Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Бактериальная деструкция полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) 20
1.1. Бактерии-деструкторы ПАУ 21
1.2. Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена у бактерий 22
1.3. Генетические системы биодеградации ПАУ 33
1.4. Микробная деструкция ПАУ в условиях повышенной солености среды 40
1.4.1. Галотолерантные/галофильные бактерии-деструкторы ПАУ 41
1.4.2. Механизмы галоадаптации у бактерий 44
1.4.3. Ассоциации бактерий, осуществляющие разложение ПАУ в условиях повышенной солености среды 50
ГЛАВА 2. Бактериальная деструкция бифенила и полихлорированных бифенилов (ПХБ) 55
2.1. Бактерии-деструкторы бифенила/ПХБ 55
2.2. Метаболические пути деструкции бифенила/ПХБ у бактерий 59
2.3. Бифенил 2,3-диоксигеназа - ключевой фермент разложения бифенила и хлорированных бифенилов 61
2.4. Генетические системы биодеградации бифенила/ПХБ 67
ГЛАВА 3. Разложение замещенных бензойных кислот бактериями 72
3.1. Бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот (ХБК) 72
3.2. Метаболические пути и генетические системы деструкции ХБК у бактерий 76
3.3. Пути метаболизма пирокатехина и (метил)замещенных пирокатехина...83
3.4. Генетическое конструирование штаммов-деструкторов ХБК и ПХБ 88
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 91
4.1. Объекты исследования 91
4.2. Среды и условия культивирования 94
4.3. Накопительные культуры 96
4.4. Ростовые характеристики и определение субстратной специфичности бактерий 97
4.5. Эксперименты по моделированию смешанных культур 97
4.6. Определение таксономического положения бактерий 98
4.6.1. Морфологические и физиолого-биохимические признаки 98
4.6.2. Методы анализа хемотаксономических признаков 99
4.6.3. Молекулярно-генетические методы 100
4.7. Денатурирующий градиентный гель электрофорез 101
4.8. Плазмиды и определение стабильности признаков биодеградации 102
4.9. Определение активностей ферментов биодеградации ПАУ 105
4.10. Очистка и характеристика ферментов штамма Я. ruber Р25 106
4.11. Изучение генов деструкции нафталина, бифенила, ХБК 109
4.11.1. Изучение функциональных генов методом ПЦР 109
4.11.2. Клонирование и изучение генов деструкции 2ХБК и 4ХБК 111
4.12. Аналитические методы 112
4.12.1. Изучение бактериальной деструкции ПАУ, ПХБ и ХБК 112
4.12.2. Выделение и анализ осмопротекторных соединений 115
4.13. Модельные почвенные системы 116
4.14. Статистическая обработка 117
ГЛАВА 5. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов 118
5.1. Бактерии рода Arthrobacter 118
5.2. Бактерии родаRhodococcus 127
5.3. Спорообразующие бактерии родов Bacillus и Paenibacillus 130
5.4. Бактерии рода Pseudomonas 134
5.5. Бактерии порядка Actinomycetales, выделенные из почв/грунтов района солеразработок 138
5.6. Галотолерантные свойства бактерий-деструкторов ПАУ 143
5.7. Бактериальные гены, контролирующие начальные этапы деструкции нафталина 146
ГЛАВА 6. Бактерии-деструкторы бифенила и полихлорбифенилов 151
6.1. Характеристика бактерий-деструкторов 151
6.2. Особенности разложения ароматических соединений штаммами Rhodococcus ruber Р25 и Microbacterium sp. В51 159
6.2.1. R. ruber P25 - деструктор орто-, иора-хлорированных бифенилов...159
6.2.2. Деструкция 4-метилбензойной кислоты (МБК) R. ruber Р25, ключевые ферменты катаболизма МБК 162
6.2.3. Экстрахромосомальные ДНК штамма R. ruber Р25 168
6.2.4. Деструкция ПХБ штаммом Microbacterium sp. В51 169
6.3. Разнообразие генов, кодирующих а-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, исследуемых бактерий 171
ГЛАВА 7. Природные и генетически-модифицированные бактерии-деструкторы хлорированных бензойных кислот 180
7.1. Характеристика бактерий-деструкторов ХБК, изолированных из техногенных почв 180
7.2. Генетические системы деградации хлорбензойных кислот 182
7.2.1. Гены раннего дегалогенирования 4ХБК бактерий рода Arthrobacter...182
7.2.2. fcb-Геиы бактерий-деструкторов из техногеннозагрязненных почв... 185
7.3. ohb-Геяы, контролирующие окислительное дегалогенирование орто-замещенных хлорбензоатов, штамма Pseudomonas aeruginosa 142 187
7.4. Конструирование метаболических путей деструкции хлорароматических соединений с использованием fcb- и O/ZZJ-ГЄНОВ 192
7.4.1. Клонирование и экспрессия усб-генов в составе рекомбинантной плазмиды в клетках P. putida, конструирование гибридного пути деградации 4-хлорбензоата 192
7.4.2. Конструирование рекомбинантного штамма, содержащего /сЬ-гепы в хромосоме P. putida 194
7.4.3. Штаммы-деструкторы ПХБ, сконструированные при использовании fcb- и ohb-гепов 195
ГЛАВА 8. Природные и модельные ассоциации бактерий, перспективные для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды 197
8.1. Нафталинметаболизирующие ассоциации бактерий, выделенные из техногеннозасоленной почвы 197
8.1.1. Характеристика нафталинметаболизирующих ассоциаций 198
8.1.2. Изучение взаимовыгодных отношений между бактериями в нафталинметаболизирующих ассоциациях 207
8.1.3. Использование бактериального консорциума SMB3 для очистки загрязненных почв 211
8.2. Двухкомпонентная бактериальная ассоциация, утилизирующая 2,4-дихлорбифенил 213
ГЛАВА 9. Описание новых таксонов бактерий, изолированных из нафталинметаболизирующих ассоциаций SMB1 и SMB3 215
9.1. Новый род и вид Salinicola socius sp. nov., gen. nov 215
9.2. Новый вид — «Thalassospira permensis» sp. nov 223
9.3. Новый вид - «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov 227
9.4. Новые виды рода Brevibacterium (В. permense sp. nov., B. antiquum sp. nov. и В. aurantiacum sp. nov.), характеризующиеся оранжевой окраской колоний 231
Заключение 235
Выводы 238
Список литературы 240
Приложение 308
- Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена у бактерий
- Бифенил 2,3-диоксигеназа - ключевой фермент разложения бифенила и хлорированных бифенилов
- Метаболические пути и генетические системы деструкции ХБК у бактерий
- Деструкция 4-метилбензойной кислоты (МБК) R. ruber Р25, ключевые ферменты катаболизма МБК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема очистки наземных и водных экосистем, загрязненных токсичными, устойчивыми к разложению и представляющими опасность для здоровья человека химическими соединениями, занимает центральное место в ряду актуальных задач современной экологии. Среди поллютантов, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, а также тенденцией к биоаккумуляции, наиболее распространенными являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бифенил и его хлорированные производные (Hall, Grover, 1999; ATSDR, 2000). ПАУ поступают в окружающую среду с разливами нефти, отходами коксохимических, газоперерабатывающих производств и химических предприятий, образуются при неполном сгорании топлива и бытовых отходов (Seo et al., 2009). Полихлорированные бифенилы (ПХБ) широко применялись в течение нескольких десятилетий при производстве лакокрасочных материалов, пластификаторов, пестицидов, в электротехнической промышленности. В настоящее время производство и использование ПХБ, как особо стойких органических загрязнителей, запрещено Стокгольмской Конвенцией (). Наряду с задачами по восстановлению экосистем, загрязненных этой группой токсикантов, остро стоит проблема детоксикации больших объемов невостребованных коммерческих смесей, созданных на основе хлорбифенилов (Васильева, Стрижакова, 2007; Pieper, Seeger, 2008). Биоремедиация почв и других объектов окружающей среды с использованием микроорганизмов-деструкторов (хлор)ароматических соединений имеет ряд известных преимуществ по сравнению с другими методами экобиотехнологии (Sutherland et al., 1995; Pieper, 2005; Cao et al., 2009).
К настоящему времени обнаружены и описаны бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать нафталин, фенантрен, антрацен, другие высокомолекулярные ПАУ (Боронин и др., 1989; Бабошин и др., 2005; Kanaly, Harayama, 2000; Jones et al., 2003; Reng et al., 2008). Способность к трансформации ПХБ описана для широкого круга бактерий – протеобактерий (Acinetobacter, Alcaligenes, Cupriavidus, Pseudomonas, Sphingomonas), актинобактерий (Rhodococcus, Arthrobacter), споровых (Bacillaceae) (Bedard, Haberl, 1990; Furukawa, Fujihara, 2008; Pieper, Senger, 2008). Однако известны лишь единичные штаммы, исключительно представители протеобактерий (Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas и Ralstonia), которые могут полностью разлагать моно- и дихлорбифенилы (Kim, Picardal, 2001; Adebusoye et al., 2008).
Большинство известных штаммов-деструкторов трансформируют ПХБ до соответствующих хлорбензойных кислот (ХБК). Последующие этапы деградации хлорбензоатов в ПХБ-деградирующих микробных системах осуществляют обычно другие группы организмов (Unterman, 1996). Среди них значительная роль принадлежит бактериям, осуществляющим отщепление галогена на первых этапах разложения хлорбензоатов, в результате чего образуются менее токсичные соединения, доступные для использования в качестве субстрата для многих почвенных микроорганизмов (Карасевич, 1982; Scholten et al., 1991; Fetzner, 1998; Field, Sierra-Alvarez, 2008).
Развитие молекулярно-генетических методов и исследования в области структурной и функциональной геномики бактерий-деструкторов способствовало пониманию молекулярных механизмов биодеградации вышеназванных соединений. Показано, что генетические детерминанты (гены/опероны) бактериальной деструкции ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК локализованы в хромосоме и высокомолекулярных плазмидах, и могут присутствовать в клетке в нескольких копиях (Boronin, 1992; Sanseverino et al., 1993; Reineke, 1998; Shimizu et al., 2001; Dennis, Zylstra, 2004; Basta et al., 2005; Chain et al., 2006; Iwasaki et al., 2006). Имеются сведения о горизонтальном переносе генов биодеградации в составе мобильных генетических элементов (плазмид, транспозонов, интегронов), в том числе между бактериями различных филогенетических групп (Fulthorpe, Campbell, 1992; Herrick et al., 1997; Nishi et al., 2000; Gartemann, Eichenlaub, 2001; Habe, Omori, 2003; Reng et al., 2008). Установлена важная роль диоксигеназ на начальных этапах аэробной деструкции ПАУ и бифенила/ПХБ (McKay et al., 1997; Gibson, Parales, 2000; Seeger et al., 2001; Jakoncic et al., 2007; Schuler et al., 2009). Ферменты этой группы способны осуществлять трансформацию многих полиароматических соединений, что определяет их важную роль в развитии различных биотехнологий (Harayama, 1997; Boyd et al., 2001; Bamforth, Singleton, 2005; Shindo et al., 2007; Cao et al., 2009).
Функциональные особенности бактерий-деструкторов в комплексе с данными по структурной и функциональной геномике находятся в фокусе внимания современной микробной экологии, а также активно развивающейся системной биологии. Концепции системной биологии и синергия экологических подходов и технологий геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики являются, с точки зрения современной науки, наиболее перспективным подходом к пониманию механизмов адаптации и (микро)эволюции индивидуальных микроорганизмов и микробных сообществ к условиям изменяющейся природной среды, особенно в условиях многофакторного негативного воздействия (Trigo et al., 2009). Изучение микроорганизмов, обитающих в определенных эколого-географических условиях и подверженных одновременному воздействию различных антропогенных факторов (в т.ч. высокий уровень токсичных поллютантов и повышенная минерализация среды), вызывает особый интерес. Актуальность таких исследований, наряду с теоретическими аспектами, обусловлена также и практическими задачами экобиотехнологии. Основной среди них является разработка новых стратегий биоремедиации, в том числе в связи с неэффективностью технологий, созданных на основе не адаптированных к соответствующим условиям микроорганизмов.
Имеющиеся сведения о микроорганизмах, способных к деструкции полиароматических углеводородов в условиях высокой солености, немногочисленны и касаются, в основном, грамотрицательных или «морских» бактерий родов Pseudomonas, Сycloclasticus, Vibrio, Lutibacterium, Neptunomonas (Garsia-Valdes et al, 1988; Dyksterhouse et al., 1995; Geiselbrecht et al., 1998; Hedlud et al., 1999, 2001; Chung, King, 2001; Kasai et al., 2002; Garca et al., 2005; Abed et al., 2006), а также спорообразующих бактерий (Paenibacillus) (Daane et al., 2002). Крайне слабо изучены механизмы адаптации бактерий к таким условиям существования (Roberts, 2005; Oren, 2008), а также взаимодействия внутри микробных сообществ: регуляция их состава, метаболической активности и устойчивости к высокому содержанию солей. До начала наших работ практически отсутствовали сведения о разнообразии и функциональных особенностях грамположительных бактерий - резидентов наземных экосистем, в которых ведущими факторами формирования микробиоценозов являются соленость среды и токсичный поллютант. Все вышесказанное определяет актуальность и перспективность фундаментальных и прикладных исследований в этом направлении.
Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование таксономического, генетического, функционального разнообразия аэробных бактерий-деструкторов ПАУ и ПХБ, а также создание и изучение бактериальных штаммов и ассоциаций с заданным биодеградативным потенциалом.
Основные задачи исследования:
-
Выделение бактерий-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила/ПХБ, ХБК из почв/грунтов, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств.
-
Изучение генотипических и фенотипических характеристик изолятов и определение их таксономического положения с использованием принципов полифазной таксономии.
-
Характеристика экологических особенностей и биодеградативного потенциала выделенных бактерий.
-
Изучение разнообразия ключевых генов деструкции нафталина, бифенила/ПХБ и ХБК у бактерий.
-
Конструирование метаболических путей деструкции хлорированных соединений на уровне бактериальной клетки и ассоциации бактерий.
-
Выделение и изучение галотолерантных нафталинметаболизирующих консорциумов бактерий.
Научная новизна. Получены новые сведения о разнообразии микробных сообществ, обитающих в условиях повышенной солености, высокого уровня загрязнения среды токсичными поллютантами. Детально охарактеризовано 90 штаммов-деструкторов ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК - представителей классов Proteobacteria (роды Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), Actinobacteria (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces) и семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibacillus). Выявлены бактерии, разлагающие токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40С), рН среды (от 5 до 9) и при повышенной солености среды (до 90 г/л NaCl). Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 – орто-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) – (орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ. Впервые выделены в культуру и охарактеризованы галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена), относящиеся к родам Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов валидно описаны новый род Salinicola, включающий вид S. socius, а также новые виды рода Brevibacterium – В. permense, B. antiquum и В. aurantiacum; выявлены новые виды «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov. и ряд других видов.
Обнаружены и изучены ключевые гены начального этапа разложения бифенила/ПХБ у бактерий-деструкторов родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus. Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis КЗТ1, контролирующие гидролитическое дегалогенирование 4ХБК. Путем клонирования fcb-генов в клетки P. putida впервые сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК, более эффективный в отношении утилизации субстрата в сравнении с природными штаммами. В результате селекции на высоких концентрациях 4ХБК рекомбинантного штамма P. putida КЗ-6R (pPC3) получены супердеструкторы 4ХБК. Впервые у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы fcb-гены, кодирующие компоненты 4ХБК-дегалогеназы. Клонированы и изучены новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов. ohb–Гены фланкированы IS1396-подобными последовательностями, содержащими предполагаемые гены транспозазы А (tnpA) и ДНК топоизомеразы I/III (top).
Впервые выделены и исследованы ассоциации бактерий, способные к росту и утилизации нафталина в условиях высокой солености среды (до 8 - 9 % NaCl). Показано, что в состав ассоциаций входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. Экспериментально подтверждено присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме SMB3 между деструкторами нафталина и бактериями-спутниками. Впервые получены данные о положительном влиянии экзогенных осмопротекторных соединений, продуцируемых галофильными/галотолерантными бактериями исследуемых микробных ассоциаций, на разложение ПАУ штаммами-деструкторами в условиях повышенной солености среды. Для представителей рода Rhodococcus (деструкторов нафталина из консорциума SMB3) впервые описана комбинация осмопротекторов: глутамат, эктоин и гидроксиэктоин.
На основе выделенных и детально охарактеризованных штаммов-деструкторов ПХБ и ХБК предложены и экспериментально обоснованы новые подходы к созданию бактериальных ассоциаций, способных эффективно осуществлять утилизацию различных конгенеров ПХБ (как индивидуальных, так и в составе коммерческих смесей).
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о способности аэробных бактерий разлагать ароматические соединения при повышенной солености среды расширяют представления о системах биодеградации ПАУ и могут быть использованы для создания новых эффективных биотехнологий восстановления окружающей среды. Выделенные и детально охарактеризованные уникальные штаммы-деструкторы ПХБ, в частности, Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) (Патент РФ №2262531), могут применяться для восстановления почв и водоемов, загрязненных ПХБ, а также в технологиях детоксикации промышленных смесей, содержащих хлорбифенилы. Полученные путем селекции галотолерантные нафталинметаболизирующие консорциумы являются перспективными для биоремедиации загрязненных ПАУ почв и водоемов в условиях засоления. Данные по механизмам функционирования консорциумов могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем. Результаты изучения D-плазмид галотолерантных бактерий-деструкторов найдут применение при конструировании рекомбинантных штаммов для создания биотехнологий ремедиации антропогенных экосистем.
Конструирование рекомбинантного пути полной деградации 4ХБК в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды, содержащие fcb- и ohb-гены, были использованы в совместных исследованиях в Центре микробной экологии Мичиганского университета (г. Лансинг, США). На основе fcb- и ohb-генов был создан ряд генноинженерных штаммов, осуществляющих полную утилизацию орто- и пара-хлорбифенилов. Полученные рекомбинантные штаммы-деструкторы хлорированных бензойных кислот и бифенилов могут быть использованы при создании инновационных технологий защиты окружающей среды от токсичных галогенароматических соединений.
Новые данные о разнообразии бактерий и генетическом потенциале микробного сообщества района солеразработок (г. Березники, Пермский край) являются основой для разработки критериев мониторинга этого уникального микробиоценоза. Результатом изучения таксономического разнообразия явились усовершенствованные системы классификации и идентификации бактерий ряда групп - важными для микробиологической практики и в связи с вопросами интеллектуальной собственности.
Создана обширная рабочая коллекция бактерий-деструкторов (галоген)арома-тических соединений и галотолерантных/галофильных бактерий, доступных для фундаментальных и научно-прикладных исследований специалистами разного профиля. Большинство штаммов включены в фонд Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, ИБФМ, г. Пущино) и Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь). Дубликаты типовых штаммов описанных новых видов депонированы в ВКМ и Биологических ресурсных центрах мира (в Германии, Бельгии, Франции, Японии), а также включены в международную поисковую систему Straininfo (). Сведения о последовательностях генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, har, bph) штаммов-деструкторов включены в GenBank (Национальный центр биологической информации, США; http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и сопряженные базы данных (EMBL, DDBJ, EzTaxon) других стран.
Материалы диссертации используются в лекционных курсах Биологического факультета (на Кафедрах микробиологии и иммунологии; ботаники и генетики растений) Пермского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas преобладают среди культивируемых аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов ПАУ из микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Бактерии содержат разнообразные генетические детерминанты (D-плазмиды, гены/опероны), контролирующие ключевые этапы разложения нафталина и фенантрена.
-
Полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов (феномен ранее не известный для грамположительных бактерий) осуществляют штаммы Microbacterium sp. В51 [(орто-моно(ди)ХБ] и Rhodococcus ruber Р25 [(орто)пара-моноХБ и 2,4’диХБ]. Другие активные штаммы бактерий характеризуются разной окислительной способностью по отношению к орто- и пара-хлорированным бифенилам. Бактерии-деструкторы моно(ди)хлорбифенилов, относящиеся к родам Arthrobacter, Rhodococcus, Janibacter и Pseudomonas, содержат структурно различающиеся гены, контролирующие начальный этап разложения бифенила/ПХБ.
-
Впервые клонированы и изучены fcb-гены A. globiformis KЗТ1, контролирующие реакцию гидролитического дегалогенирования 4ХБК. В клетках P. putida с использованием fcb-генов сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК и получены супердеструкторы, характеризующиеся высокой стабильностью признака утилизации этого соединения. Клонированы и охарактеризованы новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов.
-
В условиях повышенной солености среды (до 8-9% NaCl) эффективная деструкция и утилизация в качестве источника углерода нафталина может осуществляться консорциумами бактерий, включающими галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinоmycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. В галотолерантных нафталинметаболизирующих ассоциациях микроорганизмов присутствуют протокооперативные взаимоотношения.
-
В составе микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей присутствуют галофильные и галотолерантные бактерии новых таксонов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 110 печатных работ, включая 24 экспериментальные статьи в реферируемых зарубежных, центральных и региональных журналах, 1 обзор, 1 патент, 1 учебное пособие (в соавторстве), 12 статей в сборниках научных статей, 70 тезисов докладов и сообщений на российских и международных конференциях и симпозиумах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 310 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 50 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, отражающих результаты исследований, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 560 литературных источников, из них 60 на русском и 500 на английском языках. В Приложении приведены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, har, bph) исследуемых штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank.
Связь работы с крупными научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН, тема «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологии» (№ гос. рег. 0120.0406511), а также в рамках Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные основы воспроизводства и оптимизации генофондов растений, животных и человека»; Программы интеграционных фундаментальных исследований Президиума УрО РАН, выполняемых в содружестве с учеными СО РАН; проектов РФФИ №00-04-49056-а, №02-04-49043-а, РФФИ-Урал №02-04-96404_а, №04-04-96042_а, №07-04-96078_а, №07-04-97625-р_офи.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на международных симпозиумах и конференциях: III Международном симпозиуме «Pseudomonas» (Триест, 1991), Конференции Американского общества микробиологов «Анаэробное дегалогенирование» (Атенс, 1992), Съездах Американского общества микробиологов (1993; 1994; 1996), X Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002), I Конгрессе Европейского микробиологического общества (Любляна, 2003), Международных конференциях «Загрязнение окружающей среды» (Москва, 1998; Волгоград-Пермь, 2001; Пермь, 2008), IV и V Международных семинарах-презентациях инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» и «Биотехнология-2001» (Пущино, 2000; 2001), Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса» (Пермь, 2001), Международном Байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), Международной конференции «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), II и III Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005; 2008), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), IV и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007), Международных научных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Кишинев, 2009) и других.
Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, заведующему лабораторией химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, чл.-корр. РАН В.А. Демакову - за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении работы; научному консультанту, заведующей отделом ВКМ Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, д.б.н. Л.Н. Евтушенко - за консультативную помощь при выполнении таксономических исследований. Автор признателен коллегам лаборатории, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях - к.б.н. О.В. Ястребовой, к.б.н. Д.О. Егоровой, к.б.н. Л.Н. Ананьиной, к.б.н. Е.С. Шумковой, к.б.н. А.В. Назарову, а также другим сотрудникам ИЭГМ УрО РАН, способствовавшим успешному выполнению работы. Особую благодарность автор выражает Т.В. Цой и О.В. Мальцевой; сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. И.А. Кошелевой, д.б.н. Л.А. Головлевой, д.б.н. И.П. Соляниковой и другим сотрудникам института за искреннюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.
Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена у бактерий
К настоящему времени накоплен большой объем информации о способности бактерий осуществлять разложение ПАУ. Наиболее полно изучены процессы бактериальной деструкции нафталина, простейшего соединения класса ПАУ, которое используется в качестве модельного для изучения биологических систем катаболизма ПАУ. Бактерии-деструкторы нафталина принадлежат к различным таксономическим группам. Полная утилизация до метаболитов основного обмена веществ или частичная трансформация нафталина описана для бактерий родов: Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Comamonas, Cycloclasticus, Lutibacterium, Marinobacter, Micrococcus, Neptunomonas, Nocardia, Paenibacillus, Polaromonas, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Sphingomonas, Streptomyces, Vibrio (Воронин и др., 1989; Grund et al., 1992; Rossello-Mora et al, 1994; Fuenmayor et al, 1998; Hedlund et al, 1999; Laurie et.al, 1999; Annweiler et al, 2000; Kulakov et al, 2000, 2005; Chung, King, 2001; Hedlund, Staley, 2001; Zhou et al, 2001; Daane et al, 2002; Shen et al, 2005; Jeon et al, 2006; Baboshin et al, 2008; Seo et al, 2009).
Обнаружена способность бактерий к деградации ароматических углеводородов, содержащих в своем составе три и более бензольных кольца, таких как фенантрен, антрацен, флюорен, флюоронафтен, пирен, хризен и бенз[а]пирен (Kanaly, Harayama, 2000; Jones et al, 2003; Reng et al, 2008). Способность к утилизации фенантрена описана для бактерий родов Alteromonas, Arthrobacter, Brevibacterium, Pseudomonas, Nocardioides, Sphingomonas (Балашова и др., 1997; Бабошин и др., 2005; Ленева и др., 2009; Schneider et al, 1996; Berardesco et al, 1998; Iwabuchi, Harayama, 1998; Samanta et al, 1999; Zaidi, Imam, 1999; Kallimanis et al, 2009; Seo et al, 2009). Бактерии родов Rhodococcus, Alcaligenes, Mycobacterium, Pseudomonas, Bacillus способны разлагать фенантрен, флюорен, флюоронафтен, пирен и другие ПАУ (Boldrin et al, 1993; Bouches et al, 1996; Kanaly et al., 2000).
Бактерии-деструкторы ПАУ широко распространены в окружающей среде, они выделены из естественных и антропогенных почв, морской воды, донных осадков и сточных вод. В последнее десятилетие интенсивно исследуется способность разлагать ПАУ у микроорганизмов, обитающих в экстремальных условиях. Так, из антарктических почв, загрязненных нефтью, были выделены бактерии, утилизирующие нафталин при 8С (Aislabie et al., 2000). Изолированы термофильные бактерии Bacillus thermoleovorans и Bacillus oleovorans, использующие нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии при 60С, (Annweiler et al., 2000) и термофильные бактерии-деструкторы нафталина рода Geobacillus (Bubinas et al, 2008). Опубликованы данные о биодеградации нафталина в экстремально кислых условиях (Stapleton et al., 1998; Dore et al., 2003). Существует ряд публикаций о бактериях, способных к разложению нафталина в условиях повышенной минерализации среды (Dyksterhouse et al., 1995; Hedlund et al, 1999; 2001; Chung, King, 2001; Kasai et al, 2002). 1.2. Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена у бактерий Наиболее полно изучены катаболические пути и генетические системы деградации нафталина и фенантрена у грамотрицательных бактерий - рода Pseudomonas (P. putida, P. stutzeri, P. saccharophila, P. fluorescens, P. aeruginosa), штаммов Ralstonia sp. U2, Burkholderia sp. RP007, Comamonas {Pseudomonas) testosteroni и Polaromonas naphthalenivorans CJ2 (Patel, Gibson, 1974; Cidaria et al, 1994; Rossello-Mora et al, 1994; Stringfellow, Atken, 1994; Fuenmayor et al, 1998; Laurie et al, 1999; Jeon et al, 2006). Сведения о молекулярно-биологических процессах разложения ПАУ грамположительными бактериями ограничены (Grund et al, 1992; Kulakov et al, 2000, 2005; Bubinas et al, 2008; Seo et al, 2009). Биодеградация ПАУ микроорганизмами осложняется низкой биодоступностью данных соединений вследствие плохой водной растворимости, которая уменьшается с увеличением числа ароматических колец, входящих в состав ПАУ. Так растворимость в воде нафталина составляет 34 миллиграмм на литр, фенантрена — 1.3 миллиграмма на литр (Shuttlworth, Cerniglia, 1996). Деструкция ПАУ начинается включением кислорода в молекулу субстрата в результате монооксигеназной/диоксигеназной атаки ароматического кольца. Бактериальные ферменты типа ди- и монооксигеназ являются ключевыми в атаке ароматических колец, образуя нестабильные структуры (диолы), которые легко подвергаются последующим превращениям другими ферментами. В ходе дальнейшего подготовительного метаболизма образующиеся дигидроксилированные ПАУ также подвергаются включению молекулярного кислорода, что приводит к разрыву ароматической структуры. Формирующиеся карбоксилированные соединения могут утилизироваться до интермедиатов цикла Кребса и включаться в основной обмен (Harayama, Rekik, 1989, 1997; Smith, 1990; Van derMeer, 1991, 1992]. Наиболее подробно изучены четыре возможных пути катаболизма нафталина аэробными бактериями: 1) неполное окисление нафталина до салициловой кислоты, с высвобождением пирувата и накоплением салициловой кислоты в ростовой среде; 2) полный катаболизм нафталина через салицилат с использованием мета-пути расщепления катехола; 3) полный катаболизм нафталина через салицилат с использованием opmo-пути расщепления катехола; 4) полный катаболизм нафталина через салицилат и гентизиновую кислоту. В общей «классической» схеме катаболизма нафталина выделяют три ключевых соединения: нафталин, как первое соединение различных метаболических путей, а также салициловую кислоту и катехол как «точки» дивергенции катаболических реакций. В соответствии с этим начальные ферменты катаболизма данных соединений - нафталин диоксигеназа (НДО), салицилат гидроксилаза, катехол-1,2-диоксигеназа и катехол-2,3-диоксигеназа названы ключевыми ферментами катаболизма нафталина (Smith, 1990). Подготовительный метаболизм нафталина проходит у разных бактерий по общему, «верхнему» пути биодеградации нафталина, в процессе которого нафталин через несколько этапов расщепляется до салициловой кислоты (рис. 1).
Бифенил 2,3-диоксигеназа - ключевой фермент разложения бифенила и хлорированных бифенилов
К настоящему времени наиболее полно изучены структура и функционирование генетических систем деградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas и близкородственных организмов. Известно, что гены, кодирующие ферменты деструкции нафталина, могут иметь хромосомальную или плазмидную локализацию (Воронин, Цой, 1989; Кошелева и др., 2003; Измалкова и др., 2005; Boronin, 1992; Denome et al, 1993; Simon et al, 1993; Eaton, 1994; Bosch et al, 1999, 2000; Takizawa et al, 1994, 1999; Dennis, Zylstra, 2004; Sevastsyanovich et al, 2008).
Гены разложения нафталина (wa/z-гены) штамма P. putida G7, кодирующие ферменты окисления нафталина и салицилата, объединены в два оперона, расположенных в NAH7 плазмиде, которая рассматривается как архетип для группы плазмид деградации нафталина и салицилата (Yen, Gunsalus,1982). Схема расположения генов, кодирующие конверсию нафталина в салицилат ("верхний" путь), представлена на рисунке 5. У штамма P. putida G7 ген, кодирующий ферредоксин редуктазу {nahAa), расположен перед геном, кодирующим ферредоксин (nahAb), за которым расположены два гена, кодирующих а- и р-субъединицы терминальной диоксигеназы {nahAc и nahAd). После генов НДО расположены гены, кодирующие нафталин г/мс-дигидродиол дегидрогеназу (nahB), салицилальдегид дегидрогеназу {nahF), 1,2-дигидроксинафталин диоксигеназу (nahC), неизвестную открытую рамку считывания (nahQ), wpflHc-o-гидроксибензилиденпируват гидратазу-альдолазу {nahE), и 2-гидроксихромен-2-карбоксилат изомеразу (nahD) (Simon et ah, 1993). Анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих ферменты "верхнего" пути, штаммов P. putida NCIB 9816-4, P. putida BS202, P. stutzeri AN10, Pseudomonas sp. СІ8, P. putida OUS82, P. aeruginosa PaKl и P. putida NCIB 9816, показал, что сходство последовательностей составляет около 90%; организация генов "верхнего" пути исследуемых штаммов аналогична tta/z-генам NAH7 плазмиды, за исключением штамма P. stutzeri AN 10, для которого описана делеция nahQ гена (Denome et al., 1993; Simon et ah, 1993; Eaton, 1994; Takizawa et ah, 1994, 1999; Bosch et ah, 1999). Эти гены получили название "классические иа/г-подобные гены". Полная нуклеотидная последовательность генов, кодирующих ферменты «нижнего» пути деструкции салицилата по пути мета расщепления катехола до пирувата и ацетилкоэнзима, определена для штаммов P. stutzeri AN10, P. putida G7 и P. putida NCIB 9816 (Harayama et al., 1989; Bosch et ah, 1999, 2000; Grimm, Harwood, 1999). Гены разложения нафталина "нижнего" пути штамма P. stutzeri AN10, кодирующие салицилат гидроксилазу (nahG), ферредоксин-подобный белок (nahT), катехол 2,3-диоксигеназу {nahH), гидроксимуконовый пулуальдегид дегидрогеназу (nahh), гидроксимуконовый альдегид гидролазу (nahN), 2-оксопент-4-еноат гидратазу (nahL), ацетальдегид дегидрогеназу (nahO), 2-оксо-4-гидроксипентаноат альдолазу {nahM), 4-оксалокротонат декарбоксилазу [паНК), и 4-оксалокротонат изомеразу (nahJ), имеют следующую организацию nahGTHINLOMKJ (Bosch et al., 2000). Для штамма AN 10 описан дополнительный ген салицилат гидроксилазы, nahW, который находится вне оперона "нижнего" пути (Bosch et al., 1999). Расположение генов нижнего пути у штамма P. putida G7 идентично таковому штамма AN 10, однако обнаружены еще два гена: nahX, кодирующий белок с неизвестной функцией, и nahY, кодирующий метил акцептирующий белок хемотаксиса, (рис. 5) (Grimm, Harwood, 1999). Предложена модель позитивной регуляции nah-геков (Воронин, Цой, 1989; Tropel, van der Meer, 2004).
Исследован генетический контроль разложения нафталина через гентизат для штамма Ralstonia sp. U2. nag-Оперон содержит гены деградации нафталина, соответствующие генам "верхнего" пути окисления нафталина штамма P. putida G7, в том же порядке (nagAaGHAbAcAdBFCQEDJIKLMN), за исключением двух дополнительных открытых рамок считывания между генами nagAa и nagAb, обозначенных nagG и nagH и ответственных за синтез структурных субъединиц салицилат 5-гидроксилазы (рис. 5). Гены nagl, nagK и nagL кодируют ферменты катаболизма гентизата в фумарат и пируват: гентизат 1,2-диоксигеназу, фумарилпируват гидроксилазу, малеилпируват изомеразу, соответственно. Функция белков - продуктов генов JMN не ясна. Ген, кодирующий регуляторный белок, и ген хемотаксиса расположены перед геном nagAa. Все гены, расположены на 18 т.п.н. регионе, который регулируется транскрипционным регулятором LysR-типа по описанной для nah-тепоъ модели (Fuenmayor et al., 1998; Zhou et ah, 2001, 2002; Jones et al, 2003).
Таким образом, сравнение структурной организации генов, контролирующих конверсию нафталина в салицилат, штаммов P. putida G7 и Ralstonia sp. U2 показало ее сходство. Кроме того, транскрипция гена nagR осуществляется в направлении противоположном транскрипции функциональных генов. Также необходимо отметить, что для обоих штаммов предложена модель позитивной регуляции. Эти данные указывают на наличие общего анцестора (Jones et al, 2003).
Метаболические пути и генетические системы деструкции ХБК у бактерий
Для БДО В. xenovorans LB400 характерна широкая субстратная специфичность по отношению к ПХБ, содержащим более шести атомов хлора в качестве заместителей (Mondello, 1989). Активность БДО по отношению к различным изомерам ПХБ уменьшается от незамещенного кольца к орто-, а затем - лгета-замещенным кольцам. /ад/?а-Хлорированные кольца слабо подвергаются окислению, а 4,4 -дихлорбифенил практически не трансформируется бифенил диоксигеназой В. xenovorans LB400 (Arnett et al., 2000). Бифенил диоксигеназа В. xenovorans LB400 осуществляет диоксигеназную атаку не только орто- и мета- углеродов, но так же и метать пара- углеродов кольца молекулы ПХБ: 2,5,2 ,5 -тетраХБ подвергается 3,4-диоксигенированию (Haddock et al., 1995). Бифенил 2,3-диоксигеназа осуществляет гидроксилирование замещенного и незамещенного атомов углерода 2,2 - и 2,4 -диХБ в орто- и мета- положении с ор/ио-дехлорированием (Seeger et al., 1995; 1999). Дибензофуран и дибензо-/?-диоксин, которые являются аналогами ди-орто-замешенных бифенилов и дифенильных эфиров, соответственно, атакуются в «квази орто-» и в соседнем положении, в то время как окисление углового атома углерода -реакция, характерная только для специализированных диоксигеназ, участвующих в деградации дибензо-р-диоксина и дибензофурана (Armengaud etal., 1998).
БДО P. pseudoalcaligenes KF707 характеризуется узкой субстратной специфичностью. Она не способна осуществлять ортяо-дехлорирование, но катализирует 5,6-диоксигенирование 2,2 -дихлорбифенила с низкой активностью (Suenaga et ah, 2002). Однако она проявляет высокую активность по отношению к 4,4 -дихлорбифенилу (Erickson, Mondello, 1993). Сравнение аминокислотных последовательностей двух описанных выше ферментов показало высокий уровень гомологии между ними: 95.6% для а-субъединиц и 99.5% - для р-субъединиц терминальной диоксигеназы, 100% - для ферредоксина и ферредоксин редуктазы (Kimura et al., 1997). Каталитический центр фермента расположен на а-субъединице терминальной диоксигеназы. а-Субъединица диоксигеназы P. pseudoalcaligenes KF707 отличается 19 аминокислотными остатками и одной делецией по глицину от а-субъединицы В. xenovorans LB400 (Suenaga etal., 2001, 2005). Выделены штаммы, отличающиеся по субстратной специфичности от вышеописанных групп бактерий. Так, БДО Comamonas testosteroni В-356 и Rhodococcus globerulus Р6 предпочтительнее окисляли л/ета-замещенные кольца бифенила, чем гсара-замещенные, и слабо трансформировали дважды о/?тозамещенные изомеры (McKay et ah, 1997; Hurtubise et al., 1998). При этом анализ аминокислотной последовательности а- и Р-субъединиц диоксигеназы штамма С. testosteroni В-356 показал лишь 76% и 70% идентичности соответствующим субъединицам БДО В. xenovorans LB400 (Imbeaultefa/., 2000). Субстратная специфичность БДО непосредственно связана со структурой фермента, и особенно его активного центра. Среди представителей подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ осуществлена кристаллизация и рентгено-структурный анализ терминального компонента бифенил 2,3-диоксигеназы Rhodococcus sp. RHA1 (Furusawa et al, 2004) и Sphingobhim yanoikyae Bl (Ferraro et al., 2007). Терминальная оксигеназа БДО S. yanoikyae Bl представляет собой грибовидную структуру, где три а-субъединицы образуют «шляпку», а три (3-субъединицы - «ножку» «гриба». а-Субъединица состоит из 454 аминокислотных остатков (АКО), которые образуют два домена. N-концевой домен состоит из р-тяжей и петель и включает в себя железо-серный кластер Риске [2Fe-2S] (с 40 по 140 АКО). Два остатка гистидина и два цистеина координируют атомы железа и серы, входящие в этот кластер. С-концевой домен включает каталитический карман, в котором находится мононуклеарное железо, координированное двумя остатками гистидина (His-207 и His-212) и одним остатком аспарагиновой кислоты (Asp-360) (Ferraro et al., 2007). Предполагается, что размер и форма каталитического кармана напрямую влияет на спектр окисляемых ферментом субстратов и на эффективность взаимодействия, в зависимости от того, насколько оптимально зафиксирован субстрат в каталитическом кармане для осуществления гидроксилирования тех или иных атомов углерода (Jaconcic et al., 2007).
Работы по моделированию структуры активных центров бифенил 2,3-диоксигеназ штаммов В. xenovorans LB400 и P. pseudoalcaligenes KF707, направленному мутагенезу БДО, конструированию гибридных диоксигеназ методом случайной рекомбинации участков кодирующих их генов, позволили выявить некоторые закономерности во взаимосвязи структуры и функции фермента (Suenaga et al., 2001, 2002, 2005; Zielinski et al., 2002, 2003, 2006; Furukawa, 2000; Vezina et al, 2007; Furukawa, Fujihara, 2008). В частности, были выявлены аминокислотные остатки (АКО), свойства которых определяют субстратную специфичность фермента. Например, известно, что мутация Thr-376-Asn а-субъединицы БДО P. pseudoalcaligenes KF707 придает ей свойства диоксигеназы В. xenovorans LB400: расширяется спектр трансформируемых ею изомеров ГГХБ. Напротив, в случае мутации Ile-335-Phe в а-субъединице БДО из штамма В. xenovorans LB400 фермент приобретает способность к окислению яара-хлорированных бифенилов (Kimura et al., 1997; Suenaga, 2002). Тем не менее, во многих случаях, АКО, которые не контактируют непосредственно с субстратом и находятся далеко от активного центра фермента, оказывают значительное влияние на его структуру. Средние и дальние взаимодействия АКО в белковой молекуле, оказывающие опосредованное влияние на субстратную специфичность фермента очень часто слабо предсказуемы (Zielinski et al, 2003).
Деструкция 4-метилбензойной кислоты (МБК) R. ruber Р25, ключевые ферменты катаболизма МБК
Для участков генов fcbA и fcbB штамма Arthrobacter sp. Н4 обнаружено 100% сходство с гомологичными последовательностями большинства бактерий рода Arthrobacter. Уровень гомологии участка гена fcbA R. ruber Р25 с генами, кодирующими 4-хлоробензоат-КоА-лигазу, бактерий A. globiformis КЗТ1, A. ramosus FG1, Arthrobacter sp. SU, Arthrobacter sp. TM1 составил 98-99%; с гомологичным геном Arthrobacter sp. FHP1 - 95%. Обнаружено 98-99% сходство участка гена fcbB штамма R. ruber Р25 с гомологичными нуклеотидными последовательностями, кодирующими 4-хлоробензоат-КоА-дегалогеназу известных представителей рода Arthrobacter (рис. 42). В литературе не описано фактов присутствия /сб-генов у природных бактерий рода Rhodococciis. Следует отметить, что штамм R. ruber Р25, способный полностью разлагать 4моноХБ/4ХБК и деструкторы 4ХБК рода Arthrobacter (штаммы Н4, Н5), выделены из одних и тех же почв, загрязненных отходами производства галогенированных соединений (г. Пермь). Известно, что гены, контролирующие деструкцию 4ХБК, могут входить в состав плазмид и транспозонов (Wyndham, 1999), кроме того,ус-гены бактерий рода Arthrobacter успешно экспрессируются в клетках бактерий рода Rhodococcus (Rodrigues et aL, 2006). Таким образом, не исключена возможность горизонтального переноса кластера генов fcb между бактериями почвенной экосистемы, находящейся под высоким селективным давлением галогенсодержащих поллютантов. 7.3. я/го-Гены, контролирующие окислительное дегалогенирование 0/?то-замещенных хлорбензоатов, штамма Pseudomonas aeruginosa 142
Другим механизмом первичной атаки хлорбензойных кислот является окислительное дегалогенирование, описанное для ряда бактерий-деструкторов 2ХБК рода Pseudomonas (Зайцев, Карасевич, 1984; Fetzner et aL, 1992), в том числе P. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993).
В нашей работе были клонированы и охарактеризованы ohb-теиы, контролирующие отщепление галогена из opwo-положения до расщепления ароматического кольца, штамма деструктора 2ХБК и 2,4диХБК P. aeruginosa 142. На основе вектора широкого круга хозяев pSP329 в клетках Е. coli DH5aF была создана клонотека генов тотальной ДНК P. aeruginosa 142, среди 3700 клонов которой обнаружены 2 клона, осуществляющие превращение 2ХБК в катехол и 2,4диХБК -в 4 хлоркатехол. На основании полученных результатов был сделан вывод, что в рекомбинантных плазмидах pOD33 и pOD22, содержащихся в этих клонах, присутствуют о/гб-гены орто галобензоат 1,2-диоксигеназы (ОГБД) (рис. 12). Плазмида pOD33, содержащая вставку ДНК около 6 т.п.н. и стабильно поддерживающаяся в клетках Е. coli, была взята для дальнейших исследований. Далее, путем субклонирования плазмиды pOD33 с использованием экзонуклеазы ВаВ 1 была получена плазмида рЕ43 со вставкой ДНК размером 3.7 т.п.н., проявляющая наибольший уровень экспрессии оЬЬ-тсиов в клетках Е. coli, которая была трансформирована в клетки P. putida mt-2 (штамм РВ2440) (Bagdasarian et al, 1981). Рекомбинантный штамм P. putida PB2440(pE43) приобрел новые свойства: рос на 2ХБК как единственном источнике углерода и энергии при концентрации субстрата до 2 мМ (рис. 43). Кроме того, в опытах с «отмытыми» клетками была показана способность штамма окислять дихлорированные субстраты - 2,4диХБК, 2,5диХБК и 2,6диХБК (рис. 44).
Определена нуклеотидная последовательность вставки ДНК плазмиды pOD33 размером 6052 п.н. (GenBank AF121970, см. Приложение). Обнаружены 6 открытых рамок считывания, в том числе генов ohbB, ohbA, кодирующих большую и малую субъединицы терминальной диоксигеназы, соответственно (рис. 45). Кроме того, обнаружен регуляторный ген ohbR, транслируемый им белок относится к регуляторным белкам IclR-типа (Tropel, van der Meer, 2004). Интересен факт, что ог//ю-галобензоат 1,2-диоксигеназная активность проявлялась в отсутствие генов, кодирующих ферредоксин и редуктазу, предполагается, что терминальная оксигеназа ОГБД использует электрон-транспортную систему, синтезируемую различными бактериями-хозяевами. Терминальная оксигеназа, кодируемая генами ohbB и ohbA, образует отдельный филогенетический кластер, который включает ароматические оксигеназы нетипичной структурно-функциональной организации и отличающиеся от других членов семейства ароматических диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000; рис. 8)
В составе клонированной вставки была обнаружена открытая рамка считывания ORF5 (ohbC); функция транслируемого полипептида массой 48 969Да неизвестна (рис. 46). Кроме того, анализ нуклеотидной последовательности показал, что ohb-тены фланкированы 18739#-подобными инсерционными последовательностями, в состав транспозона входили гены tnpA и top, кодирующие транспозазу А и топоизомеразу МП, соответственно. Было обнаружено, что весь «о/гб-регион» ограничен инвертированными повторами размером 14 п.н. в позициях (56 - 69) и (5984 - 5997) (GenBank AF121970, см. Приложение).
