрации (МІЖ) стандартную микробную взвесь, разведенную в 100 раз, вносили в лунки микропланшета («Медполимер», Россия), содержащие последовательные двукратные разведения антибиотиков. С учетом всех разведений конечная концентрация клеток в каждой лунке соответствовала 5 105 КОЕ/мл. Планшеты инкубировали 18-20 часов при 37С. МІЖ определялась как наименьшая концентрация антибиотика, подавляющая видимый рост микроорганизмов.
Статистическую обработку " данных и графическое изображение результатов проводили с использованием программ Statistica 6,0 и Excel 2003, а также авторского [Шелудько, 2001] пакета прикладных электронных таблиц "Stat2000". Различие показателей оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. Для оценки связи двух признаков рассчитывали величину статистического критерия %2. Достоверность %2 оценивали по уровню значимости р, который в стандартных медицинских статистических исследованиях должен быть менее 0,05. Изучение вариации признака проводили на основании определения общей дисперсии, для сравнения дисперсий двух вариационных рядов использовали критерий Фишера [Шелудько, 2001; Афифи, 1982].
Силу связи признаков измеряли коэффициентом сопряженности (информативности) Пирсона. Для определения наличия и степени зависимости двух количественных признаков использовался коэффициент корреляции R. Оценка степени зависимости: при 0,0 -R 0,30 - зависимости нет; 0,31 R 0,70 - зависимость умеренная; 0,71 R 1,00 -выраженная (при достоверности выборочного R, р 0,05).
Значимость нозокомиальной синегнойной инфекции не вызывает сомнений. В лечебно-профилактических учреждениях различных регионов России и за рубежом регулярно проводится мониторинг распространенности и антибиотикорезистентности возбудителей гнойно-септических инфекций в целом, и P. aeruginosa, как одного из ведущих возбудителей из числа неферментирующих бактерий, в частности. Результаты многоцентровых исследований, касающиеся распространенности и частоты встречаемости синегнойной палочки, зачастую в значительной степени варьируют. В связи с этим представлялось интересным проследить особенности в динамике инфицированности пациентов лечебно-профилактическоих учреждений г. Перми на основе анализа результатов многолетнего микробиологического мониторинга.
Многолетняя динамика инфицированности пациентов ЛПУ P. aeruginosa. Согласно сводным статистическим данным бактериологической службы г. Перми, в 2006-2010 гг. было обследовано 471291 пациентов, из клинического материала которых изолировано 434362 бактериальных и грибковых культур, в том числе 1,62 ±0,038% P. aeruginosa, при среднемноголетнем уровне инфицированности синегнойной палочкой 15,16 ± 0,354 на 1000 обследованных (Табл. 3.1).
Несмотря на то, что в целом результативность бактериологических анализов достоверно снижалась, количество изолированных P. aeruginosa на 1000 обследованных лиц, как и доля синегнойной палочки среди положительных анализов, значимо увеличивались.
Основные биологические особенности изученных штаммов P. aeruginosa
Для сравнения эффективности воздействия антибактериальных препаратов на планктонные и сесильные формы бактерий на первом этапе были предприняты исследования их устойчивости к наиболее активным и широко применяемым при синегнойной инфекции антибиотикам -амикацину и имипенему [Горбунов, 2007]. Методом серийных двукратных разведений были определены МПК данных препаратов для 6 чувствительных культур P. aeruginosa. Далее определяли изменение степени пленкообразования в присутствии разных концентраций антибиотиков, а также разрушение биопленок под влиянием МПК данных препаратов. Для всех взятых штаммов МІЖ как амикацина, так и имипенема составила 4 мкг/мл (кроме P. aeruginosa 8-8, для которого МПК амикацина составила 8 мкг/мл). Несмотря на то, что снижение уровня пленкообразования под воздействием препаратов было достоверным, показатель ОП58о все-таки в 2-3 раза превышал значение контроля (ОП580 LB-бульона-0,065±0,005) (табл. 4.3).
Обработка уже сформированных биопленок растворами антибиотиков тех же концентраций не привела к уменьшению их массивности (табл. 4.4). Разрушение биопленок не было достигнуто и при восьмикратном увеличении концентрации препаратов.
Использование планшетов практически не осуществляется, тем не менее, из-за описанного снижения чувствительности в биопленках, зачастую эффект, наблюдаемый in vitro (методом диффузии в агар с использованием дисков с антибиотиками), не реализуется in vivo. Таким образом,, встает вопрос о практической эффективности регламентированного метода. Нами была предпринята попытка оптимизации данного способа с учетом изменения чувствительности сесильных форм, структурированных в пленку. Бактериальный газон на поверхности плотной питательной среды с определенными допущениями можно рассматривать как целенаправленно сформированную биопленку. При его формировании бактерии синтезируют различные экстрацеллюлярные продукты, своеобразный «матрикс», служащий барьером между бактериями и окружающей средой. Согласно существующим методическим указаниям, при использовании диско-диффузионного метода определения антибиотикочувствительности, диски с антибиотиками раскладывают спустя- 30 мин после нанесения микробной массы, на поверхность питательной, среды. Хотя к этому времени уже происходит адсорбция клеток на питательном субстрате, но процесс пленкообразования, в лучшем случае, лишь инициируется: Поэтому получаемый результат максимально приближен к тому, который характеризует чувствительность к антибактериальным препаратам планктонных форм. Между тем, существование в виде биопленки дает микроорганизмам ряд преимуществ, основным из которых является повышение устойчивости к различным неблагоприятным воздействиям. Чувствительность бактерий, включенных в структуру биопленки, к антибактериальным препаратам может снижаться в 10-1000 раз по сравнению с планктонными формами [Naves, 2008].
В серии специальных экспериментов нами предпринята попытка проследить изменение чувствительности P. aeruginosa к антибактериальным препаратам при их отсроченном «выкладывании» на «газонный» посев. Для исследования были взяты те же антисинегнойные препараты, чувствительность к которым уже была определена ранее, кроме гентамицина, так как подавляющее большинство изолятов были резистентны к этому антибиотику. При этом диски с антибиотиком раскладывали на посевы сразу и через 30 минут, выдерживая1 чашки при комнатной температуре. Далее, через каждый час в течение 5 часов, а также через 10 часов, выдерживая засеянные чашки в термостате, т.е., фактически, на разных этапах формирования газона-биопленки.
При последовательном нанесении дисков формирование газона сопровождалось постепенным уменьшением диаметра зоны задержки роста вокруг него, зависящее от времени внесения антибиотика (табл. 4.5). Это может объясняться значительным снижением способности антибиотика к проникновению в питательную среду с увеличением массивности биопленки, которая формирует барьер между сообществом и внешней средой [Нестерова
Учитывая опыт предыдущих исследований [Тец, 2005], первоначально более углубленному анализу были подвержены результаты, полученные при отсроченном на 6 часов выкладывании дисков с антибиотиками. При этом получен значительный разброс значений, что дало возможность судить о степени изменения данного показателя и провести корреляционный анализ со степенью пленкообразования.
Для наглядного отражения степени изменения чувствительности, уменьшение зоны задержки роста бактерий при отсроченным на 6 часов нанесении диска было выражено в процентах от диаметра зоны, получаемой при традиционной 30 минутной экспозиции (табл. 4.6)..
Таблица Была обнаружена умеренная корреляция между уровнем пленкообразующей активности штаммов и степенью изменения чувствительности к имипенему (г=0,59) и меропенему (г=0,33). При 6 часовой отсрочки выкладывания дисков с антибиотиками в 65,2% случаях зона задержки роста отсутствовала полностью
Далее была проведена серия экспериментов по возможному изменению МПК имипенема, как одного из наиболее часто употребляемых антибиотиков, в отношении селекционированных вариантов из разреженного газона с разным сроком выкладывания диска с антибиотиком (30 мин, 1,5 ч. и 6 ч.). Все отобранные пробы сначала помещали в питательный бульон (LB-бульон) и культивировали 8 часов в термостате, после чего определяли МПК имипенема в полистироловых планшетах. Внесение антибиотика в лунки производили одновременно с бактериальной культурой, а также через 1,5 и 6 часов культивирования. В качестве контроля использовали культуру, выращенную в отсутствии антибиотика.
В подавляющем большинстве случаев, МПК имипенема для вариантов, отобранных из разреженного газона, была в несколько раз (2-4) выше таковой для контроля (табл. 4.7). При этом, чем более длительная селекция происходила в присутствии антибиотика, тем большая концентрация требовалась в последствии для подавления роста микроорганизма. То есть, наибольшее увеличение МПК наблюдали для проб, отобранных из газона, сформированного при нанесении диска с антибиотиком с 30 минутной задержкой. Это указывает на то, что клетки-персистеры, преобладающие в газоне при селекции, изменяют свою чувствительность. В то же время, при отсроченном внесении препарата МПК для проб сохранялась неизменной вне зависимости от времени добавления антибиотика, а для контроля увеличивалась уже при 30 минутной задержки внесения имипенема.
Изменение численности, пленкообразующей активности и чувствительности к антибиотикам штаммов P. aeruginosa под влиянием озона
В значительном: проценте случаев; изолированные культуры оказались полирезистентными, их доля составила 79,4 %, при этом 22,8 % из них были устойчивы . к действию всех антибиотиков взятого спектра, т.е. характеризовались панрезистентностью; Особого- внимания заслуживает прослеженный нами высокий, процент устойчивости к меропенему (46,6 %) и : имипенему (78 4 %) у штаммов P. aeruginosa, изолированных в разных стационарах г. Перми, хотя еще в 90-х годах в многоцентровом клиническом , исследовании, проведенном в России, 92% изолятов P. aeruginosa от больных с тяжелыми инфекциями в ОРИТ были чувствительны к карбопенемам, в частности, меропенему [Яковлев, 1998].
В стационарах селективное воздействие антибиотиков ускоряет процесс эволюции\ P. aeruginosa, где формируются полирезистентные бактериальные популяции [Сидоренко, 2005], Именно поэтому чаще-всего о госпитальной природе возбудителя ГСИ судят по его устойчивости к антибактериальным- средствам. Однако, тот факт, что, как внутри-, так и внебольничные варианты синегнойной палочки оказывались полирезистентными, свидетельствует о том, что этот традиционный маркер госпйтальности зачастую недостаточен для достоверной оценки природы выделенного штамма, так как для P. aeruginosa характерна природная устойчивость к различным соединениям с антибактериальной активностью. Учитывая тот факт, что гены лекарственной устойчивости часто обнаруживаются в ассоциациях с детерминантами факторов патогенности, полирезистентные бактерии обычно более вирулентны и обладают значительной способностью к распространению [Васина, 2008]. В этой связи, основной раздел нашей работы был посвящен изучению биологических особенностей нозокомиальных штаммов и совершенствованию диагностических подходов к их дифференциации.
Пленкообразующая активность и полирезистентность к антибактериальным препаратам у Р: aeruginosa не являются взаимообусловленными признаками, однако, образование биопленок, как известно, значительно снижает эффективность антибиотикотерапии и результативность антисептических мероприятий. Тот факт, что способность к пленкообразованию в большинстве случаев сочетается с продукцией альгината и высокой антибиотикорезистентностью, вполне- логичен и укладывается в существующие представления о персистентных свойствах бактерий. На основании изучения антибиртикограмм изолятов многопрофильных стационаров был выявлен наиболее распространенный антибиотикофенотип (А), характеризующийся устойчивостью к цефтазидиму, цефепиму, имипенему, гентамицину, амикацину и ципрофлоксацину. С учетом панрезистентных вариантов, резистентность к этому набору антибиотиков была свойственна более чем 40 % изученных культур, большинство из которых обладали- схожим набором факторов патогенности, отличаясь не более чем по одному признаку.
Данные штаммы, в основном, были, выделены в ОРИТ, однако, присутствовали и в материале из других отделений, что характеризует отделение реанимации, как возможное место возникновения и источник распространения госпитальных штаммов P. aeruginosa. Более того, штаммы; изолированные из ОРИТ всех ЛПУ, наряду с выраженной множественной лекарственной устойчивостью характеризуются наиболее широким набором экспрессируемых факторов патогенности. С одной стороны, в этом проявляется определенное противоречие, так как защитные реакции организма у пациентов этих отделений в большинстве случаев снижены, и микроорганизмам нет необходимости проявлять патогенный потенциал в полной мере. С другой стороны, условия и средства оказания помощи, контингенты больных именно в отделениях реанимации становятся мощным провоцирующим и селективным фактором, способствующим изменению свойств бактерий. Характерная выраженность факторов патогенности и устойчивости к антибактериальным препаратам наблюдается и в отделениях с близким ОРИТ «статусом». Сочетание устойчивости к антибиотикам широкого набора факторов вирулентности с высокой степенью пленкообразующей способности указывает на то, что в условиях стационара, и прежде всего ОРИТ, именно в пленках накапливается высокий патогенный. потенциал, вследствие чего пленкообразующие штаммы нередко становятся возбудителями острых инфекций. В целом, полученные результаты по изучению особенностей формирования биопленок внутрибольничными штаммами P. aeruginosa указывают на то, что данный признак может служить одним из маркеров госпитальности, а выявление изолятов с высокой степенью пленкообразования требует новых подходов к организации и проведению дезинфекционных мероприятий по элиминации возбудителя.
Пленкообразующая способность может играть решающую роль и при развитии ГСИ, обусловленных двух-, трех- и более компонентными ассоциациями условно патогенных микроорганизмов, которые, как правило, характеризуются длительным и малосимптомным течением. Мы предположили, что характер межмикробных взаимоотношений с участием P. aeruginosa целесообразно определять при сравнительном анализе сформированных ассоциантами моно- и бипленок. (заявка на изобретение №2010127885 от 06.07.2010). Использование в качестве тест-культур штаммов микроорганизмов, наиболее часто выделяемых в ассоциации с синегнойной палочкой, позволило выявить нейтральный, синергический и антагонистический типы взаимодействия. При этом установлено, что при совместном культивировании. P. aeruginosa с грамположительными бактериями, развиваются все три типа взаимодействия, а определяющее значение имеют клеточные компоненты тест-культур, в то время как с грамотрицательными бактериями и их метаболитами — в большинстве случаев ; наблюдается однонаправленный эффект, ингибирующий пленкообразование: Очевидно, что;при формировании смешанных биопленок могут складываться разнообразные метаболические: взаимоотношения между ассоциантами, усугубляющие инфекционный процесс, либо препятствующие его развитию.
Нами предложена и апробирована модификация диско-диффузионного метода определения?, антибиотикочувствительностщ. основанная на отсроченном;выкладывании дисковша бактериальный газон и.имитирующая воздействие на\сформированную- биопленку; Иосле:предлагаем6йЛ0-часовош отсрочки г у штаммов- с: различною степенью; чувствительности; исчезновение: зоньь задержки роста зафиксировано у 88 4% исследованных штаммов;, При-, этом .обнаружена1 сильная зависимость. (Кп=0 94) между исчезновением- зоны и способностью штамма к пленкообразованию., Такой подход дополняет, регламентированную методику и решает две задачи: во-первых, он может способствовать более корректному выбору антибактериального средства с учетом пленкообразующей; способности; штамма, во-вторых, позволяет сделать вывод о степени выраженности последней (рацпредложение №2549 от07.06;2011).
