Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Общая характеристика пурпурных бактерий и их рост в разных условиях
1.1. Характеристика пурпурных бактерий 9
1.2. Факторы, влияющие на рост пурпурных бактерий. 13
1.2.1. Доноры электронов, источники энергии и углерода 13
1.2.2. Источники азота 17
1.2.3. Интенсивность света 19
1.2.4. Температура и значение рН 20
ГЛАВА II. Регуляция синтеза и активности ферментов, участвующих в метаболизме водорода и азотфиксапии
II.I . Гидрогеназа 22
II.2. Нитрогеназа 29
II.3. Взаимосвязь меаду нитрогеназой и гидрогена-
зой * 34
ГЛАВА III. Методы культивирования фототрофных микроор ганизмов 36
Экспериментальная часть
ГЛАВА ІV. Объекты и методы исследований
ІV.І. Объекты исследований 42
ІV.2. Аппаратура и техника культивирования . 42
ІV.З. Алгоритмы программ, управляющих работой установки с микро-ЭВМ I5BCM-5 52
ІV.4. Культивирование 59
ІV.4.І. Выращивание посевного материала 59
ІV.4.2. Культивирование бактерий 61
ІV.5. Вычисление экономических коэффициентов использования субстратов 64
ІV.6. Измерение содержания различных соединений в среде 64
ІV.7. Определение гидрогеназной и нитрогеназной активностей клеток 65
ІV.8. Другие определения 67
ГЛАВА V. Рост rhodopseudoraonas capsulata в разных условиях
V.І. Температура и значение рн 69
V.2 . Интенсивность света 72
V.З. Рост в фотоавтотрофных условиях в зависимости от концентрации Е^ 72
V.4. Эффективность использования лактата 73
V.5. Скорость роста Rh.capsulata на разных средах при освещении и в темноте 76
V.6. Рост в миксотрофных условиях 80
V.7. Оценка выхода биомассы Rh.capsulata в оптимальных условиях роста 81
ГЛАВА VІ . Влияние условий выращивания на метаболизм водорода и азотфиксацию
VІ.І. Гидрогеназная и нитрогеназная активности клеток при росте в фотогетеротрофных и фото
автотрофных условиях 86
VІ.2. Гидрогеназная и нитрогеназная активности клеток, выросших в темноте при разных р02 96
VІ.З. Гидрогеназная и нитрогеназная активности при росте культур на средах с разными источниками азота 98
VІ.4. Гидрогеназная и нитрогеназная активности клеток в зависимости от интенсивности света 103
VІ.5. Гидрогеназная и нитрогеназная активности клеток, выросших при разных температурах 106
VІ.6. Гидрогеназная и нитрогеназная активности клеток, выросших при разных значениях рй 108
VІ.7. Взаимосвязь гидрогеназы и нитрогеназы НО
VІ.8. Скорости образования Hg и азотфиксации в разных условиях культивирования ИЗ
Обсуждение результатов 115
Выводу 128
Жеература 131
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время все большее внимание исследователей привлекают разные фототрофные микроорганизмы, в том числе пурпурные бактерии. Изучение пурпурных бактерий оказалось весьма полезным для познания первичных реакций фотосинтеза, а также некоторых других биологически важных процессов. К числу таковых относятся фиксация молекулярного азота и образование молекулярного водорода.
Успехи, достигнутые в изучении фототрофных микроорганизмов, сделали реальным их практическое использование для получения кормового белка и других продуктов жизнедеятельности, в том числе аммиака на основе ассимиляции молекулярного азота, а также молекулярного водорода в целях возобновления энергетических ресурсов. Представляют также интерес некоторые ферменты, образуемые пурпурными бактериями, прежде всего такие как гидрогеназа и нитрогеназа, участвующие в метаболизме водорода и азотфиксации.
Для решения теоретических и фундаментальных проблем, требующих исследования пурпурных бактерий, большое значение имеет разработка методов их интенсивного культивирования. До сих пор такие работы проводились в основном в отношении микроформ водорослей и пианобактерий. Значительно менее совершенны методы культивирования пурпурных и зеленых фототрофных бактерий. Это ограничивает возможности получения биомассы данных микроорганизмов, а также их метаболитов как для научных, так и для практических целей.
Дели и задачи -работы. Целью данной работы было оптимизация условий роста пурпурных бактерий в проточных условиях, а также изучение регуляции синтеза ими ферментов, участвующих в метаболизме молекулярного водорода и азотфиксации при изменении разных факторов среды. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
I. Изготовить установки для непрерывного культивирования
фототрофных микроорганизмов и освоить выращивание пурпурных бактерий в различных режимах их работы.
Оптимизировать условия для роста пурпурной несерной бактерии Rhodopseudomonas capsulata, а также синтеза ЄЮ гидрогеназы и нитрогеназы.
Дать Оценку Скоростей Образования Rh.capsuiata МОЛекуляр-
ного водорода в разных условиях роста.
Научная новизна. В результате проведенной работы изготовлена установка для непрерывного управляемого культивирования фототрофных микроорганизмов, в которой основные функции контроля и управления процессом выращивания переданы микро-ЭВМ I5BCM-5. Разработаны алгоритмы и составлены программы управления работой установки в режимах периодического и непрерывного культивирования некоторых пурпурных бактерий. На основе определения зависимости скорости роста Rh.capsuiata от разных факторов среды и экономических коэффициентов использования разных субстратов установлены условия, обеспечивающие высокий выход биомассы, а также активный синтез гидрогеназы и нитрогеназы. Показано, что биосинтез гидрогеназы И НИТрогенаЗЫ у Rh.capsuiata ПРОИСХОДИТ неКООрЦИНИроваННО.
Установлено, что синтез гидрогеназы у Rh.capsuiata в присутствии органических соединений снижается и регулируется в основном по типу репрессии-дерепрессии. Обнаружено, что синтез и активность гидрогеназы Rh.capsuiata зависят также от концентрации кислорода
В Среде. Синтез НИТрогенаЗЫ ВОЗМОЖеН НЄ ТОЛЬКО При рОСТе Rh.capsuiata в условиях азотфиксации, но и при лимитировании nh^, а также в присутствии Щ)^.
Практическая ценность работы. Изготовленная установка для управляемого непрерывного выращивания пурпурных бактерий может явиться основой для разработки управляемых культиваторов разных фототрофных микроорганизмов при их практическом применении. По-
_ 8 -
добранные условия выращивания пурпурных бактерий используются в лаборатории метаболизма фототрофных микроорганизмов Института почвоведения и фотосинтеза АН СССР для получения большого количества биомассы этих микроорганизмов с высоким выходом ферментов (гидрогеназы, нитрогеназы, НАД- и НАДФ-редуктаз), исследование которых ведется в ряде учреждений в целях оценки их практического использования, в частности для использования в биохимических топливных элементах и получения молекулярного водорода в целях возобновления энергетических ресурсов.
Аттрпбят^я работы. Основные материалы диссертации докладывались на Всесоюзных Баховских коллоквиумах по биологической фиксации азота (Чернигов, 1980; Тбилиси, 1983), конференции молодых ученых "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ" (Рига, 1981), Всесоюзном совещании "Анаэробные микроорганизмы" (Пушино, 1982), Международном симпозиуме "Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (Пущино, 1983).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, в которых рассмотрены основные литературные данные и результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит Т51 страницу машинописного текста, 18 рисунков и 32 таблицы. Список литературы включает Т87 наименований.
Характеристика пурпурных бактерий
Пурпурные бактерии представляют одну из пяти известных групп фототрофных прокариот. Они являются типичными представителями водной микрофлоры и растут как в пресных, так и в соленых водоемах. Все известные пурпурные бактерии одноклеточные и грам-отрицательны, имеют сферическую, палочковидную или извилистую форму. Осуществляют фотосинтез без выделения кислорода, поскольку имеют, в отличие от высших растений, водорослей и цианобакте-рий, одну фотосистему и не используют воду как донор электронов. Такую функцию у пурпурных бактерий выполняют сероводород, тиосульфат, элементарная сера, молекулярный водород или органические соединения. Способность этих микроорганизмов к фотосинтезу обусловлена наличием бактериохлорофилов "а" или "Ъ". Наряду с бактериохлорофиллом пурпурные бактерии образуют разные кароти-ноиды, которые обуславливают цвет их культур и выполняют свето-собирающую и защитную (от действия 02) функции. Пигменты у пурпурных бактерий обычно локализуются во внутриклеточных мембранах, где и осуществляются начальные стадии фотосинтеза (pfennig, 1977, 1978; Pfennig, Triiper, 1978; Thornber et al., 1978; СТЄЙ-шер И др., 1979). Все пурпурные бактерии ВХОДЯТ В ПОРЯДОК Rhodospirillales (pfennig, Triiper, 1974, 1978) и разделены на два семейства: серные (Chromatiaceae) И несерные (Rhodospirillaceae). Пурпурные серные бактерии способны расти на минеральных средах с сульфидом, серой и тиосульфатом в качестве донора электронов и угле 10 кислотой как источником углерода, то есть являются фотоавтотро-фами. В присутствии сульфида или тиосульфата внутри или вне клеток откладывается элементарная сера, которая затем окисляется до Сульфата. В ОТЛИЧИе ОТ Chromatiaceae ЛИШЬ некоторые ВИДЫ пурпур ных несерных бактерий способны расти в автотрофних условиях за счет использования сульфида, тиосульфата или H2 как доноров электронов. Но при этом элементарная сера не является промежуточным продуктом его окисления или образовавшаяся сера далее до сульфата не окисляется (Pfennig, Truper, 1974, 1978).
Ряд представителей пурпурных бактерий растут на свету, окисляя молекулярный водород и восстанавливая при этом углекислоту. Такая возможность показана для Thiocapsa roseopersicina (Богоров, 1974), Rhodopseudomonas acidophila и Rh.tenue (Siefert, Pfennig, 1978; pfennig, 1978). В присутствии некоторых витаминов способность к использованию в качестве доноров электронов & при росте В фОТОТрофНЫХ УСЛОВИЯХ ПРОЯВЛЯЮТ Также Rhodospirillum rubrum (Anderson, Puller, 1967), Rh.palustris (Quadry, Hoare, 1968), Rh. capsulata (Klemme, Schlegel, 1967) И Rh.gelatinosa (Pfennig, Trii-per, 1974). Некоторые представители пурпурных серобактерий нуждаются при росте в витамине Bj2. Но часть их не требует наличия каких-либо витаминов. Напротив, большинство пурпурных несерных бактерий являются ауксотрофами. Так, R.rubrum обычно нуждается в биотине, Rh.palustris - в Пара-амиНОбеНЗОЙНОЙ КИСЛОТе, Rh.capsulata - В ТИаМИНе, Rh.gelatinosa - В ТИЭМИНе И бИОТИНе, Rh.sphaeroides - в тиамине, биотине и никотиновой кислоте (Кондратьева, 1972). Однако потребность в витамине может быть неодинаковой у разных штаммов одного вида (weaver et ai., 1975), а также изменяться у одного и того же штамма в зависимости от условий культивирования (Siefert, Pfennig, 1980). II Хотя ряд пурпурных бактерий способен к автотрофии, многие из них лучше обычно растут в присутствии органических веществ, которые могут выполнять различные функции: донора электронов при фотоассимиляции углекислоты; источника углерода; одновременно донора электронов, а также источника углерода; источника энергии и углерода (Кондратьева, 1972; Кондратьева, Горленко, 1978).
Различные пурпурные бактерии обладают неодинаковой способностью к использованию органических соединений. Более широкие возможности в этом отношении имеют пурпурные несерные бактерии. Они обычно лучше растут на средах с органическими соединениями. К числу органических соединений, которые могут использоваться пурпурными бактериями, относятся некоторые спирты, сахара, аминокислоты и органические кислоты. Особенно часто пурпурные бактерии используют ацетат, пируват, малат и лактат (sojka, 1978). Часть пурпурных серобактерий используют органические соединения в качестве доноров электронов, но чаще они ассимилируют их лишь как дополнительный источник углерода (Кондратьева, Горленко, 1978), тогда как пурпурные несерные бактерии используют обычно органические соединения и как источник углерода, и как донор электронов (Кондратьева, 1972).
До недавнего времени считалось, что рост пурпурных серобактерий облигатно связан с наличием света, и они являются строгими анаэробами. Однако исследования, проведенные с Ectothiorhodospira shaposhnikovii (Успенская, Кондратьева, 1972), T.roseopersicina (Богоров, 1974), Lamprobacter modestohalophilus (Горленко И др., 1979) и Ect.mobiiis (Красильникова и др., 1980), показали, что эти микроорганизмы способны расти, хотя и с низкой скоростью, в темноте, окисляя органические соединения кислородом. Некоторые представители Chromatiaceae, а ИМЄННО T.roseopersicina (Богоров, 1974), Amoebobacter roseus (Горленко, 1974), L.modestohalophilus (Горленко И др., 1979), Cminus, C.violascens, C.gracile И Thio-cystis violacea (Kampf, Pfennig, 1980) способны расти И В ХЄМ0ЛИ-тоавтотрофных условиях за счет окисления тиосульфата кислородом.
Большинство пурпурных несерных бактерий способны расти в хе-мзгетеротрофных условиях при низком парциальном давлении кислорода, но отдельные представители этих микроорганизмов растут и при атмосферном давлении кислорода (Pfennig, Truper, 1974). Такие виды, как R.rubrum (Sch on, Biederman, 1973) И Rh.capsuiata (Madigan, Gest, 1978; Schultz, Weaver, 1982) СПОСОбНЫ K росту В ТЄМНОТЄ В анаэробных условиях в присутствии глюкозы или других органических соединений, переключаясь с фотосинтеза на получение энергии в результате брожения или анаэробного дыхания. Возможность роста в темноте в анаэробных условиях на среде, содержащей пируват, пептон и дрожжевой экстракт, показана также для четырех штаммов Rh.geiainosa (Uffen, 1978).
Такие представители пурпурных несерных бактерий как Rh.acido-phiia и Rh.capsuiata способны расти и в темноте в микроаэробных условиях, окисляя молекулярный водород (siefert, pfennig, 1979). Лучшим источником азота для разных видов пурпурных бактерий обычно является аммоний. У многих пурпурных бактерий обнаружена способность к азотфиксации (Кондратьева, Гоготов, 1981). Долгое время считали, что азотфиксация у пурпурных бактерий облигатно связана с фотосинтезом (Meyer et ai., 1978). Однако недавно установлено, ЧТО Rh.acidophila 7050, Rh.capsuiata КЪ1, R.rubrum На, Rh.sphaeroides 17023, Rh.gelatinosa И Rh.palustris способны к росту в хемогетеротрофных микроаэробных условиях в присутствии Пр как единственного источника азота (siefert, Pfennig, 1980). Таким образом, фиксация этими микроорганизмами молекулярного азота не требует обязательного наличия света. Но ее низкие скорости или отсутствие в аэробных хемогетеротрофных условиях связаны, по-видимо ІЗ му, с высокой чувствительностью нитрогеназы к 02 и продуктам его ВОССТаноВЛеНИЯ (Robson, Postgate, 1980). Способность к ассимиляции нитратов у пурпурных бактерий проявляется редко. Показано, ЧТО Rh.sphaeroides 2R И 3R, а также Ect.mobilis 8115 не растут на нитрате во всех испытанных условиях (Кондратьева, Красильникова, 1981). В то же время R.rubrum штамм S1 (Katch, 1963), Rh.acidophila 7050 (Herbert et al., 1978), a также Некоторые ШТаММЫ Rh.capsulata (Khanna et al., 1980; КОНД ратьева, Красильникова, 1981; Alef, Kleiner, 1982) способны использовать нитрат для роста в фототрофных условиях в качестве единственного источника азота. Кроме того, R.rubrum S1 может расти на среде с нитратом и в аэробных хемогетеротрофных условиях (Katch, 1963).
. Гидрогеназа
Название "гидрогеназа" было дано ферменту, катализирующему реакцию ПОГЛОЩеНИЯ Н2 (Stephenson, Stiokland, 1931), более Пятидесяти лет назад. Позднее было показано, что гидрогеназы многих микроорганизмов способны катализировать in vivo не только поглощение H2, НО И его выделение (Roelofsen, 1935; Nakamura, 1937; Mortenson, Chen, 1974), то есть осуществляют такую обратимую реакцию: По имеющимся в настоящее время сведениям гидрогеназы катализируют, кроме ТОГО, Обменные реакции С Дейтерием (Krasna, Ritten-berg, 1954) и тритием (Krasna, 1978), а также конверсию пара-во-ДОрода В орто-ВОДОрод (Anand, Krasna, 1965). В последние годы интерес к гидрогеназам значительно возрос не только в связи с познанием механизма катализа образования и окисления водорода, но и возможностями их практического использования, в частности для получения Н2 и как катализаторов реакций гидрирования в биохимических топливных элементах и регенерации некоторых кофакторов (Кондратьева, Гоготов, 1981). Поэтому, существенное внимание в ряде лабораторий стали уделять исследованию регуляции синтеза и активности гидрогеназ у разных микроорганизмов. Однако сведений в данном отношении пока сравнительно немного. В основном они касаются аэробных водородных бактерий (schiegei, Eberhardt, 1972; Bowien, Schiegei, 1981). В гетеротрофных условиях роста синтез гидрогеназ у этих микроорганизмов варьирует в зависимости от вида и даже штамма, при 23 роды используемых органических субстратов, р02, фазы роста культур И других факторов. У Aloaligenes ruhlandii, Pseudoraonas saccharophila (Bowien, Schlegel, 1981), Nocardia opaca (Aggag, Schlegel, 1973), Arthrobacter sp. (Canevascini, Eberhardt, 1975)» Mycobacterium sp. (Aragno, Schlegel, 1978), а также Rhizobium japonicum (Maier et al., 1979), ВЫРОСШИХ В ПРИСУТСТВИИ некоторых органических субстратов, не наблюдается или обнаруживается очень НИЗКая актИВНОСТЬ ГИДрогенаЗ. При росте Ps.faciiis И Ai.eutrophus на средах с сукцинатом, пируватом или ацетатом синтез гидрогеназ значительно подавлялся во время экспоненциальной фазы роста культур. Однако при выращивании этих бактерий на средах с формиатом или глицерином активность гидрогеназ была такой же, как у клеток, растущих В автотрофних УСЛОВИЯХ (Bowien, Schlegel, 1981).
У Paracoccus denitrificans штамм 381 образование гидрогеназы репрессируется при росте культуры в присутствии фруктозы, глюко-ната, лактата, пирувата, сукцината и ацетата, но у других штаммов этой бактерии синтез данного фермента происходит независимо от наличия в среде органических соединений (Nokhai, schlegel, 1980). Синтез гидрогеназ у Ai.eutrophus (Schlegel, Eberhardt, 1972), X. autotrophicua (Pinkwart et al., 1979), Aquaspirillum autotrophicum (Bowien, Schlegel, 1981) наблюдается при росте культур на органических средах в отсутствие Н2- Исследования, проведенные с Al. eutrophus (Priedrich et al., 1981), показали, что при росте культур на средах с сукцинатом, пируватом или ацетатом синтез как растворимой, так и связанной с мембранами гидрогеназ в экспоненциальной фазе репрессирован. В отличие от этого, при выращивании Ai.eutrophus на средах с фруктозой или цитратом уровень гидрогеназ составляет около 50% от такового в клетках, выросших в автотрофних условиях. В стационарной фазе, когда органический субстрат практически полностью потребляется, уровень гидрогеназы у Ps.facilis И Al.eutrophus Значительно возрастает (Bowien, Schle-gel, 1981).
При одновременном наличии в среде 1 и некоторых органических соединений содержание гидрогеназы у Rz.japonicum, по сравнению с клетками, выросшими в автотрофных условиях, снижается (Simpson et al., 1979). У Aq.autotrophics уровень ЭТОГО фермента ЗавИСИТ ОТ природы используемого органического субстрата (Aragno, schiegei, 1978). Одновременное присутствие 2 и лактата в среде приводит у Al.eutrophus (Rittenberg, Goodman, 1969) И P.denitrifleans 381 (Nokhai, Schiegei, 1980) к снижению гидрогеназной активности по сравнению с клетками, выросшими в автотрофных условиях. В процессе роста в гетеротрофных условиях органические соединения используются водородными бактериями как источники энергии, углерода и доноры электронов. Исследования, проведенные с Al. eutrophus Н16, показали, что дерепрессию синтеза гидрогеназ вызывает лимитирование роста культуры не энергией или источником углерода, а донором электронов (Friedrich, 1982). Так, значительное увеличение синтеза гидрогеназы у данной бактерии наблюдается при лимитировании роста культуры водородом. При этом синтез растворимой и связанной с мембранами гидрогеназ у этой бактерии происходит координирование. Таким образом, из имеющихся в настоящее время данных следует, что наличие Н2 в среде далеко не всегда обязательно для синтеза гидрогеназ водородными бактериями. Регулирующее действие на синтез гидрогеназы оказывает также содержание ( 2 в газовой фазе (Mortenson, Chen, 1974) и редокс-по-тенциал ростовой среды (wimpenny, 1969). Такие виды водородоки-СЛЯЮЩИХ бактерий, как Ps.facilis И Al.ruhlandii ПОЛНОСТЬЮ теряют гидрогеназную активность при росте в гетеротрофных условиях при высоком pOg. Однако при снижении содержания Оо в газовой фазе до Ъ% клетки Ps.facilis синтезируют значительные количества гидроге 25 назы (Rittenberg, 1969). У E.coli, при перенесении клеток из аэробных в анаэробные условия, происходит дерепрессия синтеза не только гидрогеназы, но также растворимой формиатдегидрогеназы и низкопотенпиального цитохрома с (Gray et al., 1966). Таким образом, у большинства микроорганизмов синтез гидрогеназы происходит в анаэробных условиях, и даже у некоторых аэробных микроорганизмов активность гидрогеназы значительно снижается при их росте при рС 2 5# (Кондратьева, Гоготов, 1981).
Объекты исследований
В промышленно выпускаемых ферментерах для выращивания хемо-трофных микроорганизмов не предусмотрена возможность проведения исследований с фототрофными микроорганизмами. Эти ферментеры имеют большой диаметр сосуда, что не позволяет равномерно освещать культуральную суспензию.
Нами был сконструирован и изготовлен ферментер для выращивания чистых культур фототрофных микроорганизмов в тонком (20 мм) освещаемом слое (рис.1). Ферментер состоит из вертикального прозрачного цилиндра (I), основания (2), которое одновременно является и теплообменником, крышки (3), на которой крепится магнитная муфта (4), с ведущим валом (5). В основании (2) имеется канал (6) с обратным клапаном (7) для подачи газовой смеси. На валу (5) установлена крыльчатка (8), выполняющая роль отбойника пены, и перемешивающее устройство (9), выполненное в виде полого цилиндра. Внутренняя полость перемешивающего устройства отделена от рабочего пространства ферментера герметичными прокладками (10). Между Рисі. Схема ферментера для выращивания фототрофных микроорганизмов. I - вертикальный прозрачный цилиндр; 2 - основание с теплообменником; 3 - крышка; 4 - магнитная муфта; 5 -ведущий вал; 6 - канал для подачи газовой смеси; 7 - обратный клапан; 8 - отбойник пены; 9 - перемешивающее устройство; 10 - герметичные прокладки; II - отбойники струй. перемешивающим устройством (9) и цилиндром (I) по периметру кольцевого зазора установлены отбойники струй (II) в количестве 6 штук, повышающие турбулентность движения культуры. Отбойники струй выполнены в виде пластин, установленных вдоль оси цилиндра перпендикулярно к направлению движения культуральной суспензии. Цилиндр (I) выполнен из стекла, остальные детали - из нержавеющей стали П8НІ0Т. Основание (2) и крышка (3) имеют 15 технологических штуцеров (на конструктивной схеме не указаны) для подачи среды, подключения контура рециркуляции (рис.2), заполнения ферментера инокулятом и т.д. В контур рециркуляции (рис.2), подсоединенный к ферментеру, подключены: ячейка для герметичной установки стерильных электродов (I), газоотделитель (2), два насоса (3), работающие от пневмоимпульсов, проточная кювета для измерения оптической плотности (4) и пробоотборник (5). Общий объем культуры, находящейся в неосвещенной части фбрепера между основанием (2) и нижним торцом перемешивающего устройства, а также в контуре рециркуляции среды составляет 200-250 мл, что не превышает 6-10$ от общего объема культуры.
Ферментер освещается двумя кварцево-галогенными лампами КГ220-1000-5, снабженными охлаждаемыми отражателями и набором экранов. При помощи экранов поверхностную освещенность ферментера можно изменять от 8»103 до 200»I03 эрг«см"2.сек"1 согласно измерениям термостолбиком под светофильтром СЗС-24. При выращивании в ферментере цианобактерии Sp.piatensis лампы КГ220-І000-5 заменяли десятью лампами ЛБ-20-5. Включая и выключая лампы раздельно, можно регулировать освещенность ферментера в диапазоне от 5-Ю3 до 40 Ю3 эрг-см"2»сек""1. При исследовании влияния условий культивирования на физиологические и биохимические свойства микроорганизмов необходимо поддерживать и регулировать ряд физико-химических параметров среды - — 5 3 І Ферментёр 2 , . І , U. і Рис.2. Контур рециркуляции культуральнои среда для измерения основных параметров процесса культивирования. I - ячейка для герметичной установки стерильных электродов; 2 - газоотделитель; 3 - насосы; 4 - проточная кювета для измерения оптической плотности; 5 -пробоотборник. в ферментере. Для решения этой задачи были изготовлены две установки для непрерывного культивирования фототрофных микроорганизмов. В одной из них (рис.3), в дальнейшем называемой установкой I, для управления процессом непрерывного культивирования использовали устройства локальной автоматики, представляющие собой позиционные регуляторы, жестко регулирующие параметры вокруг заданного значения. Установка I собрана на основе аппарата АК-10 (блоки 2-3, рис.3), изготовленного в СКБ ЕЛ АН СССР. В ее состав входят ферментер (I) с контуром рециркуляции культуральной суспензии (рис.2) и системой освещения, регулятор скорости оборотов мешалки (2), терморегулятор с датчиком температуры (3). При помощи рН-метра ЇЙ-340 с электродами для измерения рН (4) и милливольтметра рй-262 с электродами для измерения еН (5) происходит измерение рН и еН, соответственно. Значения рй, еН, температуры и оптической плотности, измеряемой при помощи нефелометра ФЭК-56 с интерференционным фильтром и проточной кюветой (6), записываются на самопишущем потенциометре КСП-4 (7) модификации 41.443.80.065. Самопишущий потенциометр сравнивает измеренные значения рй и оптической плотности с заданными и при необходимости включает требуемое реле времени (8), управляющее работой насосов (9). Насосы (9) подают в ферментер среду из бутыли (10), щелочь из бутыли (II) и кислоту из бутыли (12). Избыток культуральной суспензии поступает из ферментера в бутыль приема урожая (13) при помощи устройства слива по уровню. Требуемая газовая фаза в ферментере создается подачей в него газов, смешанных в определенных пропорциях при помощи прибора многокомпонентного дозирования газов ЩДГ 2401 (14), изготовленного в СКБ ЕЛ АН СССР. Установка позволяет вести в контролируемых условиях периодическое и непрерывное культивирование. Непрерывное культивирование Ar COg Воздух Рис.3. Установка I для непрерывного культивирования фототрофных микроорганизмов с локальной автоматикой. I - ферментер; 2 - регулятор скорости оборотов мешалки; 3 - терморегулятор с датчиком температуры; 4 - рй-метр рН-340; 5 - милливольтметр рН-262; 6 - нефелометр ФЭК-56 с проточной кюветой; 7 - самопишущий потенциометр КСП-4; 8 - реле времени, управляющие работой насосов; 9 - насосы; 10 - бутыль со средой; II - бутыль с щелочью; 12 - бутыль с кислотой; 13 - бутыль приема урожая; 14 - прибор многокомпонентного дозирования газов ШЩГ 2401. можно проводить как в режиме хемостата, так и турбидостата. Установка дает возможность измерять, а в режиме турбидостата и поддерживать оптическую плотность суспензии, измеряя ее при длине волны X = 630 им. Значение рН среды может поддерживаться с точностью ±0,1 единицы рН. Остальные характеристики соответствуют паспортным данным входящих в установку приборов.
За четырехлетний период работы данная установка зарекомендовала себя как простой и надежный прибор. Однако ей присущи недостатки, свойственные приборам с аналогичным принципом управления, например АНКУМ-2: для изменения условий культивирования требуется вмешательство исследователя, скорость протока среды и титрантов вычисляются только вручную, на что уходит много времени. Кроме того, в этой установке нельзя подавать какой-либо субстрат отдельно от среды. В то же время, при увеличении параметров регулирования растут габариты установки, возрастает ее стоимость, резко падает надежность системы.
В связи с этим была изготовлена установка, в дальнейшем называемая установка II, для непрерывного культивирования фото-трофных микроорганизмов, в которой большинство функций управления передано микро-ЭВМ I5BCM-5. Микро-ЭВМ управляет сбором данных, выполняет вычисления в реальном масштабе времени при обработке данных и на этапе принятия решения.
. Интенсивность света
Проведенные исследования показали, что наиболее быстрый рост Rh.capsuiata происходит в анаэробных условиях в режиме турбидо-стата на свету на среде с малатом (0,5$) с использованием аммония как источника азота (табл. II). Несколько медленнее культура растет в тех же условиях при использовании лактата. Из разных источников азота (ш, и2, ыор наиболее высокую скорость роста обеспечивает аммоний. При выращивании Rh.capsuiata в фотоавтотрофных анаэробных условиях с использованием 1 t С02 и аммония культуры растут несколько медленнее, чем в фотогетеротрофных условиях с использованием того же источника азота. Скорости роста Rh.capsuiata в фотогетеротрофных условиях при использовании лактата и аммония в периодической культуре (рис.10) и в режиме турбидостата (табл.11) совпадают. При выращивании Rh. capsuiata в периодической культуре в хемогетеротрофных микроаэ-робных условиях (рис.11) изменение оптической плотности происходит со СКОРОСТЬЮ вдвое большей, чем скорость роста культуры при выращивании бактерий в режиме турбидостата в тех же условиях (табл.11). Скорость изменения оптической плотности периодической культуры Rh.capsuiata, растущей в хемогетеротрофных условиях, равна скорости роста этой бактерии в фотогетеротрофных условиях. Однако при наблюдении в микроскоп было обнаружено, что клетки час 0,25 D,0.e, Рост Rh.capauiata в фотогетеротрофных условиях на среде с лактатом (0,4) и аммонием (0,125$) в периодическом режиме. I - оптическая плотность культуры ( J = = 610 нм), приведенная к длине оптического пути I см; 2 - скорость изменения оптической плотности. 6 т Происходит значительное увеличение отношения длины клеток к их диаметру. Поскольку в периодических условиях скорости увеличения оптической плотности и прироста биомассы клеток не всегда совпадают со скоростью их деления, то значения скорости роста могут оказаться завышенными. В стационарном состоянии в режиме турбидостата скорости роста, измеряемые по увеличению биомассы, белка и по скорости деления клеток, совпадают. Поэтому скорость роста, измеренная в режиме турбидостата в хемогетеротрофных условиях для Rh.capsulata, является наиболее достоверной. Скорость роста Rh.capsuiata в хемогетеротрофных условиях зависит от парциального давления растворенного кислорода (р02). С наиболее высокой скоростью культуры растут при парциальном давлении 02 около 0,001 атм (табл.10). Отсюда можно заключить, что Rh.capsuiata относится к микроаэрофилам.
Применение проточного культивирования позволило четко установить, что некоторые микроорганизмы способны одновременно использовать в качестве источника энергии и(или) источника углерода разные субстраты (Кондратьева, 1983), то есть проявляют способность к миксотрофии. В связи с этим было интересно выяснить, как отражается На росте Rh.capsuiata ОДНОВреМЄННОЄ НаЛИЧИе В Среде Н2, С02 и лактата. Устойчивый рост в анаэробных условиях на свету наблюдали при выращивании Rh.capsuiata в режиме хемостата с одновременным лимитированием водородом и лактатом. В пользу одновременного лимитирования культуры лактатом и водородом свидетельствует тот факт, что увеличение содержания лактата в подаваемой среде, так и Н2 в газовой фазе приводит к увеличению стационарной концентрации клеток в ферментере. При этом содержание лактата внутри ферментера не превышает 20 мкМ. Рост Rh.capsuiata в миксотрофных условиях возможен в довольно широком диапазоне скоростей протока (табл.12). Одновременное потребление Н2 и лактата наблюдается при всех исследованных скоростях протока. Количество образуемой в миксотрофных условиях биомассы значительно выше теоретически предсказанной, причем эта величина зависит от скорости протока. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что Rh.capsuiata способна к миксотрофии, то есть росту с одновременным использованием Н2 и лактата. Такой способ питания выгоден для Таблица 12 Примечание. Значения х и- даны для клеток, выросших в режиме хе мостата с лимитированием по аммонию (D = 0,083 час температура выращивания - 30С). Соотношение белка дано в % по отношению к сухой биомассе. При понижении температуры культивирования или отклонении рй среды от 7,0 экономический коэффициент использования аммония у Rh.capsuiata, измеренный как в расчете на белок, так и на вес сухой биомассы, снижается. Кроме того, при отклонении рй среды от 7,0 содержание белка в клетках повышается. Зная экономические коэффициенты по использованию бактериями субстратов, можно составить среды для получения наибольшей биомассы бактерий с учетом следующего требования для каждого соединения: где: X - требуемая концентрация клеток; 5- концентрация субстрата в подаваемой среде; Y - экономический коэффициент по использованию данного субстрата. Выполняя это требование и учитывая, что остаточная концентрация всех субстратов в ферментере должна значительно превышать константу насыщения культуры по субстрату, можно рассчитать производительность установки (Р) по следующему уравнению: P-D-X При определении максимальной производительности установки в случае выращивания Rh.eapsuiata концентрацию лактата и аммония поддерживали постоянной. Это достигалось путем увеличения их концентрации в подаваемой среде при повышении стационарной концентрации клеток в ферментере в соответствии с уравнением: с л. С - X + АХ 5 + АО у где: АО - изменение концентрации лактата и аммония в подаваемой среде; дХ - изменение стационарной концентрации клеток. Из полученных данных (табл.16) видно, что при стационарной концентрации клеток выше 300 мг/л скорость протока среды и, соответственно, скорость роста культуры начинает снижаться. Вследствие уменьшения скорости роста культуры производительность установки возрастает не прямо пропорционально увеличению стационарной концентрации клеток. Достигнув максимума при стационарной концентрации клеток 1350 мг/л она даже начинает снижаться. При сравнении данных, полученных при исследовании влияния интенсивности света на скорость роста Rh.eapsuiata (табл.6) и изучении производительности установки видно, что с увеличением стационарной концентрации клеток выше 300 мг/л скорость роста уменьшается из-за недостатка света.
