Содержание к диссертации
Введение
II Обзор литературы 10
1 Значение фитаз для кормопроизводства 10
2 Классификация и свойства фитаз 12
2.1 Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз 13
2.1.1 Грибные фитазы 15
2.1.2 Бактериальные фитазы 17
2.2 Фитазы семейства пирофосфотаз ф-пропеллерных фитаз) 19
2.3 Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз 20
3 Промышленно важные характеристики фитаз 21
4 Подходы к конструированию ферментов с улучшенными характеристиками 25
4.1 Принципы рационального конструирования белков 26
4.2 Принципы «направленной эволюции» 30
4.3 Принципы «полурационалыюго» конструирования белков 34
5 Экспрессия фитаз в различных системах 41
5.1 Экспрессия фитаз в бактериях 41
5.2 Экспрессия фитаз в грибах 41
5.3 Экспрессия фитаз в дрожжах 42
6 Методы синтеза генов 45
III Материалы и методы 48
1 Среды и условия культивирования 48
2 Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 49
3 Манипуляции с ДНК 52
4 Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз 53
5 "Errore-prone" ПЦР, конструирование библиотеки мутантных генов 53
6 Отбор фитаз с повышенной термостабильностью 54
7 Сайт-направленный и сайт-направленный насыщающий мутагенез 54
8 Мутагенез областей K29-G74 и Q104-Q131, конструирование библиотеки мутантных генов 55
9 Метод синтеза remphyA-Cfmod из олигонуклеотидов 56
10 Определение фитазной активности 57
11 Определение свойств фитаз 58
12 Анализ аминокислотных последовательностей и мутаций 59
IV Результаты и обсуждение 60
1 Применение стратегии случайного мутагенеза целой днк последовательности для получения генов фитаз с. freundi1с повышенной термостабильностью 60
1.1 Получение генов, кодирующих фитазы C.freundii с повышенной термостабильностью, методом "error-prone" ПЦР 60
1.1.1 Выбор объекта для мутагенеза 60
1.1.2 Разработка экспрессионной системы и выбор реципиента 62
1.1.3 Проведение мутагенеза методом "error-prone"ПЦР 62
1.1. 4 Разработка метода отбора фитаз с повышенной термостабильностью 63
1.1.5 Отбор фитазы с повышенной термостабильностью 64
1.1.6 Оценка эффективности метода 66
1.2. Оценка возможности применения метода ДНК-"шаффлинга" для создания генов фитаз C.freundii с повышенной термостабильностью 66
2. Применение стратегии сфокусированного мутагенеза для создания генов фитаз с повышенной термостабильностью и высокой удельной активностью.67
2.1 Выбор реципиента и системы экспрессии 67
2.1.1 Выбор реципиента 68
2.1.2 Получениерекомбинантных плазмид рРЮ-С и рРЮ-0 и штаммов на их основе 69
2.2 Разработка полурационального подхода для получения генов термостабильных фитаз 70
2 2.1. Получение, клонирование, экспрессия генов phyA-CMl и phyA-OMl 73
2.2.2 Определение свойств фитаз РІтуА-CfMl и PhyA-OpMl 73
2.2.2.1 Определение молекулярной массы 73
2.2.2.2 Сравнение термостабильности 74
2.2.2.3 Оценка удельной активности 79
2.2.3 Получение, клонирование и экспрессия генаphyA-Cl 80
2.3 Получение генов, кодирующих термостабильные фитазы с увеличенной удельной активностью 81
2.3.1 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности phyA-CMl 81
2.3.2 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности phyA-Cl 83
2.3.2.1 Выбор мутаций с помощью программы I-Mutant2,0 83
2.3.2.2 Получение, клонирование и экспрессия геновphyA-C(2-6) 84
3. Разработка эффективного подхода для получения гена, кодирующего мутантный вариант фитазы с оптимизированными свойствами 85
3.1 Разработка подхода и теоретическое обоснование его эффективности 85
3.2 Получение генаphyA-СМЗ в результате применения разработанного подхода 88
3.3 Анализ аминокислотных замен 89
4. Изучение свойств фитазы PHYA-CFM3 92
4.1 Анализ термостабильности 92
4.2 Определение молекулярной массы и удельной активности 93
4.3 Определение оптимальной рабочей температуры и рН профиля 95
4.4 Влияние гликозилирования и рН на термостабильность и фитазную активность 96
4.5 Определение кинетических характеристик 97
4.6 Оценка кормовых качеств фитазы PhyA-CfM3 98
5. Эффективная экспрессия гена PHYA-CM3MOD в дрожжах P. pastoris 99
5.1. Разработка синтетической последовательности гена phyA-Cmod 99
5.2 Разработка метода синтеза гена phyA-Cmod 100
5.3 Влияние оптимизации кодонов на эффективность экспрессии rem phyA-Cmod 103
5.4 Получение штамма P. pastoris с повышенной экспрессией гена phyA-CM3mod. 104
5.4 Сравнение фитазных активностей КЖ лучших штаммов после прогрева 104
V Выводы 105
VI Список литературы 106
- Принципы «полурационалыюго» конструирования белков
- Мутагенез областей K29-G74 и Q104-Q131, конструирование библиотеки мутантных генов
- Разработка полурационального подхода для получения генов термостабильных фитаз
- Получение генаphyA-СМЗ в результате применения разработанного подхода
Принципы «полурационалыюго» конструирования белков
Фитазы бацилл отнесены к новому семейству белков независимо в двух работах [49, 50]. Они входят в состав семейства пирофосфатаз, или щелочных фитаз и имеют особенный механизм гидролиза субстрата. Бациллярные фитазы начинают отщеплять фосфатные группы, начиная с D-3 положения
фитата, однако расщепление фитазами этой группы проходит всего до третьей фосфатной группы из шести имеющихся [51]. Эти фитазы продуцируются и секретируются различными штаммами Bacillus subtilis [49] и Bacillus amiloliquefaciens [52]. Все бациллярные фитазы имеют очень большую степень идентичности между собой и похожи по свойствам. Их аминокислотные последовательности идентичны на 90-99%. Для выяснения каталитического механизма этих фитаз был изучена пространственная структура фитазы Bacillus amiloliquefaciens [53] и проведен сайт-направленный мутагенез, затрагивающий остатки активного центра [54]. Трехмерная структура этих молекул имеет строение, напоминающее пропеллер с шестью лопастями, образованными (3 слоями молекулы.
Бациллярные фитазы являются металлозависимыми ферментами. В реакции гидролиза этих ферментов принимают участие ионы кальция. Активный центр бациллярных фитаз имеет два сайта: гидролиза и связывания субстрата. Аминокислотные остатки первого сайта при взаимодействии с ионами кальция участвуют непосредственно в расщеплении субстрата. Остатки второго сайта «аффинности» увеличивают сродство связываемого субстрата и фермента. Ионы кальция усиливают связывание, создавая благоприятное электростатическое окружение. Недавно было обнаружено некоторое сходство в последовательностях фитаз бацилл и белков семейства пирофосфатаз, которые по механизму реакции являются металлофосфатазами [54].
В отличие от кислых гистидиновых фосфатаз щелочные бациллярные фитазы демонстрируют очень узкую субстратную специфичность и не способны расщеплять никакие другие соединения, кроме фитата. Более того, эти фитазы способны расщеплять фитат только при щелочных значениях рН среды (с оптимумом рН 8). Однако в отсутствии ионов кальция реакция гидролиза также проходить не будет даже при оптимальных значениях рН.
Бациллярные фитазы имеют относительно низкую молекулярную массу белка - около 38 кДа. Это значение может увеличивается примерно на 10% за счет включения в состав фитаз молекул воды из-за высокой гигроскопичности белка [55]. Фитазы этого семейства характеризуются очень низкими значениями удельной активности (табл. II-1), очень высокой степенью термостабильности, неплохой устойчивостью к действию протеолитических фрментов.
Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз или 5-фитаз отличаются от всех предыдущих. Построена трехмерная структура одного из белков этого семейства [56] и предположен вероятный механизм действия этих ферментов. Ферменты этого семейства известны в основном у растений, но изредка встречаются также у грибов и бактерий. Многие из них являются фосфатазами и не имеют фитазной активности. Только у некоторых ферментов из семян бобов и кукурузы известна фитазная активность [56, 57]. Лучше всего изучен представитель этого класса фитаз пурпурная кислая фосфатаза GmPhy из бобов Glycine max L. Merr [58]. Эта фитаза имеет общий мотив активного сайта со многими другими белками из семейства пурпурных кислых фосфатаз. Удельная активность этих фитаз очень низкая, это может быть обусловлено тем, что фитаза продуцируется в семенах бобов во время прорастания, а этот процесс требует постепенного, не быстрого высвобождения фосфора в течение нескольких дней.
Основными свойствами фитаз, имеющими значение для кормопроизводства, являются: рН оптимум, удельная активность, устойчивость к действию температуры и протеаз, количество отщепляемых фосфатных групп. Оптимальные значения показателей свойств ферментов определяются физиологическими условиями среды желудочно-кишечного тракта животных и технологическими требованиями приготовления комбикормов. Таким образом, ферменты, гидролизующие фитат, должны обладать: высокими значениями удельной активности и термостабильности; температурным оптимумом около 42С; рабочим интервалом в области кислых значений рН 3,5-5,5; устойчивостью к действию протеолитических ферментов (особенно пепсина) и низких значений рН; эффективно гидролизовать фитат [59].
Из-за маленькой удельной, активности ферменты класса 5-фитаз не нашли применения в качестве кормовой добавки. В общем, фитазы микробного происхождения более устойчивы, к действию рН и высоких термператур, чем фитазы растений. Стабильность большинства растительных фитаз резко падает при значениях рН ниже 4 и выше 7,5; в то время как большинство соответствующих микробных фитаз достаточно устойчивы при действии рН среды выше 8 иниже 3. Например, фитаза АррА Е. coli не теряет активность после пребывания в условиях с рН 2 и 10 при 4С в течение 2 часов [60]. В очищенной форме большинство фитаз растений необратимо инактивируются при температуре 70С в течение 1 мин., тогда как микробные ферменты сохраняют значительную активность при инкубации более долгое время.
Эффективность и ограничение использования ферментов в кормопроизводстве зависит от их устойчивости к расщиплению протеазами. Было показано, что ферменты из A. niger более устойчивы в присутствии пепсина или панкреатина, чем соответствующие ферменты из зёрен пшеницы [60].
Мутагенез областей K29-G74 и Q104-Q131, конструирование библиотеки мутантных генов
Впервые теоретическое обоснование концепции «консенсусною) последовательности было предложено в работе [106]. Заменив в результирующем белке иммуноглобулина десять аминокислотных остатков по принципу статистической встречаемости этих остатков у гомологичных белков, авторы получили увеличение термостабильности. Исследовав значение каждой замены по отдельности, авторы обнаружили, что только шесть из них вносили вклад в стабилизацию белка. Комбинация всех шести мутаций одновременно приносила дополнительный суммарный эффект. Затем авторы попытались найти связь консенсусных остатков с их расположением по отношению к элементам вторичной структуры белка. Первичные наблюдения натолкнули на мысль о большей частоте встречаемости стабилизирующих мутаций в области поворотов р-слоев. Однако эта теория в действительности подходила только в некоторых случаях, в других же примерах она не нашла подтверждения [107]. Одновременно авторы сделали предположение о стабилизирующей роли «консенсусных» (т.е. с высокой степенью консервативности) аминокислотных остатков.
Теория «консенсусной» последовательности была также использована для конструирования фитаз с высокой термостабильностью. Основой для этого конструирования были последовательности грибного происхождения [108]. К тому времени в ГенБанке имелись последовательности тринадцати грибных фитаз. Все эти фитазы были гомологичны между собой с идентичностью 50-90%. Все исходные грибные фитазы были мезофильными, с температурой денатурации 55-63С. Последовательности фитаз были выровнены, и консенсусные аминокислотные остатки вычислялись программой PRETTY [109]. Каждому грибному виду присваивался один «голос» для вычисления консенсусных остатков. Поскольку некоторые последовательности относились к одному виду, то доля их «голоса» была пропорционально меньше. Большинство аминокислотных остатков вычислено автоматически программой PRETTY. Восемнадцать остатков не определялись однозначно, и авторам выбрали их произвольно. Полученная последовательность Консенсенсус-1 имела 58-80% идентичности с исходными последовательностями. Как и ожидалось, белок Консенсус-1 оказался более термостабильным: температура денатурации была 78С, что на 15-22С выше, чем у его предшественников. Примерно на столько же повысился температурный оптимум фермента. По другим характеристикам, таким как рН-профиль, субстратная специфичность, Консенсус-1 больше всего напоминал фитазы из A. emericella и Е. nidulans. Это сходство коррелирует со сходством последовательностей этих белков. Несмотря на то, что «голос» каждого из шести видов был одинаковым, усредненный вариант Консенсуса-1 больше всего был похож на. nidilans.
На этом результате авторы не остановились. Они продолжили развитие концепции «консенсусной» последовательности с целью, во-первых, , дальнейшего увеличения термостабильности фитазы, во-вторых, уточнения правильности произвольного выбора неоднозначных аминокислотных остатков [83]. Для этих целей были добавлены еще шесть новых последовательностей фитаз, которые как раз только появились в ГенБанке. Температура денатурации у добавленных фитаз были также не высокой, 48-64С. Последовательности новых консенсусных фитаз Консенсус-10 и Консенсус-11 были получены при разных соотношениях «голосов» предыдущих 13 последовательностей и шести добавленных. Консенсус-10 и Консенсус-11 отличаются от Консенсус-1 на 33 и 19 аминокислотных остатков, соответственно. Температура денатурации белка Консенсус-10 была 85.4С, что на 7.1С выше, чем у Консенсуса-1. Исследователи проверили вклад каждой из 33 замен между Консенсус-1 и Консенсус-10. Из них 11 остатков по отдельности оказывали стабилизирующий эффект, 12 были нейтральными, а 18 - дестабилизирующими. Большинство стабилизирующих мутаций затрагивали остатки, расположенные на поверхности белка (а не в глубине).
Эти результаты отражают тот факт, что увеличение термостабильности не есть результат какой-то одной мутации, но комбинации многих мутаций. Одним из важных выводов работы [83] было то, что стабилизирующие остатки создавали суммарно больший эффект, чем дестабилизирующие, хотя последних было больше. Вероятно, такой эффект не простое суммирование, а одновременное воздействие всех мутаций. Это говорит в пользу метода «консенсус» последовательности: без проверки каждого из остатков, а только при помощи суммарной замены можно достигнуть желаемого эффекта.
Увеличение термостабильности белка Консенсенсус-10 произошло за счет мутаций в остатках, которые однозначно не определялись в Консенсусе-1. Вычислению этих мутаций помогло добавление шести дополнительных последовательностей фитаз. Тот же самый результат можно было бы получить альтернативным способом, при помощи сайт-направленного мутагенеза, если бы дополнительных последовательностей фитаз не было. Чтобы показать эту возможность, авторы ввели 11 стабилизирующих мутаций в белок Консенсус-1, получив Консенсус-1-термо, у которого температура денатурации была 88С [83]. Кроме того, в этой работе был проведен еще один эксперимент, «обратного» мутагенеза: из белка консенсус-10 удалили 3 дестабилизирующие мутации, получив увеличение температуры денатурации до 90.4С. Это значение самое высокое, достигнутое у белков фитаз на данный момент. Достигнутое увеличение термостабильности по сравнению с исходными белками превышает 20С. Это ставит метод «консенсусных» последовательностей в ряд наиболее эффективных методов.
По сравнению с другими методами данная концепция имеет следующие преимущества: (і) При мутагенезе аминокислотные остатки замещаются другими остатками, возможность существования которых на этих местах подтверждена их присутствием как минимум в двух других гомологах. Следовательно, результирующие мутации не будут чуждыми и не будут дестабилизировать фермент, (іі) Для этого метода не нужно иметь данные о трехмерной структуре белка, что необходимо в других рациональных методах, (iii) Возможен отбор мутантов, у которых свойства определяются трудоемким способом или в несколько стадий отбора, что не допустимо при методах направленной эволюции.
Разработка полурационального подхода для получения генов термостабильных фитаз
Мутагенез областей гена ркуА-СЗ, соответствующих участкам аминокислотной последовательности K29-G74 и Q104-Q131, проводили методом "error-prone" ПЦР с участием пар праймеров (P-CfF, G74-obr), (Q104-pr, Q131-obr) (Табл. Ш-4, Ш-5). Оставшиеся два участка гена амплифицировали стандартным методом ПЦР, используя пары праймеров: (G74-pr, Q104-obr), (Q131-pr, z21) (Табл. Ш-5, Ш-3). В качестве матрицы использовали плазмиду рР10-СЗ. Целые ДНК последовательности генов синтезировали из получившихся частично комплементарных фрагментов методом "мегапраймер" ПЦР. Полученные гены клонировали, трансформировали и экспрессировали в дрожжах P. pastoris как описано в п.4. Был получен и отобран reuphyA-СМЗ.
Ген phyA-Cmod синтезировали из олигонуклеотидов как описано в [142]. Последовательность гена phyA-C была изменена, применяя правило оптимальности кодонов, для экспрессии в дрожжах P. pastoris [143]. Гомология изменённой ДНК последовательности при сравнении с исходной составила 77,9%. Синтезированная ДНК последовательность (ГенБанк №GU 197387) состояла из гена фитазы (1236 п.н.), сайтов для рестрикции эндонуклеазами (14 п.н.) и двух небольших регионов (по 3 п.н.), расположенных на 5- и 3"-концах. Таким образом, длина синтезированной последовательности составила 1256 п.н. ДНК последовательность была поделена на 20 -З") олигонуклеотидов (без промежутков) размером 60 н.о. (Р1 — 64 и.о.; Р2-Р20 — 60 н.о.) and 41 н.о. (Р21), которые служили в качестве прямых праймеров. Обратные праймеры (zl-z21) имели размер 30 п.н., каждый из которых перекрывал два соседних прямых праймера (Р) на 15 п.н. Все праймеры (Табл. ГЛ-3) подбирали с помощью программы Vector NTI, чтобы исключить образование димеров и самокомплементарность. Температура плавления комплементарных праймеров составляла 63±2С.
Далее синтезировали главные фрагменты (F) размером 300 п.н. для F1-F3 и 365 п.н. для F4 (см. раздел «результаты и обсуждение» рис. IV-18,19,20). Для этой цели пять длинных (Р) и пять коротких (z) олигонуклеотидов, соответствующих каждому главному фрагменту F, смешивались вместе. Для синтеза фрагмента F4, использовали шесть длинных и шесть коротких олигонуклеотидов. Прежде всего смешивали каждую пару праймеров Pl/zl, P2/z2....P21/z2 в отдельной пробирке и проводили 5 циклов ГЩР. Немедленно по завершении реакции смешивали содержимое каждых пробирок, соответствующих конкретному фрагменту F, и продолжали ГЩР. По завершении 20 циклов были синтезированы четыре главных фрагмента F1-F4. Для сборки целой ДНК последовательноси гена phyA-Cmod проводили ОЕ-ГЩР, в котором фрагменты F1-F4 служили как мегапраймеры, a Pl/z21 — в качестве внешних праймеров (Табл. Ш-3).
Амплифицированные в ходе ОЕ-ПЦР ДНК последовательности клонировали в вектор рРЮ, трансформировали в клетки Е. coli. Произвольно было выбрано 2 клона и секвенированы ДНК последовательности, соответствующие phyA-Cmod. Одина из них содержала делецию в позиции 224, другая — две делеции в позициях 429 и 924. Для корректировки полученных ДНК последовательностей использовали следующие пары праймеров: Pl/z7, P8/zl6, и P17/z21 для исправления двух ошибок; Pl/z4, P5/z21 для исправления одной делеции (см. раздел «результаты и обсуждение» рис. IV-22). Полученные ПЦР фрагменты чистили с помощью гель электрофореза (для удаления матрицы) и целый ген phyA-Cmod с корректной ДНК последовательностью получали методом ОЕ-ПЦР.
Клонирование, трансформацию и экспрессию phyA-Cmod в дрожжах P. pastoris осуществляли как описано в п. 4. Для сравнения эффективности экспрессии генов phyA-C и phyA-Cmod использовали усреднённое значение фитазной активности десяти лучших штаммов P. pastoris для каждого варианта.
Фитазную активность определяли по накоплению в реакционной смеси свободного фосфат-иона, детектируемого методом Фиске-Субарроу [144] с небольшими модификациями. 100 мкл раствора фермента инкубировали с 900 мкл раствора субстрата (2% фитата натрия в 0,1М ацетатном буфере, рН 4,0) при 37С в течение 30 мин. Количество освобождённого неорганического фосфата анализировали, добавляя 1000 мл красящего реагента (свежеприготовленной смеси, состоящей из 4х объёмов 1,5% молибдата аммония в 5,5% (об.) серной кислоты и 1го объёма 2,5% водного раствора сульфата железа (II)), и измеряя оптическую плотность раствора при 700 нм на спектрофотометре Versamax reader (Molecular Devices, Sunnyvale,CA, USA). За единицу фитазной активности принимали количество фермента, способного высвободить 1 {імоль неорганического фосфата из фитата натрия в минуту.
Для определения удельной активности, фитазы PhyA-Cf и PhyA-CfiVB, очищали с помощью гель-хроматографии [145] на колонках Superdex 75-HR и Superdex 200-HR, соответственно. Образцы были приготовлены с помощью диализа против буфера (50mM Tris-HCl, рН 7.0, 0,5М NaCl) в течение ночи и нанесены на колонку, уравновешенную при помощи такого же буфера. Количество белка на выходе из колонки измеряли при помощи УФ-детектора при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам фитаз PhyA-Cf и PhyA-CfM3, отбирали для дальнейшего анализа. Количество белка определяли по методу Бредфорда согласно инструкции к Bradford Reagent В 6916 (Sigma).
Молекулярную массу белков определяли методом SDS-PAGE электрофореза как описано в [138]. Образцы разделяли в 10%ом натрий додецил сульфат полиакриламидном разрешающем геле, используя Mini-Protein II cell (Bio-Rad Laboratories). Дегликозилирование фитаз проводили при помощи Эндогликозидазы Н и согласно протоколу к Endo Н А 0810 (Sigma). Окрашивание белков в геле проводили с использованием Кумасси бриллиантового голубого R-250 и реактива Шиффа.
Получение генаphyA-СМЗ в результате применения разработанного подхода
Мутантные гены можно было бы подвергнуть ДНК-"шаффлингу". Однако, полученные варианты обычно имеют столько мутаций, что не ясно какие из них оказывают влияние на приобретённые свойства и что, собственно, делать с ними дальше [94].
Для того чтобы улучшить свойства выбранной мутантной фитазы PhyA-Cf3, был разработан подход, основанный на стратегии сфокусированного («полурационального») мутагенеза. В литературе постоянно обсуждают преимущества одной стратегии над другой: «направленной эволюции» [146, 169] и рационального конструирования [66, 170]. Однако периодически возникают сведения об успехах и значительно меньших усилиях при получении ферментов с заданными свойствами, используя «полурациональные» подходы. В последнее время, а именно, непосредственно в литературных обзорах 2010 года [65, 96], авторы указывают на всё более возрастающую важность применения этой стратегии. «Полурациональная» инженерия и дизайн подразумевают совместное использование стратегий «направленной эволюции» и рационального дизайна, а так же консенсусный подход [108, 171]. Также, авторы обзора [94] отмечают всё нарастающую необходимость поиска участков в аминокислотной последовательности ферментов, мутации в которых с наибольшей вероятностью приведут к направленному изменению свойств исследуемого белка. Кроме того, выбор небольших участков для случайного мутагенеза поможет существенно снизить количество мутантных вариантов. Тем самым решится основная проблема направленной эволюции — уменьшение библиотеки мутагенизированного генетического материала.
Попытки поиска таких областей для изменения удельной активности и субстратной специфичности были осуществлены в работе [101]. Также была обнаружена связь мутаций в полу-консервативных регионах с субстратной специфичностью ферментов [172].
Также были предприняты попытки систематизировать сведения о мутациях, приводящих к изменению термостабильности ферментов. Однако данные по этому вопросу пока что не структурированы. Все авторы единогласно отмечают важность регионов, расположенных на поверхности белков [6, 104, 170]. Было открыто, что процесс частичного разворачивания белка прямо вовлекается в поверхностно-расположенные регионы, объясняя, почему именно поверхность белка важна для кинетической стабильности [6]. Предпологают, что большая часть поверхностных аминокислотных остатков не принимает непосредственного участия в каталитической активности, и поэтому поверхностные мутации не будут оказывать существенного влияния на удельную активность фермента [6].
Также, исходя из вышеописанных экспериментов, предположили, что регионы с высокой консервативностью могут служить удачной мишенью для направленного мутагенеза с целью получения термостабильных фитаз. Выравнивание 21 гомолога, принадлежащих к семейству кислых гистидиновых фосфатаз (данные не показаны), показало высокую степень консервативности аминокислот, подвергшихся мутагенезу в данной работе. Так же проводились эксперименты по замене аминокислот с низкой степенью консервативности (данные не показаны), но никакого влияния на изменение термостабильности фитаз это не оказало. Влияние мутаций в консервативных областях аминокислотных последовательностей на термостабильность ферментов также подтверждается следующими работами:
Был проведён статистический анализ положения мутаций, приводящий к увеличению термостабильности белков [104]. В ходе исследования выяснилось, что мутации, влияющие на термостабильность белков, чаще встречаются в консервативных участках (146/195). Большинство мутаций расположено в р-складках, поворотах, петлях и других разветвлённых структурах. 2. В другой работе было обнаружено существование высокостабильных участков, мутации внутри которых не влияли на вторичную структуру. Обычно это были а-спирали [170]. Известно также, что а-спирали не только сохраняют свою вторичную структуру при введении в них различных мутаций, но и структурную стабильность [173-175]. Таким образом возникает потребность поиска регионов, наиболее чувствительных к мутагенезу. 3. В работе [176] было определено, что а-спирали и повороты обеднены консервативными участками, в то время как Р-складки и петли ими изобилуют. Также отмечается, что консервативные регионы важны как для функционирования ферментов, так и для их стабильности. 4. Консенсусная концепция так же доказывает, что существенный вклад в стабильность белка вносит наиболее часто встречающаяся (наиболее консервативная) аминокислота в данной позиции при выравнивании последовательностей гомологов [83, 108, 171]. Все выше приведённые доводы показывают, что консервативные участки аминокислотной последовательности, расположенные на (или близко к) поверхности, могут служить удачной мишенью для мутагенеза с целью увеличения термостабильности белка. Таким образом, был разработан следующий подход: 1. Провести выравнивание гомологичных аминокислотных последовательностей. 2. Оценить возможность применения мутаций, известных для одного гомологичного белка к другому. Выбрать оптимальный вариант фермента для участия в дальнейших раундах мутагенеза. 3. Подвергать случайному мутагенезу не всю область гена, а только участки, соответствующие консервативным аминокислотным областям. 4. Первейшее внимание уделить участкам, расположенным на поверхности белка. 5. Проводить одновременный мутагенез нескольких областей, что повышает вероятность отбора мутанта с необходимыми свойствами [94]. 6. Методами мутагенеза могут быть: error-prone PCR, сайт-направленный насыщающий мутагенез и т.п.
Похожие диссертации на Разработка молекулярно-генетических подходов для оптимизации промышленно-важных характеристик фитазы Citrobacter freundii
