Содержание к диссертации
Введение
Материалы к методы 5-13
Результаты исследований
Статистический анализ и планирование экспериментов в методах оценки мутагенной активности химических соединений .
I. Методы учета генных мутаций на индикаторных бактериях .
а) Тест Эймса /микросомы 14-20
б) Метод промежуточного хозяина 20-25
2.Метод учета рецессивных летальных мутаций на дрозофиле 25-31
3. Метод доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей 31-40
4.Метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей 40-50
5. Метод учета аномалий головок спермиев у мышей 50-62
6.Метод учета хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека 62-56
7.Метод учета сестринских хроматидных обменов в культуре лимфоцитов периферической крови человека 67-72
Обсуждение результатов 73-79
Выводы 80-81
Список литературы 82-93
- Методы учета генных мутаций на индикаторных бактериях
- Метод промежуточного хозяина
- Метод доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей
- Метод учета аномалий головок спермиев у мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с научно-техническим прогрессом перед человечеством встала одна из крупных проблем -борьба с загрязнением окружающей среды. В самом деле, каждый человек повседневно сталкивается с разнообразием физических и химических агентов, включенных в его среду обитания. В по следние десятилетия появились как количественные, так и качественные изменения контакта человека с такими факторами, как радиоактивные соединения, продукты биологического синтеза, пищевые добавки, лекарственные синтетические препараты и др.
Все это выдвинуло неотложные задачи по контролю загрязнения окружающей среда и по разработке научных направлений, которые позволили бы дать всестороннюю оценку влияния этих процессов на человека.
Не подлежит сомнению, что для популяций человека увеличение мутагенных факторов крайне нежелательно. Оно создает реальную основу увеличения генетического груза, прежде всего изменения темпов мутационного процесса. В медико-генетическом отношении это может выразиться в повышении внутриутробной гибели особей, врожденных аномалий развития, наследственных болезней, генетически детерминированной предрасполо— женности к заболеваниям разной природы.
Испытания мутагенности химических и физических агентов на модельных объектах в лабораторных условиях направлены на поиск возможностей уменьшить контакт человека с мутагенными факторами, предотвратить неблагоприятные генетические последствия в случае введения их в среду обитания.
В ряде стран в законодательном порядке приняты специальные программы тестирования, причем такому генетическому контролю подвергаются как уже распространенные и широко применяемые, так и вновь синтезируемые химические вещества.
Проверка на мутагенность химических соединений позволяет наметить мероприятия, приводящие к снижению онкологических заболеваний, а также риска передачи мутационных изменений последующим поколениям, что будет способствовать профилактике спонтанных абортов, недоношенности, а также рождения детей с пороками развития и наследственными заболеваниями.
Лекарства, как и другие химические соединения, способны индуцировать мутации различного типа - генные, хромосомные и геномные мутации. Отсутствие единого метода, позволяющего одновременно зарегистрировать все типы наследственной изменчивости, вынуждают пользоваться наборами методов, так называемыми тест-системами. Число показателей, характеризующих мутагенную активность химических соединений, достаточно велико, причем в одних и тех же тестах разные исследователи могут пользоваться и используют различные показатели мутагенной активности веществ.
До сих пор недостаточно разработаны правила оценки результатов экспериментов, принципы выбора репрезентативных и значимых с биологической точки зрения показателей, а также методов статистического анализа, хотя подобные исследования ведутся как в нашей стране, так и за рубежом С гг , 1970; Яи імаґ, , 1976; Scttvazizna , 1979; Яковенко, 1979). Поэтому ощущается необходимость в унификации как этих показателей, так и методов статистической обработки экспериментальных данных в каждом тесте. Такая необходимость неоднократно отмечалась на заседаниях Европейской и Всемирной ассоциациях мутагенных обществ, на ряде симпозиумов и совещаний
ПО Мутагенам Окружающей СреДЫ {Лас. с/Не Second &/Ч , I973;W.//.0. , mi\CoMm)Uee- І7 , 1975;/Ц І т де». & ., 1977).
Большие трудности у исследователей возникают при работе со слабыми мутагенами, а также в области малых доз, когда тестируемый показатель изменяется незначительно, В подобных ситуациях при использовании некорректных статистик легко придти как к ложно-позитивным, так и к ложно-негативным выводам, что в свою очередь может привести к изъятию ценных химических соединений из сферы обращения, или к занижению потенциальной опасности контакта человека с лекарственными препаратами.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке оптимальных подходов к статистическому анализу результатов оценки потенциальной мутагенной активности химических соединений, вводимых в среду обитания человека. Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи:
1. Выбор и апробация оптимальных показателей мутагенности химических соединений.
2. Выбор методов математико-статистического анализа для оценки результатов тестирования химических соединений на различных биологических объектах.
3. Разработка рекомендаций по планированию экспериментов, в частности, по определению оптимального объема выборки в системной оценке мутагенности лекарств.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые осуществлен унифицированный подход к статистической оценке результатов проверки мутагенной активности химических соединений. Применен и апробирован унифицированный показатель, оценивающий в каждом методе тест-системы вероятность индуцированного возникновения генетических повреждений в геноме. Показана необходимость в практической работе осуществления предварительного преобразования исходных экспериментальных данных, для каждого метода разработаны соответствующие типы преобразований. Выявлено преимущество использования дисперсионного анализа и критерия независимых критериев. Проведена работа в области планирования экспериментов и определены минимальные объемы выборок в различных тестах на мутагенез. Внедрен в практику изучения химических соединений на мутагенность в тестах на индукцию хромосомных аберраций и аномальных спермиев у мышей метод последовательного анализа, что позволило сократить экономические затраты на проведение экспериментов в среднем на 40$.
Материалы проведенных исследований были использованы в соответствующих разделах методических рекомендаций по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов, принятых Фармакологическим Комитетом МЗ СССР (1981), в методических рекомендациях по использованию метода индукции аномальных спермиев как тест-системы для выявления мутагенов среды (1982), а также в ряде других методических рекомендаций, под-готовленных к печати.
Методы учета генных мутаций на индикаторных бактериях
Сущность метода заключается в регистрации способности испытуемого химического соединения и (или) его метаболитов инду-пировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации / viho ( Qmei , 1973). Индика-торные бактерии вместе с исследуемым препаратом, гомогенатом печени млекопитающего и кофакторами (НАДФ, глюкозо 6-фосфат) вносят в слой верхнего полужидкого агара на чашки Петри. Под влиянием ферментов, содержащихся в гомогенате печени млекопитающего, в результате функционирования системы микросомального окисления, препарат может претерпевать ряд метаболических превращений. Как исходное вещество, так и его метаболиты, если они обладают мутагенной активностью, индуцируют мутации у микроорганизмов. В отделе генетики в соответствии с методическими рекомендациями используют в экспериментах индикаторные штаммы SULCHA Ы;пит,им ТА 1950, ТА 1537, ТА 1534, ТА 100 и ТА 98, предложенные Эймсом и сотрудниками ( 1975). Эти штам-мы несут мутации ауксотрофности по гиетидину. Наличие мутагенного эффекта исследуемого препарата учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гиетидину к прототрофности. Вначале в пробирки с агаром вносят раствор препарата в исследуемых концентрациях СОЛ мл), затем в пробирки вносят 0.1 мл суспензии бактерий. После этого вносят 0.5 мл микросомальной активирующей смеси, быстро размешивают содержимое пробирки и выливают его на слой нижнего.минимального агара на чашке Петри. Учет результатов проводят через 48 часов инкубации при 37С. В контрольном варианте в слой верхнего полужидкого агара вместе с суспензией бактерий вносят микросомальную активирующую смесь, а также соответствующий объем растворителя препарата. Описываемый метод является полуколичественным, так как учитывает число селектируемых мутантов, а не частоту индуцированных мутаций. Однако получение данных о той или иной степени превышения числа колоний на чашках с опытными вариантами по отношению к контролю позволяет выявить мутагенную активность исследуемого вещества. Учет результатов эксперимента проводят, подсчитывая число колоний - ревертантов в контрольных и опытных вариантах отдельно на каждой чашке.
В большинстве работ аппроксимируют распределение числа ревертантов ( х ) нормальным законом и используют для статис ТЙЧЄСКОГО анализа ЭКСПерИМеНТОВ г - СТаТИСТИКу (Fziec/ezic/, eld, 1982; AJeou d G(?. ,1982), при этом А/ес,а с соавто рами (1982) рекомендует проводить линейный регрессионный ана-лиз экспериментов, в которых изучается несколько доз исследуемого химического соединения. Есть также предложения аппроксимировать распределение числа ревертантов пуассоновским законом распределения ( AJcrcjLoli , 1980; VJe ihble/н , 1978). В своей работе VJe ibbtei (1978) рекомендует проводить преобразова-ние Sx1 исходных данных и затем анализировать эксперимент с помощью / -статистики, считая, что распределение преобразованных данных соответствует нормальному. Но затем Мсп&о&п (І98І) показал, что дисперсия числа ревертантов зависит от среднего значения и тем не менее распределение не соответствует Пуассону. Gt-afa и \/о@ыах. (1979) рассматривают три модели аппроксимации экспериментальных данных:
1. Отрицательная биномиальная модель со средним /и-, и дисперсией б Л / Л ) / ii 0 (23) 2. Две общепуассоновские модели распределения (?Р1 и GP2 с вероятностью наблюдения X ревертантов причем в первой модели дисперсия пропорциональна среднему 0; = jfa/V; , Xx i ИЛИ 25) в терминах 23) во второй оЬд/3 , (Г і или (27) v . в терминах (23)
В дальнейшем, используя функции правдоподобия, авторы показывают, что их экспериментальным данным наиболее близка модель, основанная на распределении 6PI.
Малый объем информации не позволяет нам достаточно надежно установить вид закона распределения числа ревертантов в наших экспериментах. Однако, как следует из вышенаписанного, мы и не ставили перед собой такую задачу, поскольку для решения вопроса о значимости увеличения числа ревертантов в опытном варианте по сравнению с контрольным гораздо важнее стабилизировать дисперсию тестируемого показателя, чем установить его точное соответствие какому-либо из априорных типов распределения.
Метод промежуточного хозяина
Сущность метода ( Qroi-c)cIae, LeCfQ-Іоч. t 1969) заключается в регистрации способности испытуемого вещества и (или) его ме-таболитов индуцировать мутации у индикаторных микроорганизмов в условиях метаболической активации /и vivo . Тест-культуру бактерий и исследуемый препарат вводят животному (промежуточно ч му хозяину). При инкубации в брюшной полости животного тест-культура подвергается воздействию как исходного соединения, так и его метаболитов, образующихся в организме млекопитающего в процессе функционирования его ферментных систем. При этом метаболическая активация исследуемого вещества происходит в условиях і и і/їм . В экспериментах используют штаммы So(f ot,e/% Jtffibu uhn ТА 1950 и ТА 1534.
В тесте по учету генных мутаций на микроорганизмах с использованием млекопитающего в качестве промежуточного хозяина учитывают два показателя: число ревертантов в единице объема суспензии бактерий индикаторного штамма и число выживающих бактерий из этого же объема ( W ). Мутагенным действием исследуемого химического вещества считают повышение числа ревертантов в опытном варианте по сравнению с контролем. Степень мутагенного действия данного вещества определяют по формуле: т _ х - Хс (30) 1 \л Показатель I есть оценка вероятности индуцированного воз-никновения обратной мутации у бактерии индикаторного штамма.
Этот показатель рассчитывается только в случае выявления значимого увеличения числа ревертантов в опытном варианте по сравнению с контролем. То есть первый этап статистического анализа в этом тесте-сравнение числа ревертантов в опытном и контрольном вариантах-- практически ничем не отличается от статистического анализа в тесте Эймса. Поэтому, и используемые в этом тесте методы статистического анализа такие же, как и в тесте Эймса (смотри глЛА).
Преобразование у= х- стабилизировало дисперсию наших экспериментов (Бобринев и др., 1981). Рассчитанное значение {z -статистики для выборочных дисперсий преобразованных данных не превышает Ь% уровень значимости (смотри табл.4).
В табл.4 приведены выборочные отдельные варианты экспериментов по изучению действия различных доз тубазида и циклофос-фамида на величину мутагенного эффекта с целью проследить изменение дисперсии с ростом среднего значения тестируемого показателя (число ревертантов).
Для выявления активности химических соединений мы предполагаем использовать дисперсионный анализ. Применяя двух-факторную модель с фиксированным фактором - дозой и случайным фактором - промежуточный хозяин (мышь), мы можем выявить эф-фект дозы химического соединения.
Такую модель можно представить в виде: Ш« = ./ + +J 6 j + . (3D где: Ццк - логарифм числа ревертантов на к-ой чашке Петри у j -ой мыши при / -ом уровне дозы м - общее среднее; с/; - эффект / -ой дозы; щ - эффект j- ой мыши; ? « - случайная компонента. Схема вычислений и формулы дисперсионного анализа приведены в табл.1 главы "Материал и методы".
Оценку дисперции неоднородности объектов (мышей) проводи-ли по вышеописанной модели дисперсионного анализа. Общую дис персню показателя ( 6 ) можно представить в виде суммы дис-персий объектов ( б ), умноженной на среднее число чашек Петри от мыши, и случайной дисперсий ( Ое ). Результаты дисперсионного анализа экспериментов с рядом химических соединений, поставленных в отделе генетики НИИ по БИХС, приведены в табл.5. Во всех этих экспериментах от каждой мыши анализировалось по 2 чашки Петри ( к =2).
Пользуясь оценкой дисперсии объектов g,s мт мм ,0,026 и случайной дисперсии ( зі = 0,025) можно по формуле (18) рассчитать число животных ( h ) и число чашек Петри от каждо-го животного (к), для которых с вероятностью (1-А ) мы не можем пропустить эффект, превышающий спонтанный уровень фона в а раз, либо на Л единиц, где Л = 1,64 Г , как следует из формулы 22. Рассчитанные нами значения /ІЙК приведены в табл.6.
Метод доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей
Сущность метода состоит в том, что под воздействием химических соединений-мутагенов у интактных самок после скрещивания с обработанными самцами проявляется повышенная эмбриональная смертность. Смерть развивающегося эмбриона происходит, если яйцеклетка оплодотворена сперматозоидом, несущим доминантную ле-таль. Такое исследование проводится обычно в течение 5 недель, то есть на протяжении как прет, так и постмейотических стадий сперматогенеза, при этом самок к обработанным самцам подсаживают еженедельно. Эмбриональная смертность у самок, забеременевших от самцов, в первую неделю после введения химического вещества свидетельствует о мутационных событиях, произошедших в зрелых спермиях, вторая неделя соответствует поздним сперматидам, третья - ранним сперматидам, четвертая - поздним сперматоцитам и 5 - ранним сперматоцитам. Отсаженных от самцов самок вскрывают на 15-17 день беременности. Мертвые эмбрионы выглядят как темные гомогенные округлые тела диаметром 2,5-3 мм. При вскрытии регистрируют количество живых и мертвых эмбрионов у каждой самки отдельно, кроме того, в яичниках самок можно определять число желтых тел беременности. До 1970 года в основном для проверки гипотез использовали Jf - Критерий ДЛЯ СООТНОШеНИЯ ЖИВЫХ И МерТВЫХ ЭМбрИОНОВ {Sct s о гр , 1973). В 1970 году faDae . (1970) разработал простую генетико-математическую модель.
Эта методика позволяет сделать вывод о наличии мутагенной активности изучаемого препарата. В случае отсутствия достоверного эффекта имеется возможность определить верхний доверительный предел индуцированной летальности, что позволяет в некоторых случаях дать заключение о незначительной активности препарата.
Автор рассматривает следующие показатели: Л Рт =2 желтые тела - имплантанты - уровень доимплан- (38) . 2желтые тела тационных потерь; л Р? = SМерТВЫе ЭМбрИОНЫ - уровень ПОСТИМШіаНТа- /oq\ 2желтые тела тонных потерь; ) Рз = Еживые эмбрионы - уровень выживания (40) " желтые тела
Суммирование производится по всем самкам данной серии. Все эти показатели определяются из первичных экспериментальных данных. Их можно рассматривать как оценки соответствующих вероятностей для овулйрованного яйца: Pj - вероятность гибели до имплантации; Рз" - вероятность гибели после имплантации; Р3 - вероятность выживания.
Предполагается, что число летальных мутаций в гамете следует Пуассоновскому распределению с параметром м (среднее число летальных мутаций в гамете). /Съиде с предполагает независимость и равную вероятность оплодотворения, доимплантационной гибели и выживания для каждого овулйрованного яйца любой самки в каждом варианте эксперимента. Это допущение основано на предполагаемом отсутствии различий между подопытными животными по генотипу, возрасту, массе, условиям содержания. При этих предположениях распределение опытных данных можно рассматривать как биномиальное или пуассо-новское и для оценки результатов эксперимента использовать параметры этих распределений.
Таким образом, определяют верхнюю и нижнюю границы //,w. На первом этапе ставят задачу выявить наличие мутагенной активности у испытуемого препарата, т.е. проверяют гипотезу Н: ЇЇ}неі - 0 . Мы отвергаем Н, если экспериментальные данные про-тиворечат гипотезе Е0 %. %і (в пользу альтернативной -jr 5% ) ЭтУ гипотезу проверяют по критерию \1 , применяемому для сравнения соотношения живых и мертвых эмбрионов в опытных и контрольных группах.
Метод учета аномалий головок спермиев у мышей
Метод индукции аномальных спермиев у млекопитающих химическими соединениями предложен Брюсом с соавторами (Аысе еі«і.% Ї973). Сущность метода состоит в том, что под действием физических или химических агентов у созревающих сперматозоидов меняется форма головки, что может быть зафиксировано в мазках семенной жидкости под микроскопом. Предполагается, что причина появления аномальных спермиев заключается в повреждении генов, отвечающих за морфологию зрелого сперматозоида и, в частности, за форму головки.
Генетическое изучение показало, что форма спермиев высоко наследуема ( /#?; ,ол , 1969, z Ulg , 1970, 1972) и контролируется множественными аутосомными факторами (Л -е , 1973) % И, вероЯТНО, ГенаМИ ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ (Логв/fe f 1970,tizanobjikt 1972). Экспозиция ионизирующей радиацией или/соответствующими химическими агентами / » о приводят к дозово-зависимому увеличению спермиев с аномалиями формы головки.
Эти результаты подтверждены на большинстве видов млекопитающих, включая человека. Метод учета аномалий головок спермиев у мышей может быть успешно использован для скринирования химических соединений, загрязняющих окружающую среду, на зародышевых клетках ( Wtfz.oe&. , 1979).
Препараты для микроскопического изучения морфологии головок аномальных спермиев мышей готовили следующим образом: 4 эпи-димиса от каждой мыши помещали в физиологический раствор на 2-3 минуты, затем переносили их в водный раствор 1% эозина, где их тщательно измельчали ножницами. 2-3 капли полученной суспензии наносили на предметное стекло и делали мазок обычным способом. Анализировали только сперматозоиды с неповрежденным хвостом. Оценку активности исследуемых веществ проводили по показателю "доля аномальных спермиев" (р).
В большинстве работ ошибку средней доли аномальных спермиев высчитывают, исходя из соответствия распределения этого показателя биномиальному (Померанцева и др., 1980, W ro , 1979, tome, 1ъи ei l.\ 1982).
При этом обычно используют для сравнения опытных и конт рольных вариантов \ - критерий либо критерий Стьюдента. В последнем случае априори принимают дисперсию доли аномальных спермиев равной / , где л/ - общее число проанализиро ванных спермиев. В некоторых работах учитывают возможность неоднородности объектов по индивидуальной чувствительности самцов мышей. Так, например, Goad" (1982) в каждом варианте рассчи-тывает долю аномальных спермиев для каждого самца, а затем вычисляет выборочную оценку дисперсии этого показателя по формуле где: h - число самцов в данном варианте.
Сравнение опытных и контрольного вариантов в этой работе проводится по критерию Стьюдента, предполагая нормальность распределения этого показателя и стабильность дисперсии во всех вариантах эксперимента. Последнее предположение отклоняется в работе Sco-i-l (1982). S &ii не делает никаких предположений о распределении тестируемого показателя, применяя для сравнения вариантов непараметрический критерий Вилкоксона. Мы еще вернемся к данным wLt , поэтому приводим их в отдельной таблице (табл.19). Необходимо отметить, что это единственная работа из проанализированных нами, в которой приводятся первичные результаты экспериментов (доли аномальных опермиев для каждого самца, взятого в эксперимент).
Первым этапом наших собственных статистических исследований была проверка корректности предположения о равновероятном изменении морфологии головок опермиев у разных мышей. (Проверка про-водилась методом Брандта-Снедекора (Закс, 1976). В табл.20 при-ведены данные из эксперимента по изучению способности противоопухолевого препарата фотрина вызывать изменения в морфологии головок опермиев самцов мышей гибридов I поколения СВА х С57В /6 (питомник "Столбовая"). Рассчитанное из данных табл.20 значение » \ -статистики (77.6) превышает пятипроцентный уровень значи-мости (41.3), то есть установлены значимые различия в инди-видуальной чувствительности мышей. Следовательно, во всех работах, где априори принимали дисперсию равной /// -Д) /д/ существенно занижали доверительные интервалы. Это может привести к неправильным выводам о достоверности различий опытных и контрольных вариантов (Лекявичус и др., 1983).
Следующий этап наших исследований - изучение поведения дисперсии на фоне изменения среднего значения показателя. Для этой цели мы использовали данные Sco-l-l (табл.І9). В табл.21 приведены средние значения доли аномальных спермиев для различных вариантов эксперимента, проранмированные нами по их величине, выборочные оценки дисперсии тестируемого показателя р, и рассчитано по методу Бартлетта (Закс, 1976) значение \ -статистики для неоднородности дисперсии.
