Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пиридоксаль фосфат как кофермент 9
Глава 2. Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов 13
2.1 Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов на а, р и у семейства ; 13
2.2 Классификация на основе сравнения пространственных структур 15
2.3 Классификация по типу укладки полипептидной цепи 19
Глава 3. Исследование аминокислотных остатков активного центра, ответственных за связывание и функционирование пиридоксаль-Р методом сайт-направленного мутагенеза ... 23
3.1 Остатки активного центра, взаимодействующие с альдегидной группой пиридоксаль-Р 23
3.2 Остатки активного центра, взаимодействующие с N(1) атомом азота пиридоксаль-Р 35
3.3 Остатки активного центра, взаимодействующие с3-гидроксильной группой кофермента 44
3.4 Остатки активного центра, взаимодействующие с фосфатной группой кофермента 47
Глава 4. Объекты и методы исследования 56
4.1 Материалы 56
4.2 Методы исследования 57
Глава 5. Исследование мутантньгх ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Asp2I4 62
Глава 6. Характеристика мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Ser2 54 85
Глава 7. Характеристика мутантного фермента ТФЛ, содержащего в активном центре замену ArglOOThr 98
Выводы 108
Список литературы 109
- Классификация на основе сравнения пространственных структур
- Остатки активного центра, взаимодействующие с N(1) атомом азота пиридоксаль-Р
- Остатки активного центра, взаимодействующие с фосфатной группой кофермента
- Характеристика мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Ser2 54
Введение к работе
Тирозин - фенол-лиаза (ЕС 4.1.99.2) - это пиридоксаль-5'-фосфат (пиридоксаль-Р) зависимый фермент, катализирующий реакцию р-элиминирования L-Tyr с образованием фенола, пирувата и иона аммония [1] (схема 1) схема 1.
В качестве субстратов в данной реакции in vitro могут также выступать другие природные и синтетические аминокислоты: L-Ser, L-Cys, З-метил-Cys, P-Cl-Ala (1), S-бензил-Суз, 3-(о-нитрофенил)-Ь-Суз [2]. Кроме того, тирозин-фенол лиаза катализирует реакции р-замещения [3,4], рацемизацию Ьф)-аланина [5,6], а также реакцию побочного трансаминирования L-Tyr, L-Ser и конкурентных ингибиторов фермента L-AIa, L-Phe и L-m-Tyr [7].
Молекула фермента состоит из четырех идентичных субъединиц, молекулярный вес каждой субъединицы составляет около 51 кДа, Молекула ТФЛ связывает 4 молекулы кофермента на тетрамер. В каждой субъединице е-аминогруппа Lys257 активного центра образует альдиминную связь («внутренний» альдимин) с альдегидной группой кофермента [8].
Механизм реакции р-элиминирования был предложен в работе [9]. На первой стадии любой реакции с участием пиридоксаль-Р-зависимых ферментов (схема 2) происходит взаимодействие «внутреннего» альдимина (I) и аминогруппы субстрата с освобождением е-аминогруппы лизина и образованием альдиминной связи («внешнего» альдимина II) между коферментом и аминогруппой субстрата. Далее образуется хиноидное промежуточное соединение (ШЬ) посредством отрыва С-а-протона субстрата основной каталитической группой. На следующей стадии происходит таутомеризация фенольного фрагмента в циклогексадиеноновый (Шс) с последующим элиминированием фенола (IV). В активном центре тирозин — фенол-лиазы внутренний альдимин холофермента образован остатком Lys257. Наиболее вероятно, что основанием В1, отрывающим С-ос-протон (II), является е-аминогруппа Lys257 [10]. Общий кислотный катализ на стадиях Illb—^IIIc—»-IV осуществляется гидроксильной группой остатка Туг71, которая переносит протон в СГ-положение фенольного фрагмента [II]. Остаток Arg381 способствует отрыву протона от гидроксильной группы фенола, выполняя, таким образом, роль основной группы [10], а остаток Thrl24, находящийся на расстоянии водородной связи от фенольной группы субстрата, скорее всего, служит для сохранения выгодной ориентации фенольного кольца для успешного протекания реакции 0-элиминирования [12].
В 1994 г. была решена трехмерная структура холофермента ТФЛ из Citrobacter intermedius с разрешением 2.7 А [13], позволившая выявить аминокислотные остатки активного центра, которые играют важную роль в связывании кофермента. Некоторые из них представлены на рисунке 1.
В целях детального выяснения роли остатков Asp214 (взаимодействует с атомом N(1) пиридинового кольца пиридоксаль-Р), Ser254 (взаимодействует с одним из атомов кислорода фосфатной группы пиридоксаль-Р) и ArglOO (образует две водородные связи с фосфатной группой кофермента) [8] в связывании кофермента и механизме каталитического превращения, осуществляемого тирозин -фенол-лиазой, в данной работе были изучены свойства их мутантных форм: Asp214Ala, Asp214Asn, Ser254Ala, Ser254Cys и ArglOOThr.
Рисунок 1. Схема расположения некоторых ключевых остатков кофермент-связывающего центра тирозин - фенол-лиазы относительно пиридоксаль-Р. H внутренний альдимин, X=420 нм внешний альдимин, ^=420 нм :NHArg381
,-HOThrl24 f - пиру ват аммония :NHArg381 *>ч HOThrI24 :NHArg381 і HOThrl24
Н амнноакрилат кето-хикоидный интсрмедиат W
Н хиноидный ннтермедиат, Х=500 км
Схема 2. Механизм реакции р-элиминирования L-тирозина.
Обзор литературы
Классификация на основе сравнения пространственных структур
Димер а2р2-комплекса триптофансинтазы представляет собой двойную (ра) пару. Четвертичная структура тетрамерного комплекса фермента ссВра имеет вытянутую форму (І50А в длину) с компактным Рг-димером в центре и двумя сс-субъединицами по краям [28], рисунок 3. р-субъединицы расположены по отношению друг к другу в тетрамере «спина к спине», р-субъединица, аналогично соответствующим субъединицам других пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, имеет 2-х доменную структуру. Ядро N-концевого домена построено из четырех сегментного параллельного р-слоя, экранированного тремя а-спиралями с одной стороны и четвертой сс-спиралью с другой. Каталитическое превращение, осуществляемое р-субъединицей триптофан синтазы, идет по пути l- 2a-»3a- -4e-»5f-»6f (схема 1), где X и Y гидроксильная группа и индол, соответственно. Активные центры а и Р-субьединиц расположены на расстоянии около 25А. Два ра димера связывают по одной молекуле кофермента (причем в связывании каждой молекулы пиридоксаль-Р участвуют соответствующие лиганды от обеих р-субъединиц), независимы друг от друга, но каждый аллостерически регулируется через соседнюю субъединицу димера. Так, связывание субстрата с сс-субъединицей усиливает р-реакцию, и наоборот. Одной из структурных особенностей этого фермента является тоннель, соединяющий а и р-субъединицы и служащий для переноса индола из субъединицы а в субьединицу р. К данному семейству принадлежат также треониндеаминаза [63] и цистеинсинтаза [51].
Аминотрансфераза D-амино кислот - представитель III подгруппы аминотрансфераз [30], представляет собой гомодимер, имеющий 282 остатка в цепи, что значительно меньше, чем у аминотрансфераз других трех подгрупп. Мономер имеет уникальную укладку полипептидной цепи, сочетающей в себе элементы а/р и а+р типов. Пиридоксаль-Р связывается через альдиминную связь с остатком Lysl45, который находится на поверхности С-концевого домена (остатки 121-282), и остатками малого N-концевого домена (остатки 1-120). Структура малого домена состоит из четырехсегментного антипараллельного р-слоя с мотивом расположения 1,4,3,2 в форме "греческий ключ" и четырех а-спиралей, из которых две длинные (3-я и 4-я) экранируют одну из сторон Р-слоя, перекрывая доступ растворителя к его ядру. Наоборот, большой домен состоит из двух смешанных р-слоев в окружении пяти а-спиралей. Малый N-концевой домен располагается с одной стороны большого С-концевого домена образуя область гидрофобного интерфейса, где и располагается связанный кофермент. Это семейство ферментов весьма немногочисленно и состоит лишь из двух представителей. Вторым представителем является аминотрансфераза аминокислот с разветвленной боковой цепью [59] (рис. 4). Данное семейство включает в себя один единственный фермент, осуществляющий реакцию по схеме 1 2a- 3a-»4d (схема 3). D-аланинрацемаза представляет собой гомодимер из 388 аминокислотных остатков и одной молекулы пиридоксаль-Р на цепь, связанной альдиминной связью с Lys39. Мономер уложен в два домена (рис. 5). N-концевой домен (остатки 30-240) содержит (р/а)в-укладку ("ТШ-barrel"). С-концевой домен состоит из остатков 1-29 и 241-388. Кофермент находится на С-концевой стороне (p/cOs-элемента [64]. Для классификации ферментов, трехмерные структуры которых не известны, и соотнесения их с ферментами, чьи пространственные структуры решены, используют как первичную последовательность и расчет вторичной структуры, так и профили гидрофобности. Возможно использование выравнивания последовательностей отдаленно родственных ферментов для улучшения относительной точности предсказания вторичной структуры даже когда степень идентичности составляет 5-10%. Так,
Голдсмит с сотрудниками [65], используя перечисленные выше методы, предложили свою классификацию пиридоксаль-Р-зависимых ферментов по способу укладки полипептидной цепи. Эта классификация включает в себя четыре основных и три дополнительных типа укладки. Известные трехмерные структуры пиридоксаль-Р-зависимых ферментов соответствуют трем различным типам укладки: I - аспартатаминотрансферазы II - триптофансинтазы III - орнитиндекарбоксилазы IV - аминотрансферазы класса IV V - гликоген фосфорилазы. Каждый тип имеет название по первому представителю, для которого раньше других была решена трехмерная структура. В активных центрах всех пиридоксаль-Р-зависимых І-Ш типов ферментов имеются остаток лизина, образующий основание Шиффа с коферментом, и глицин-богатая петля, взаимодействующая с фосфатной группой пиридоксаль-Р. Однако, расположение этих двух компонентов активного центра различно для разных типов данной классификации. В ферментах, принадлежащих типу укладки I, глицин-богатая петля находится ближе к началу полипептидной цепи, в то время как лизин, образующий внутренний альдимин, -ближе к С-концу. Напротив, для типа укладки II характерна обратная закономерность. С-концевой домен гликоген фосфорилазы имеет укладку подобную лактатдегидрогеназе [66], и более ни один из пиридоксаль-Р-зависимых ферментов не имеет подобной укладки. Авторы [65] взяли за основу типа I а-семейство, определенное Александером [26], однако оказалось, что члены у-семейства также относятся к первому типу укладки. Было обнаружено, что
Остатки активного центра, взаимодействующие с N(1) атомом азота пиридоксаль-Р
В пиридоксаль-Р-зависимых ферментах пиридоксаль-Р играет роль акцептора электронов для стабилизации зарядов на атомах С4 , Са, Ср\ Су и понижения энергетического барьера переходных состояний реакций. Одним из наиболее важных и пристально изученных взаимодействий между коферментом и активным центром пиридоксаль-Р-зависимых ферментов является взаимодействие (водородная связь/солевой мостик) между атомом азота пиридинового кольца кофермента и остатком активного центра, находящимся в соответствующем положении. Согласно гипотезе Данатана [25], молекулярные орбитали связи у С-а-атома внешнего альдимина, которые перпендикулярны плоскости пиридинового кольца кофермента, имеют наибольшее перекрывание с электронами л-системы ими иной связи и пиридинового кольца. По этой причине они в первую очередь подвергаются расщеплению. Электронно-акцепторные свойства пиридинового кольца усиливаются при протонировании атома N(1) [64, 121]. Если атом азота протонирован, обеспечивается отток электронной плотности от C-ct-атома во внешнем альдимине и тем самым понижается энергетический барьер для отрыва одного из его заместителей. Разрыв связи между С-а-атомом и связанным с ним атомом водорода приводит к образованию хиноидного производного (схема 3). В подавляющем большинстве случаев пространственные структуры пиридоксаль-Р-зависимых ферментов указывают на наличие отрицательно заряженных остатков дикарбоновых кислот на расстоянии водородной связи от атома N(1) пиридинового кольца. Это характерно для ферментов, принадлежащих к а и у семействам. Однако существует ряд ферментов (Р-семейство), у которых атом азота пиридинового кольца кофермента взаимодействует с нейтральной боковой цепью остатка Ser (триптофансинтаза [122], треониндеаминаза [63]). Аланинрацемаза - уникальный фермент, не принадлежащий ни к одному из перечисленных семейств, имеет в данном положении активного центра положительно заряженный остаток Arg [64] (схема 4). Как уже было сказано ранее, путем сравнения первичных последовательностей и вторичных структур пиридоксаль-Р-зависимых ферментов были установлены их эволюционные взаимосвязи [65] и была произведена классификация на, по крайней мере, 4 типа укладки. Авторы работы [122], на основании имеющихся сведений об остатках активного центра пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, взаимодействующих с атомом N(1) пиридинового кольца аспартатаминотрансферазы (тип укладки I, Asp222), триптофансинтазы (тип укладки II, Ser377), трансферази D-аминокислот (тип укладки IV, Glul77) и аланинрацемазы (тип укладки III, Arg219), сделали попытку соотнести тип данного остатка с типом укладки. В последние годы количество решенных трехмерных структур и сведений об остатках активного центра сильно возросло.
Таблица 3, составленная нами согласно современным данным, демонстрирует взаимосвязь между типом остатка, взаимодействующим с атомом азота пиридинового кольца пиридоксаль-Р и типом укладки фермента. Из представленных данных видно, что не существует строгой взаимосвязи между остатком при атоме N(1) азота пиридинового кольца кофермента и способом укладки. Первые исследования роли боковой цепи остатка, взаимодействующей с N(1) пиридинового кольца пиридоксаль-Р, проводились путем замены остатка Asp222 аспартатаминотрансферазы на Ala [128]. В этой работе также анализировали влияние аналога кофермента N-метил-пиридоксаль-Р на характеристики мутантного фермента. Активность мутантной формы по отношению к L-Asp уменьшается в 2000 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Спектроскопические и кинетические исследования показали, что Asp222 стабилизирует протонированный N(1) пиридоксаль-Р, увеличивая величину рКа атома N(1) в альдимине более чем на 5 единиц. Спектрофотометрическое титрование показало, что атом N(1) в ферменте дикого типа протонирован при рН 10, в то время как в Asp222Ala (пиридоксаль-Р) депротонирован при рН 5.0. Положительно заряженный атом N(1) облегчает отрыв а-протона от аминокислотного субстрата, стабилизируя переходное состояние в реакции с L-Asp. Чтобы узнать ионное состояние атома N(1) в мутантном ферменте, исследовали взаимодействие Asp222AIa с аналогом пиридоксаль-Р - Г\Г(1)-метшшрованным пиридоксаль-Р, который имеет фиксированный положительный заряд на атоме N(1). Спектры поглощения и КД оказались близки к таковым для фермента дикого типа и зависимы от рН, Спектры с аналогом субстрата - Р-гидроксиаспартатом имеют характерный максимум при длине волны 500 нм, соответствующий хиноидному интермедиату для нативной аспартат аминотрансферазы, в то время как в спектре холофермента мутантной формы Asp222AIa данный максимум отсутствовал. Рентгеноструктурные исследования (с разрешением 2.0 А) и исследования кругового дихроизма дают основание предположить, что аналог кофермента N-Me-PLP связан в активном центре Asp222Ala(N-Me-PLP) в ориентации, отличной от таковой в диком типе. Этим может объясниться то, что найденная каталитическая активность была восстановлена лишь частично. N(1) атом пиридоксаль-Р полностью протонирован в интервале рН 5-Ю в активном центре нативного фермента, в то время как он полностью депротонирован в этом
Остатки активного центра, взаимодействующие с фосфатной группой кофермента
Во многих пиридоксаль-Р-зависимых ферментах фосфатная группа является решающим фактором в прочном связывании кофермента [148]. За исключением гликогенфосфорилазы, этот структурный элемент не вовлечен напрямую в каталитическую реакцию, но предназначен для связывания. Два консервативных структурных элемента, которые наиболее тесно взаимодействуют с фосфатной группой, Gly-богатая петля и основная аминокислота, были найдены во многих пиридоксаль-Р -зависимых ферментах, несмотря на большие структурные различия в укладке ферментов. Во всех пиридоксаль-Р -зависимых ферментах положение фосфатной группы кофермента стабилизируется дипольным взаимодействием с N-концом сс-спирали, которая находится между первой и второй Р-цепями р-листа большого домена. Атомы азота первых остатков в основной цепи образуют водородные связи с кислородом фосфатной группы пиридоксаль-Р. Положение фосфатной группы стабилизируется большим числом водородных связей с белком (как правило, их не меньше девяти). В этих взаимодействиях принимают участие различные остатки. Например, для некоторых пиридоксаль-Р -зависимых ферментов с известными структурами с фосфатной ручкой кофермента взаимодействуют: Gly 99 в тирозин - фенол-лиазе [8], 108 в аспартатаминотрансферазе [141,142], I И в диалкилглициндекарбоксилазе [36], 112 в синтазе диаминопеларгоновой кислоты [32], 62 в синтазе З-амино-5-гидроксибензойной кислоты [37], 86 в цистатионин-р-лиазе [53], Ser 255 в аспартатаминотрансферазе [141,142], 254 в тирозин - фенол-лиазе [8], 263 в триптофан - индол-лиазе [39], 183 в синтазе З-амино-5-гидроксибензойной кислоты [37] 271 в диалкилглициндекарбоксилазе [36] 98 вкинурениназе[149] Остаток Ser консервативен как в пространственных структурах, так в аминокислотных последовательностях некоторых пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, занимая положение через два остатка впереди остатка лизина активного центра: Ser-X-X-Lys [98]. Во взаимодействие с фосфатной группой пиридоксаль-Р часто вступает остаток Туг: Туг70 в аспартат аминотрансферазе [141,142], 71 в тирозин - фенол-лиазе [8], 56 в цистатионин-р-лиазе [53], 389 в орнитиндекарбоксилазе [76], 354 в аланинрацемазе [64], 121 в 6-аминолевулинат-синтазе.
Остаток Туг70 аспартатаминотрансферазы образует водородные связи с одним из атомом кислорода фосфатной группы и с е-аминогруппой остатка Lys 258 во внешнем альдимине и в кетимине. Замена этого остатка на фенилаланин [150-152] и на гистидин [153] приводила к понижению активности аспартаминотрансферазы, однако мутантные ферменты сохраняли 8% и 13% активности соответственно. Константа диссоциации пиридоксамин-Р из мутантного фермента Tyr70His увеличилась в 3 раза по сравнению с ферментом дикого типа, в то время как при замене на Phe величина IQ возрастает в 80 раз. Это позволяет предположить, что His70 может заменять Туг70 при образовании водородной связи с коферментом. В целом, результаты свидетельствуют об отсутствии у этого остатка каталитической функции. Исследования остатка Туг71 в тирозин — фенол-лиазе [11] показали, что при замене на Phe константа связывания пиридоксаль-Р, определенная спектрофотометрическим титрованием, увеличивается в 1700 раз. Мутантный фермент не обнаруживает активности в реакции р-элиминирования природного субстрата. Tyr71Phe реагирует с S-алкилцистеинами, но с этими субстратами показал значения kcat в 103 -10 раз меньшие по сравнению с ферментом дикого типа, в то время как значения kCa/Km уменьшились в 10 -10 раз. Однако, для субстратов с хорошими уходящими группами (З-(о-нитрофенил)-Ь-цистеина, р-хлор-Ь-аланина и О-бензил-Ь-серина), значения kC8t для Tyr71Phe оказались в пределах 1.85-7 % от таковых для дикого типа. Tyr7IPhe образует устойчивые хиноидные комплексы с поглощением при 502 нм с L-Phe, производными тирозина и S-алкил цистеинами. По сравнению с Туг70 в аспартат аминотрансферазе, Туг71 в тирозин - фенол-лиазе из Citrobacter freundii, вероятно, играет двойную роль, как в связывании кофермента в отсутствие субстрата, а также как кислотный катализатор при элиминировании уходящих групп из хиноидного интермедиата. Тугі21 является консервативным для всех известных последовательностей 6-аминолевулинат-синтаз [154]. Кроме того, он соответствует Туг70 в аспартат аминотрансферазе из Е. соїі, в которой, как обсуждалось выше, гидроксильная группа Туг70 взаимодействует посредством водородной связи с фосфатной ручкой кофермента и предотвращает диссоциацию кофермента из активного центра фермента. [155]. Для того чтобы узнать, в какие процессы вовлечен Туг 121 в 5-аминолевулинат синтазе, данный остаток был замещен на Phe и His (в некоторой степени His может заменять Туг в формировании водородной связи с пиридоксаль-Р) при помощи сайт-направленного мутагенеза. Мутант Tyrl21Phe сохранил 36% активности дикого типа, а значение Кт для глицина в качестве субстрата увеличилась в 34 раза, в то время как активность мутанта Tyrl21His упала до 5% от таковой для дикого типа, а Кт для глицина выросла в 5 раз. Спектры поглощения и кругового дихроизма обоих мутантов были сходными с таковыми для дикого типа за исключением максимума поглощения внутреннего альдимина Tyrl21Phe, который сдвинулся в коротковолновую область (от 420 нм до 395 нм), что указывает на более свободное связывание пиридоксаль-Р в Tyrl21Phe. Обе мутантные формы Tyrl21Phe и Tyrl21His имели пониженное сродство к коферменту по сравнению с диким типом (в 15 и 4 раза соответственно). Кроме того, Тугі21 Phe и Tyrl21His имеют более низкую термостабильность, чем дикий тип. Все полученные сведения указывают, что Тугі21 играет важную роль в связывании кофермента в 5-аминолевулинат синтазе.
Изучение взаимодействия химически модифицированного кофермента с белком и рентгеноструктурные исследования показали, что несколько пиридоксаль-Р -зависимых ферментов используют остаток Arg для связывания 5 -фосфатной группы кофермента (у-аминобутират аминотрансфераза [156], глутамат декарбоксилаза [157], гликоген фосфорилаза [158, 159], аспартат аминотрансферазы [160], триптофаяаза [39,161] и р-субъединица триптофан синтазы [162]). Многочисленные исследования D-сериндегидратазы [163-165] показали, что остаток Arg взаимодействует с фосфатной группой кофермента во время катализа. Замена Argl20 на Lys в активном центре D-сериндегидратазы [166] уменьшила сродство фермента к пиридоксаль-Р в 20 раз и уменьшила число оборотов в 5-8-раз. Анализ рН профилей скорости реакции для мутанта и фермента дикого типа показали, что Argl20 взаимодействует с каталитически важными заряженными группами в активном центре дикого типа. Однако мутация не оказала влияния на спектры поглощения, КД и 31Р NMR холофермента, свидетельствуя о том, что пиридоксаль-Р образует основание Шиффа с лизином. Таким образом, ArgI20, консервативный для D-серин и треонин дегидратаз, вносит вклад как в катализ, так и в связывание кофермента, но не является каталитически важным остатком. В активном центре эукариотической орнитиндекарбоксилазы отрицательный заряд фосфатной группы пиридоксаль-Р нейтрализован солевым мостиком с Arg 277 [65]. Мутация Arg277 на Ala в активном центре орнитиндекарбоксилазы увеличивает Кт для пиридоксаль-Р в 270 раз по сравнению с диким типом фермента, в то время как kcat уменьшается только в 2 раза при рН 8.0. Константа диссоциации в отношении пиридоксаль-Р для мутанта увеличилась в 20 раз. Эти результаты показали, что Arg277 необходим для связывания белка с пиридоксаль-Р. Р NMR спектры фермента показали, что как в диком типе, так и в Arg277Ala ферментах, фосфат связан в напряженной конформации как дианион. Однако имеется разница в химическом сдвиге 3Р. Для мутантной формы Arg277Ala наблюдается сдвиг (6.7 ррт) на 0.5 ррт вниз по шкале по сравнению с ферментом дикого типа, это говорит о том, что белковое микроокружение связанной с
Характеристика мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Ser2 54
Определение констант диссоциации пиридоксаль-Р для мутантной формы S254A показало, что замена приводит к потере сродства апофермента к коферменту примерно на четыре порядка по сравнению с ферментом дикого типа. Величины K j для мутантной формы S254A составляет 1,5x10 3 М. Нам не удалось определить величину Kd для мутантной формы S254C из-за более низкого, чем у мутантной S254A, сродства пиридоксаль-Р к апоферменту. Понижение свободной энергии связывания пиридоксаль-Р ферментом S254A составляет 4.6 ккал/моль. В экспериментальных условиях наблюдалась чрезвычайно быстрая потеря пиридоксаль-Р холоферментом, на что указывало исчезновение максимума поглощения холофермента (-425 им) в течение часа. Подобное поведение S254C можно объяснить большим объемом боковой цепи остатка Cys, введение которого сильно нарушает геометрию активного центра. Несмотря на то, что фосфатная группа кофермента образует многочисленные водородные и электростатические взаимодействия с белковым матриксом тирозин фенол-лиазы, замена остатка Ser254 даже на Ala, боковая цепь которого по объему сравнима с таковой у Ser, приводит к заметному снижению сродства кофермента по отношению к активному центру.
Спектральные исследования На рисунке 14 приведены спектры поглощения холоферментов мутантных форм S254A и S254C в сравнении со спектрами ТФЛ дикого типа. Видно, что замены остатка S254 приводят к изменению соотношения полос поглощения с максимумами в области 330-340 нм и 410-420 нм, принадлежащим двум таутомерным формам внутреннего альдимина. Для определения ионного и таутомерного состава внутреннего альдимина мутантных ферментов их спектры поглощения разлагали на полосы, соответствующие отдельным электронным переходам, как это описано для фермента дикого типа [201]. Данные разложения показали, что, как и для внутреннего альдимина фермента дикого типа, основными структурами внутренних альдиминов мутантных ферментов являются кетоенамин и енолимин в катионной форме (схема 5, структуры I, II). Помимо конформера, присутствующего в ферменте дикого типа (Х=327 нм, схема 5, структура VI), в котором альдиминная связь перпендикулярна плоскости пиридинового кольца пиридоксаль-Р, для мутантных форм S254A и S254C был обнаружен конформер с максимумами поглощения при 381 и 376 нм соответственно (П ), в котором альднминная связь частично выведена из сопряжения с л-электронами пиридинового кольца, но водородная связь между атомом азота альдиминной связи и водородом З -ОН группы кофермента сохраняется (обозначенный в таблице 12 как И ). Такой таутомер ранее был найден при разложении спектров модельных соединений [202]. В таблице 12 приведено процентное содержание таутомеров и конформеров внутреннего альдимина мутантных форм в сравнении с данными для фермента дикого типа. Преобладающей структурой альдиминов мутантных форм, как и в случае фермента дикого типа, является кетоенамин, однако замена остатка Ser254 в обоих случаях привела к некоторому изменению таутомерного состава. В отличие от фермента дикого типа, полосы поглощения альдиминов мутантных форм S254A и S254C не обладают круговым дихроизмом. Следовательно, замена остатка Ser 254 как на Ala, так и на Cys приводит к существенному изменению микроокружения кофермента.
В спектрах комплексов S254A, S254C с L-Phe и L-Met отсутствует максимум хиноидного производного и наблюдается доминирующая полоса поглощения и отрицательного КД с максимумом при 414-416 нм. Поскольку полосы кетоенамина обеих мутантных форм не дихроичны как было отмечено ранее, а полоса поглощения кетоенамина в спектрах комплексов мутантных форм S254A и S254C обладает круговым дихроизмом, то полосы поглощения и КД в комплексах мутантных форм с L-Phe и L-Met следует отнести к внешнему альдимину. Как правило, полосы поглощения внешних альдиминов были сдвинуты в длинноволновую область на 2-5 нм по сравнению с положением полос поглощения внутренних альдиминов мутантных форм S254A и S254C. Спектры поглощения и кругового дихроизма комплексов мутантных ферментов (рис. 15-16) S254A и S254C разлагали, как это описано для внутреннего альдимина фермента дикого типа. Процентное содержание найденных структур приведено в таблице 12. Внешние альдимины мутантных форм S254A и S254C существуют в той же ионной форме и практически в том же таутомерном составе, что и их внутренние альдимины. Ферменты S254A и S254C связывают ингибиторы, но в отличие от фермента дикого типа не образуют заметного количества хиноидного промежуточного комплекса. Стационарная кинетика Параметры стационарной кинетики для ТФЛ дикого типа и мутантных форм фермента S254A и S254C в реакции разложения ряда субстратов представлены в таблице 13. Активность мутантных ферментов в реакциях со всеми субстратами была значительно ниже, чем активность фермента дикого типа. Наиболее заметное влияние замена остатка Ser254 проявилось в реакциях взаимодействия с природным субстратом Lyr. Величины kcai этой реакции уменьшилась на 4 порядка по сравнению с таковыми для фермента дикого типа (табл. 13). Для З-F-Lyr скорость расщепления уменьшилась более чем на три порядка. В качестве субстратов использовались р-С1-А1а, S-алкил-цистеины, а также SOPC, При взаимодействии мутантных ферментов с перечисленными субстратами активность мутантных ферментов была значительно ниже, чем активность фермента дикого типа.
Замена остатка S254 оказала наиболее заметное влияние на активность мутантных ферментов в реакции с природным субстратом, Lyr. Величины kcat этой реакции уменьшились на 4 порядка по сравнению с таковыми для фермента дикого типа. При взаимодействии мутантных ферментов с нефизиологическими субстратами величина ktai уменьшается в среднем на один порядок. Для З-F-Lyr и SOPC скорости расщепления уменьшились на три порядка. Замена остатка Ser254 не оказала заметного влияния на Кт практически для всех субстратов, в том числе и для Lyr. Следовательно, мутация не затрагивает субстрат-связывающий центр. Следует отметить, что величина Кт для З-F-Lyr для обеих мутантных форм увеличилась практически на порядок, в то время как для фермента дикого типа величины Кт для Lyr и для З-F-Lyr близки по значению. Такое увеличение позволяет думать, что конформационные изменения активного центра, вызванные заменами остатка серина 254, приводят к тому, что мутантные ферменты, в отличие от фермента дикого типа, становятся чувствительны к введению заместителя в положение 3 фенольного кольца. Были изучены ингибирующие эффекты L-Phe и L-Met в реакциях разложения SOPC Использование в качестве субстрата в этих исследованиях Lyr затруднительно ввиду низкой активности мутантных ферментов S254A и S254C. Величины констант ингибирования приведены в таблице 14. Значения констант для L- Phe и L- Met для мутантных форм S254 и S254C увеличиваются в 4-Ю раз. В соответствии с кинетической схемой 6 отсутствие хиноидного интермедиата свидетельствует о сильном уменьшении
