Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Образование хемотрофными микроорганизмами молекулярного водорода *. б
Глава 2. Ферментные системы, участвувщие в образовании молекулярного водорода микроорганизмами 19
Глава 3. Объект и методы исследования 35
3.1. Объект исследования 35
3.2. Среды и условия культивирования бактерий 35
3.3. Получение суспензий и экстрактов клеток 36
3.4. Методы анализов 37
3.4.1. Измерение молекулярного водорода 37
3.4.2. Формиатгидрогенлиазная активность 38
3.4.3. Формиатдегидрогеназная активность 39
3.4.4. Гидрогеназная активность 39
3.4.5. Определение питохромов 40
3.4.6. Энергизация мембран c.freundii 41
3.4.7. Определение биомассы 41
3.4.8. Определение белка 42
3.4.9. Определение формиата 42
3.4.10. Определение молекулярного кислорода 42
3.4.11 Определение нитритов 43
3.4.12. Определение рн среды 43
3.5. Иммобилизация клеток c.freundii 43
Глава 4 . Рост c.freundii в разных условиях и образование молекулярного водорода 44
Глава 5. Активность ферментов формиатгидрогенлиазного комплекса в зависимости от условий роста культур
5.1. Формиатдегидрогеназная активность 65
5.2. Гидрогеназная активность 68
Глава 6 . Состав цитохромов 79
Глава 7. Стабилизация формиатгидрогенлиазной системы 85
Обсуждение результатов 88
Выводы 94
Список сокращений 97
Список литературы 98
- Среды и условия культивирования бактерий
- Определение питохромов
- Определение рн среды
- Формиатдегидрогеназная активность
Введение к работе
Роль молекулярного водорода в обмене веществ разных микроорганизмов особенно интенсивно стала изучаться в последние годы. В значительной степени это объясняется тем, что некоторые микроорганизмы, выделяющие и (или) поглощающие Е^ представляют интерес для получения биомассы, богатой белком и такого фермента как гидрогеназа, который может применяться в качестве катализатора в топливных элементах, а также при производстве некоторых других практически важных продуктов. Большой интерес проявляется к водородобразующим микроорганизмам в связи с проблемой возобновления энергетических ресурсов, поскольку молекулярный водород рассматривается как перспективное топливо. Важное практическое значение имеет использование смешанных культур микроорганизмов, содержащих водородобразующие и водородпотребляющие микроорганизмы, для получения такого горючего газа как метан. С помощью подобных микробных ассоциаций может также осуществляться очистка окружающей среды от ряда загрязняющих веществ.
Всё это требует детального изучения свойств микроорганизмов, способных выделять и потреблять молекулярный водород. На этом основании можно отбирать штаммы, представляющие практический интерес, оптимизировать условия, обеспечивающие их быстрый рост, а также выделение и поглощение 1^ с наибольшей скоростью.
В связи с этим задачи настоящей работы заключались в следующем:
Выяснение роли молекулярного водорода в жизнедеятельности citrobacter freundii при росте в разных условиях.
Изучение зависимости выделения с.freundii молекулярного водорода от разных факторов среды и подбор оптимальных
условий для его образования.
3. Исследование свойств ферментной системы, участвущей в образовании этой бактерией молекулярного водорода.
Среды и условия культивирования бактерий
Культуру c.freundii поддерживали в пробирках на жидкой среде (10 мл) следующего состава (%): муравьинокислый кальций - 0,5; пептон - 0,5; вода водопроводная. Начальное значение рН среды 7,2-7,4. Пересев проводили раз в два месяца. Культуру E.coli поддерживали в пробирках на полужидкой среде (5 мл) под вазелиновым маслом. Среда содержала мясопеп-тонный бульон и агар (0,2$). Вода водопроводная. Начальное значение рН среды 7,0-7,2. Пересев проводили раз в месяц. После выращивания в течение суток при 30С культуры хранили при комнатной температуре. Чистоту их проверяли высевом на чашки с МПА. Посевным материалом для опытов служили односуточные культуры бактерий, выросшие на МПА. Суспензию для посева получали смывом клеток стерильной водой со скошенного МПА. В среду вносили 1% посевного от общего объема. Исходная оптическая плотность культуры составляла 0,04-0,06 при 540 нм.
Культуры c.freundii для опытов выращивали на синтетической среде (Куплетская, 1979) следующего состава {%):(NH4)2HPO4 - 0,2; КНР04 - 0,2; MgS04 - 0,05; FeS04-7H20 - следы; дрожжевой автолизат - 0,02. В нее вносили одно из следующих соеди - 36 нений углерода ($): глюкоза - 3,6; фумарат - 0,6; малат - 0,7; ацетат - 0,3; пропионат - 0,4; пируват - 3,5; сукцинат - 0,6; малеинат - 0,6; глицерин - 0,5 или пептон - 0,5. В ряде случаев в среду добавляли 0,2$ формиата, 0,2 или 1% нитрата калия или 0,1$ диметилсульфоксида. Все органические кислоты использовали в виде солей натрия. Среды готовили на водопроводной воде. Начальное значение рН среды 6,8-7,0.
Культивирование E.coli проводили на среде (Плакунов и др., 1973), содержащей {%): NaglD - 1,64; ШІ2Р04 - 0,15; (NH4)2S04 - 0,2; MgS04 - 0,02; СаС12 - 0,01; FeS04 - следы, вода дистиллированная. В среду вносили 1% глюкозы или 0,5$ фумарата натрия. Начальное значение рН среды 7,0-7,2.
Культивирование c.freundii и Е.СОІІ в аэробных условиях проводили на качалке (200 об/мин) в колбах на 750 мл со 125 мл среды. В анаэробных условиях культуры выращивали в высоких пробирках или бутылях, доверху заполненных средой. Способность c.freundii к росту за счет использования молекулярного водорода проверяли на средах, содержащих фумарат или малат в герметично закрытых сосудах, в атмосфере . Использовали колбы, объемом около 250 мл, снабженные отводами для пропускания газа. Для контроля культивирование проводили на тех же средах в атмосфере аргона.
Культуру c.freundii выращивали при 30, a E.coli - при 37. Для получения суспензий, клетки из культур обычно в экспоненциальной фазе роста, отделяли от среды центрифугированием (2,5 тыс.д, 10 мин) или на сепараторе и промывали 50 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,0). Осадок ресуспендировали в раз - 37 ннх буферах, в зависимости от проводимых измерений.
Использовали следующие буферные растворы: 50 мМ цитрат-фосфатный (при рН 4,0-6,0), 50 мМ К-фосфатный (при рН 6,0--8,0), 50 мМ трис-буфер (при рН 8,0-9,5) или 50 мМ глициновый буфер (при рН 9,0-10,5). Экстракты клеток для измерения активности ферментов получали последовательно обрабатывая их суспензию растворами эти-лендиаминтетраацетата (ЭДТА) и лизоцима (Enoch , Lester , 1972). Для разрушения клеток около I г сырой биомассы суспендировали в 10 мл 10 мМ трис-буфера (рН 8,0) с I мМ дитиотреитола, добавляли 0,2 мл ЭДТА (250 мМ), затем 0,4 мл раствора лизоцима (2 мг/мл) и вновь 0,25 мл ЭДТА . Все операции проводили при постоянном продувании сосудов аргоном. Полученные таким образом сферопласты осаждали центрифугированием (2,5 тыс.д, 10 мин), суспендировали в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,0) и разрушали замораживанием-оттаиванием. Экстракты получали центрифугированием гомогенатов клеток (12 тыс.д, 20 мин, 4) и активность ферментов определяли в супернатанте.
Для получения мембранной и растворимой фракции клеток, исходные экстракты разделяли на центрифуге типа MSE (140 тыс. д, 120 мин, 4-5). Мембранную фракцию ресуспендировали в том же объеме буфера.
Количество молекулярного водорода, выделяемого клетками и экстрактами c.freundii измеряли на хроматографе "chrom-4u (ЧССР). В качестве газа-носителя использовали аргон. Суспензии клеток или их экстракты (0,1-2,0 мг/мл по белку) помещали в сосуд объемом 15-100 мл и продували аргоном в течение 10-15 минут. Реакцию начинали введением субстрата после чего закрывали сосуд резиновой пробкой с металлическим зажимом. Сосуды встряхивали на качалке с частотой 100-120 колебаний в минуту при 30С. Пробы газа отбирали через резиновую пробку шприцем. После отбора пробы в газовую фазу сосуда добавляли тот же объем аргона для сохранения постоянства давления.
В качестве субстратов применяли глюкозу, пируват натрия, формиат натрия или фумарат калия в концентрации 50 мМ, а также бензил- и метилвиологен (10 мМ). Использовались, кроме того, соединения, содержащиеся в клетках зеленой водоросли chiorella vulgaris . Для этого I г лиофилизованных клеток водоросли суспендировали в 35 мл 50 мМ цитрат-фосфатного буфера (рН 6,5). Затем суспензии клеток разделили на 3 части и одну оставили на 17 часов при 4, а две другие подвергли тепловой или ферментативной обработке. Прогревали клетки при 110 в течение 30 минут в автоклаве. Обработку целлюлазой (100 мг) ИЗ Гриба Trichoderma lignorum при рН 4,5 в течение 17 часов при 30. К этим субстратам добавляли суспензии клеток c.freundii, выращенных в анаэробных условиях на среде с глюкозой и формиатом. Одновременно определяли образование клетками c.freundii в присутствии формиата (50 мМ) или глюкозы (50 мМ). Контролями служили клетки с. freundii и Chiorella vulgaris в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 6,5).
Определение питохромов
Абсолютные дифференциальные спектры поглощения питохромов измеряли в экстрактах клеток, используя в качестве восстановителя дитионит, а окислителя - перекись водорода. Наличие питохрома о определяли так же в экстрактах клеток в присутствии окиси углерода (дитионит + СО - дитионит спектры). Экстракты для измерения питохромов получали разрушением суспензий лиофилизированных клеток в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,0) на Х-прессе (ЛКБ, Швеция) при усилии 3 Т/см2 (Моносов, Нетрусов, 1975) с дальнейшим центрифугированием (37 тыс.д, 10 минут).
Для изучения питохромов мембранной и растворимой фракции, суспензии лиофилизованных клеток в 10 мМ трис-буфера (рН 7,5) разрушали и центрифугировали как описано выше. Исходные экст - 41 ракты центрифугировали при 120 тыс.д (вескгаап L5-65B ) в течение 90 минут. В полученных растворимой и мембранной фракциях измеряли" дифференциальные спектры цитохромов.
Количество гемов разных цитохромов в лиофилизованных клетках определяли по дифференциальным спектрам (окисленный -восстановленный) их производных в растворе щелочного пиридина после отделения гемов b и а от гема с подкисленным ацетоном. Б качестве восстановителя использовали дитионит, окислителем служил феррицианид калия. Коэффициенты молярной экстинкции пи-ридинферрогемохромов для гема с - 21,0 -10 , а для гема ь -34,1-Ю3 (Peterson, 1970).
Энергизацшо мембран определяли по флуоресценции 9-амино--6-хлоро-2 метоксиакридина (Novotny , 1977) при добавлении к суспензиям клеток c.freundii различных доноров электронов в аэробных (акцептор 02) и анаэробных (акцепторы нитрат или фу-марат) условиях. Измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi-512". 9-аминоакридин (ЯВ03б# = 390 нм, Яисш = 430 нм) добавляли в количестве I мкМ, формиат, фумарат, малат, сукцинат, глюкозу и KNO3 ПО І мМ. Разобщитель СССР (м-хлор-карбошїлщанидфенилгидразон) использовали в концентрации 10 мМ. При измерении энергизации в анаэробных условиях кювету продували аргоном.Прирост биомассы определяли нефелометрически на спектрофотометре "Hitachi-124" при длине волны 540 нм.
Проводили также измерение оптической плотности культур нефелометрически на "ФЭК 56" с зеленым светофильтром Jfc 6 и производили пересчет на сухую биомассу, используя калибровочную кривую.В некоторых случаях рост культур определяли по увеличению содержания белка.Определение белка в клетках и бесклеточных препаратах -проводили по методу Лоури dowry et a 1., 1951). Клетки предварительно подвергали щелочному гидролизу (IN NaOH , 2 час, t комн.). В качестве стандартного белка использовали бычий сывороточный альбумин (Sigma).
Концентрацию формиата в опытной среде определяли ферментным методом с помощью бактериальной формиатдегидрогеназы (Родионов и др., 1978). Фермент был получен от сотрудника кафедры микробиологии МГУ Ю.В.Родионова. Об изменении концентрации формиата в среде судили по скорости образования НАДЙ, который является одним из продуктов реакции, катализируемой формиат-дегидрогеназой. Величину начальной скорости ферментативной реакции определяли по изменению оптической плотности раствора при 340 нм, используя регистрирующий спектрофотометр " Hitachi --200-20" (Япония). Кювета содержала в 2,5 мл дистиллированной воды (мкмоль): НАД - 3,0; NaCOOH - 0,1-5,0; фосфатный буфер (рН 7,0) - 250; формиатдегидрогеназы - 0,72 мкмоль мл"1 белка мин"1. По калибровочному графику определяли концентрацию формиата.дыхание клеток определяли, используя полярограф Lp-9
(Венгрия) с электродом Кларка. Реакционная смесь содержала: клетки - 1-2 мг/мл по белку; 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,0); формиат натрия 0,1-50 мМ. Определение нитритов проводили, добавляя к капле исследуемой среды по капле растворов сульфаниловой кислоты и С -наф-тиламина. О присутствии нитритов судили по появлению характерной красной окраски (Алексеев, I960).
Определение рН среды
Клетки c.freundii иммобилизовали путем включения в различные гели. Были использованы: 5% каррагинан, Ъ% агар-агар и 10% полиакриламидный гель. Каррагинан и агар-агар вносили в указанных концентрациях в раствор, содержащий 0,9% Nad и расплавляли на водяной бане. При снижении температуры до 45 в 5 мл этих гелей вносили I мл суспензии клеток c.freundii (5-7 мг/мл по белку), выросших на среде с глюкозой и формиатом, размешивали и быстро остужали. Иммобилизацию в полиакриламидном геле проводили смешиванием акриламида, NN1 метиленбисакриламида, ТЕЩ и персульфата для получения 10% геля. Полимеризацию проводили на льду.
Пластины гелей с включенными в них клетками измельчали через сито с ячейкой около I мм и промывали получение частицы в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,0). Ресуспендированные в том же буфере частицы гелей с включенными в них клетками хранили при комнатной температуре в сосудах с резиновыми пробками.
Повторность опытов в работе двух-трехкратная. Рост c.freundii в разных условиях и образование молекулярного водорода c.freundii штамм 62 способен расти на синтетической среде, содержащей в качестве источника витаминов дрожжевой авто-лизат (0,02$) и ряд органических субстратов. Рост наблюдается в аэробных и анаэробных условиях. В аэробных условиях рост культур возможен за счет использования глюкозы, глицерина, пи-рувата, ацетата, сукцината, малата или фумарата, а также пептона (табл.1). Рост c.freundii в присутствии пропионата или малеината был очень незначительным. С наибольшей скоростью в аэробных условиях растут культуры в присутствии глюкозы, пиру-вата и сукцината.
В анаэробных условиях рост c.freundii происходит при наличии тех же соединений углерода за исключением уксусной, цропионовой, янтарной и малеиновой кислот (табл.2). Увеличение биомассы c.freundii в анаэробных условиях на средах, содержащих фумарат или малат, наблюдалось при наличии молекулярного водорода или формиата. На среде с фумаратом в присутствии % , биомасса бактерий, измеряемая по содержанию в клетках белка, увеличивалась за 16 часов роста в десять раз. Прирост клеток на среде с малатом и Н2 за это время был пятикратным. При замене молекулярного водорода или формиата на аргон, роста в присутствии фумарата или малата в анаэробных условиях не было. Отсюда следует, что изученный штамм c.freundii способен расти в анаэробных условиях, используя в качестве источника энергии молекулярный водород. Такую же функцию, видимо, может выполнять формиат, поскольку добавление его к среде, содержащей фу-марат приводит к увеличению биомассы c.freundii в анаэробных условиях. Но как единственный углеродный субстрат, формиат не обеспечивает рост c.freundii ни в аэробных, ни в анаэробных
Добавление в среду нитрата не стимулирует рост c.freundii в аэробных условиях. Однако, в анаэробных условиях, наблюдалось некоторое увеличение биомассы при внесении KNO3 в среду с фумаратом или малатом, а также с глюкозой и формиатом (табл. 2). При этом в среде появлялись нитриты.
Из полученных данных следует, что c.freundii , подобно другим энтеробактериям, способен к росту, осуществляя брожение, аэробное или анаэробное дыхание при наличии такого акцептора электронов как нитрат или фумарат. Способность c.freundii к анаэробному дыханию подтверждается тем, что энергизация мембран клеток этой бактерии, о чем можно судить по снижению флуоресценции 9-аминоакридина (Novotny, 1977), наблюдается не только в аэробных условиях в присутствии формиата, глюкозы или сукцината, но и в анаэробных, при добавлении к их суспензиям формиата и нитрата (рис.3). При добавлении такого разобщителя как СССР, тушение флуоресценции не наблюдается.
Рост c.freundii в анаэробных условиях на средах, содержащих глюкозу, пируват, глицерин или фумарат сопровождается газовыделением. Анализ образующегося газа показал, что он в значительной степени состоит из Н. Суспензии клеток c.freundii, выросших в аэробных и анаэробных условиях выделяют молекулярный водород в присутствии глюкозы, пирувата, формиата (табл.3). В случае, если клетки росли на среде с фумаратом и формиатом, их суспензии проявляют способность к образованию Е не только при добавлении глюкозы, пирувата или формиата, но также фумарата.
Формиатдегидрогеназная активность
Как следует из обзора литературы, основные сведения о формиатдегидрогеназе, входящей в состав формиатгидрогенлиазной системы относятся к Е.соН. Поэтому представлялось интересным провести определение формиатдегидрогеназной активности клеток c.freundii, выросших в разных условиях и в присутствии различных акцепторов электронов. Но, прежде всего, была проверена правильность методики измерения активности формиатдегидрогена-зы, так как электроны от формиата могут передаваться не сразу на вносимый акцептор, а по цепи переноса - к гидрогеназе, в результате чего вносимый акцептор электронов восстанавливается.
Для подавления гидрогеназной активности клеток кювету, содержащую их суспензию, заполняли аргоном или водородом и продували небольшим объемом окиси углерода, являющейся ингибитором гидрогеназ (Adams , Hall , 1979; Кондратьева, Гоготов, 1981). При замене газовой фазы на аргон + СО формиатдегидрогеназная активность клеток c.freundii оставалась прежней, тогда как их гидрогеназная активность в присутствии Н2 и СО полностью подавлялась (табл. 5). Это служит доказательством того, что в условиях опытов проводилось измерение активности именно формиатдегидрогеназы.
Клетки c.freundii, выросшие в анаэробных условиях на среде с глюкозой и формиатом, с наибольшей скоростью восстанавливают в присутствии формиата бензилвиологен и метиленовую синь (табл. 6). С несколько меньшей скоростью происходит восстановление метилвиологена, а при наличии дихлорфенолиндофенола и феррицианида калия формиат окислялся очень слабо.
При культивировании c.freundii в анаэробных условиях на среде с глюкозой и формиатом формиатдегидрогеназная активность клеток была высокая в присутствии бензилвиологена и метилено-вой сини (табл. 6,7). Внесение нитрата (0,2$) в среду, на которой растет c.freundii, снижает формиатдегидрогеназную активность суспензий клеток, измеряемую по скорости восстановления бензилвиологена (табл. 7). Если c.freundii выращивали в анаэробных условиях на среде с фумаратом и Н2, формиатдегидрогеназная активность клеток также была высокая только при наличии метиленовой сини.
Экстракты клеток c.freundii, выросших в анаэробных условиях на среде с одной глюкозой восстанавливали бензилвиологен в присутствии формиата со скоростью в два раза ниже, чем при росте клеток на среде с глюкозой и формиатом (табл. 8). Культивирование c.freundii на среде с глюкозой и формиатом в аэробных условиях, а также при добавлении в среду 0,2$ KNO3 при выращивании культур в анаэробных условиях, резко снижает формиатдегидрогеназную активность экстрактов клеток. При росте C.freundii в анаэробных условиях в присутствии глюкозы, формиата и KNO3 (1$), а также фумарата и Н2 в аэробных условиях на среде с глюкозой, активность формиатдегидрогеназы при наличии бензилвиологена не проявляется совсем.
Клетки c.freundii выделяют молекулярный водород не только в присутствии глюкозы, формиата и некоторых других субстратов, но также при добавлении к их суспензиям восстановленных форм метил- или бензилвиологена, которые взаимодействуют непосредственно с гидрогеназой. Более активно происходит выделение клетками Н2 в присутствии восстановленного метилвио - 69 Таблица 7
Наиболее активно выделяют молекулярный водород в присутствии восстановленного метилвиологена клетки c.freundii , выросшие в анаэробных условиях на среде с глюкозой и формиатом. При культивировании этой бактерии на средах с пептоном и фу-маратом гидрогеназная активность клеток снижается (табл. 10), а при росте на среде с фумаратом в присутствии нитрата клетки водород не выделяют. Внесение формиата в среду без NO3 на которой растут культуры, увеличивает гидрогеназную активность c.freundii. данные, полученные на целых клетках, подтверждаются результатами опытов, проведенных на их экстрактах (табл. II).
