Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Основные черты периферийного метаболизма ксенобиотиков у псевдомонад 10
1.1. Пути периферийного метаболизма ароматических углеводородов 10
1.2. Основные особенности окисления метилбензолов 14
1.3. Особенности периферийного метаболизма галогенированных соединений 13
ГЛАВА 2. Пути и механизмы микробной адаптации к чужеродным соединениям 25
2.1. Неспецифическое действие ферментов 26
2.2. Переключение путей метаболизма в процессе адаптации к чужеродному субстрату 28
2.3. Кометаболизм 31
2.4. Генетические механизмы адаптации микроорганизмов к использованию ксенобиотиков 35
ГЛАВА 3. Основные черты центрального метаболизма псевдомонад 39
3.1. Цикл трикарбоновых кислот 39
3.2. Анаплеротические пути 44
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. Методы и материалы 50
4.1. Организмы, методы их культивирования 50
4.2. Приготовление бесклеточных экстрактов и определение активности ферментов 51
4.3. Определение поступления С-ацетата и С-пирувата в клетку 60
4.4. Методы определения концентрации ацетата, пропионата и пирувата в культуральной
жидкости и бесклеточном экстракте 61
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. Изучение центрального метаболизма культур P. aeruginosa, растущих на п-ксилоле 64
5.1. Рост культур p.aeruginosa на различных субстратах 65
5.2. Динамика потребления пирувата, пропионата и ацетата и поступление их в клетку 68
5.3. Особенности промежуточного обмена штаммов P.aeruginosa при росте на п-ксилоле 72
5.4. Сравнительный энзиматический анализ культур р.aeruginosa, растущих на п-ксилоле, с культурами, не способными к использованию ксенобиотиков 83
5.5. Регуляция ферментов пируватного шунта 98
ГЛАВА 6. Особенности центрального метаболизма культуры P.aeruginosa 640x , кометаболизирующей ДДТ 105
6.1. Рост культуры на различных субстратах 108
6.2. Изучение центрального метаболизма
культуры 108
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 126
ВЫВОДЫ 131
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 133
- Пути периферийного метаболизма ароматических углеводородов
- Неспецифическое действие ферментов
- Цикл трикарбоновых кислот
- Организмы, методы их культивирования
- Рост культур p.aeruginosa на различных субстратах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Огромный метаболический потенциал бактерий рода psudomonas привлек к ним большое внимание микробиологов, биохимиков и генетиков. Биохимическая лабильность, свойственная этим организмам, наличие внехромосомных элементов наследственности, способных к легкому переносу между штаммами псевдомонад, позволяют этшл бактериям утилизировать широкий набор соединений, в том числе и чужеродных для микробной клетки. Способность использовать в качестве ростовых субстратов н-ажаны, ароматические углеводороды, галогенсодержащие соедішения, а также широкий спектр обычных микробиологических субстратов указывает на большую гибкость метаболизма псевдомонац. Однако, практически ничего не известно о масштабе перестроек энзиматического аппарата клетки в процессе адаптации микроорганизмов к использованию ксенобиотиков. Остается неясным очень важный вопрос - связано ли появление способности к разложению чужеродных веществ только с особенностями периферийного обмена или в процессе длительной адаптации культуры к использованию ксенобиотика происходят более глубокие перестройки ферментативного аппарата, затрагивающие и центральный метаболизм бактерий.
Состояние вопроса, цель и задачи исследования. Вопрос о функционировании ферментных систем центрального метаболизма у микроорганизмов, способных к деградации труднодоступных соединений до сих пор, практически, не изучен. Лишь в последние годы были предприняты первые попытки выяснения взаимосвязи процессов периферийного и центрального метаболизма у микроорганизмов, способных к росту на окисленных ароматических соединениях. Изучение данного вопроса представляет особый интерес потому, что детальное понимание процессов взаимодействия микробной клетки и ксено- биотика очень важно для интенсификации микробиологической деградации трудноразлагаемых соединений.
Основной целью настоящей работы было на примере культуры Pseudomonas aeruginosa 640х, способной к полной деградации ДЦТ, И культур Pseudomona aeruginosa 2х И 7, использующих П-КСИЛОЛ в качестве ростового субстрата, выявить особенности функционирования ферментных систем центрального метаболизма, позволяющие данным штаммам активно разлагать ксенобиотики.
В задачи давшого исследования входило: выявление особенностей метаболизма культур P.aeruginosa 640х, 2х, 2x79 и 7, связанных с длительным контактом данных штаммов с ксенобиотиками; сравнительное изучение центрального метаболизма и его регуляции у культур, разлагающих чужеродные соединения, с другими штаммами псевдомонад, неспособными к деградации ксенобиотиков; изучение взаимосвязи меаду метаболизмом косубстратов культурой p.aeruginosa 640х и интенсивностью кометаболизма ДЦТ данным штаммом.
Пути периферийного метаболизма ароматических углеводородов
В наиболее общем виде разложение ароматических соединений можно представить следующим образом. Начальные этапы разложения первичных субстратов ведут к образованию таких соединений, как пирокатехин, протокатеховая кислота, метилпирокатехины, гентизиновая и гомогентизиновая кислоты, занимающих центральное место в метаболизме ароматических веществ. Следующий этап заключается в расщепхлении ароматических колец, осуществляемом различными диоксигеназами. Образующиеся алифатические соединения в последующей цепочке реакций превращаются в интермедиаты центрального метаболизма, вступающие в цикл трикарбоновых кислот. Необходимо отметить, что начальные этапы разложения ароматических углеводородов не всегда ведут к образованию соединений, способных подвергаться дальнейшему окислению. В таком случае происходит неполное превращение субстрата - микробиологическая трансформация - и не-метаболизируемые продукты первичного окисления накапливаются в среде.
Неспецифическое действие ферментов
Одним из путей адаптации микроорганизмов к ксенобиотикам является неспецифическое действие ферментов - компонентов обычных метаболических систем - выражающееся в том, что эти ферменты способны превращать не только свой "специфический" субстрат, но и его структурные аналоги, а иногда и соединения совсем отличного строения. Для многих ферментов, осуществляющих первичную атаку на молекулы неприродных соединений за редким исключением (антиметаболиты), характерна низкая субстратная специфичность. Типичным примером могут служить гидролазы, осуществляющие расщепление ациланилидов, замещенных мочевины, фенилкарбаматов и многих фосфорорганических пестицидов. Гидролазы, ответственные за расщепление амидной связи фенил-амидов - арилациламидазы (амидогидролазы арилациламидов) - наиболее изученная группа ферментов ( Clark a. Wright, 1970; Engelhardt е.a., 1973; Blake a. Kaufman, 1975; Wright a, Porey, 1972), Типичным примером этой группы ферментов является ациламицаза из Bacillus sphaericus. Фермент был очищен цо гомогенного состояния. Он имел молекулярный вес 75000 и рН оптимум 7,0-8,5 (Engelhardt е.а., 1973). Фермент индуцировался различными фениламидами - ациланилицами, ме-токсизамещеиными фенилмочевинами и фенилкарбаматами. Из 7 соединений, индуцирующих синтез амидазы, лучшими индукторами были линурон, монамиц И 2-ХЛОрбензанилиц (Engelhardt е.а., 1973).
Изучение субстратной специфичности фермента показало, что индуцированная линуроном амидаза гицролизовала 17 из 21 испытанных фениламидов (Engelhardt е.а., 1971). Наибольшее сродство фермент проявлял к своему индуктору-линурону (Код = 2 Ю""6 М). Наибольшая активность была обнаружена с Іг-аланил-4-нитроанилидом, менее активен он был с глицин-4-нитроанилидом, 4-нитроацетанилидом, ь-лей-цин-4-нитроанилидом, 2,5-диметилфуран-З-карбоксанилидом, линуроном и монолинуроном, с 10 остальными фениламидами активность фермента была ниже 20 ед 10 /мг белка. Эти исследования проводились с грубым бесклеточным экстрактом, однако, результаты электрофореза в по-лиакриламидном геле дали авторам основание полагать, что за все гидролитические процессы ответственен один фермент (Engelhardt е.а., 1971).
Цикл трикарбоновых кислот
Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) занимает центральное место как в катаболических, так и в оиосинтетических процессах у псевдомонад. Способность использовать разнообразный набор органических, соединений в качестве единственных источников углерода и энергии, характерная для псевдомонад, связана с наличием у них большого числа особых метаболических путей окисления субстратов, причем, все эти пути сходятся к ЦТК. Одни ростовые суостраты превращаются в ацетил-КоА, другие - непосредственно в дикарбоновые кислоты: « -кетоглутарат, сукцинат, фумарат и малат (рис. ). В цикле трикарооновых кислот происходит полное окисление ростовых субстратов.
Изучение активностей ряда ферментов ЦТК при росте P.aeruginosa на глюкозе и еукцинате показало, что ферменты ЦТК являлись
Конститутивными и нє репрессировались ГЛЮКОЗОЙ (Tivrari a. Campbell, 1969) в отличие от Е.соїі у которой наблюдалась репрессия ферментов ЦТК при внесении в минеральную ростовую среду глюкозы, при росте на сложных средах, содержащих аминокислоты и при росте в отсутствии кислорода (Gray е.а., 1966). При одновременном внесении в минеральную ростовую среду глюкозы и цитрата наблюдалась диауксия, причем в отличие от Е.сои, цитрат использовался как предпочтительный ростовой субстрат (Hamilton a. Dawes, 1959 ).
Организмы, методы их культивирования
В работе использовали культуры, выделенные ранее из различных природных источников и коллекционные культуры микроорганизмов.
Штамм Pseudoraonas aeruginosa 640х был выделен из садовой почвы Крымской области, обрабатывающейся в течение ряда лет ДЦТ (Скрябин с соавт., 1978, 1979). Данный штамм характеризовался способностью к полному разложению ДЦТ в условиях кометаболизма.
Штаммы P.aeruginosa 2х И P.aeruginosa 7 были выделены из почв с территории Донецкого коксохимического комбината и характеризовались способностью использовать п-ксилол в качестве единственного источника углерода и энергии (Головлева с соавт., 1978).
Мутантный штамм P.aeruginosa 2х 79 был выделен как спонтанный п-ксилол - негативный вариант штамма P.aeruginosa 2х (Горла-това, 1982).
В работе использовали также коллекционный штамм P.aeruginosa РАО I.
Для культивирования P.aeruginosa 640х использовали минеральную среду Ерошина 8Е (г/л) (Ерошин с соавт., 1965) - НаС1 - 0,5; MgS04 7H20 - 0,8; КНгР04 - 0,7; (Ш НРС 1»5? вЧа водопроводная 800 мл. Фосфаты готовили отдельно на дистиллированной воде (200 мл), стерилизовали и смешивали со стерильным раствором солей после охлаждения. В экспериментах с ДЦТ цасі заменяли 0,1 г Па о, для уменьшения возможного токсичного эффекта хлоридов, поступающих в среду при дехлорировании ДЦТ.
При изучении роли косубстратов в процессе деградации ДЦТ использовали следующие соединения (г/л): глюкозу - 2, рибозу - 2, глицерин - 2, ацетат - 2, этанол, - 0,5, гексадекан - 2.
При изучении центрального метаболизма культур, адаптированных к росту на п-ксилоле, пируват, ацетат, пропионат, сукцинат и глюкозу вносили в среду в концентрации 20 мМ. Для выращивания культур на п-ксилоле использовали колбы со впаянными стаканчиками, 10 мл п-ксилола вносили в стаканчик и рост культуры происходил в парах этого субстрата.
Культивирование проводили на качалках (200 об/глин) в колбах на 750 мл со 100 мл среды при 29С.
Чистоту культур проверяли высевом на чашки с МПА, а также контролировали микроскопированием.
Рост культур на различных источниках углерода в жидкой среде контролировали нефелометрически при помощи колориметра ФЭК-60 с зеленым светофильтром.
Рост культур p.aeruginosa на различных субстратах
Разложению ксенобиотиков, проводили на примере двух штаммов псевдо-монац - P.aeruginosa 2х и 7, выделенных из почв, загрязненных нефтью и затем в течение нескольких лет поддерживаемых в селективных условиях на средах с ароматическими углеводородами. Третья культура - P.aeruginosa 640х была выделена из почв, более 15 лет обрабатываемых ДЦТ и характеризовалась способностью осуществлять полное разложение ДЦТ в условиях кометаболизма. Так как эти культуры - немногие из большого количества проверенных штаммов - обладали такими уникальными свойствами, как способность разлагать ДЦТ или расти на восстановленных ароматических углеводородах, можно было предположить, что в процессе длительной адаптации к разложению ксенобиотиков мог произойти ряд изменений не только в периферийном, но и в центральном метаболизме данных штаммов.
С целью изучения центрального метаболизма данных культур была исследована динамика роста штаммов P.aeruginosa 2х и 7 на различных соединениях и проведен энзиматический анализ. Ранее был установлен путь окисления п-ксилола культурами p.aeruginosa 2х и 7 и проведено определение активности ферментов расщепления ароматического кольца при росте данных штаммов на п-ксилоле (Го-ловлева с соавт., 1978). Было показано, что основным путем деградации п-ксилола у данных культур служила метаболическая ветвь,
ведущая к образованию 4-метилпирокатехина, который разлагался в дальнейшем при действии метапирокатехазы (рис.1). Продуктами расщепления ароматического кольца 4-метилпирокатехина являются пируват и пропионовый альдегид (Murray е.а., 1972). У данных культур был обнаружен также минорный путь окисления п-ксилола, ведущий к образованию протокатеховои кислоты, которая расщеплялась протокатехоат-3,4-циоксигеназой по орто-пути. В качестве конечных продуктов в этом случае образовывалось незначительное количество ацетил-КоА и сукцината.
Для проведения сравнительного энзиматического анализа кроме культур 2х и 7, растущих на п-ксилоле, использовали спонтанный п-ксилол - негативный мутант штамма 2х - P.aeruginosa 2x79 и коллекционную культуру P.aeruginosa РАО, В качестве источников углерода и энергии были выбраны обычные микробиологические субстраты - ацетат, пируват и сукцинат. Кроме данных соединений, использовали бензоат, разлагаемый исследуемыми культурами по орто-пути для того, чтобы установить пути центрального метаболизма данных культур при одновременном образовании в клетке сукцината и ацетил-КоА.
