Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Оценка мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы (обзор литературы) 13
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 28
2.1. Исследуемые факторы 28
2.2. Микроядерный тест на клетках костного мозга 36
2.3. Микроядерный тест на клетках легких экспериментальных животных 38
2.4. Дифференцировка различных типов клеток легкого на суспензионных препаратах экспериментальных животных и человека 41
2.5. Микроядерный тест на эпителиальных клетках слизистой оболочки носа человека 44
3.1. Микроядерный тест на клетках легких человека 47
2.1. Оценка результатов 50
ГЛАВА 3. Оценка цитогенетического эффекта малых доз гамма-излучения в клетках легких мышей 51
ГЛАВА 4. Оценка цитогенетического эффекта химических веществ в клетках легких экспериментальных животных 53
4.1. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксидина в клетках легких и костного мозга мышей микроядерным методом 53
4.2. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксазида в клетках легких крыс 58
4.3. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов симвастатина в клетках легких крыс 60
4.4. Оценка цитогенетического эффекта продуктов химической дезактивации промышленных отходов в клетках легких экспериментальных животных 63
4.5. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксида азота в клетках легкого крыс 72
ГЛАВА 5. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов в клетках органов дыхательной системы человека 76
5.1. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов в эпителиальных клетках слизистой носа 76
5.2. Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легкого больных саркаидозом и другими заболеваниями легких 80
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов 84
6.1. Разработка и усовершенствование методов оценки цитогенетических эффектов факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека 84
6.2. Спонтанные уровни цитогенетического эффекта в клетках легких экспериментальных животных 90
6.3. Значения цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках слизистой оболочки носа человека 92
6.4. Оценка цитогенетического эффекта химических соединений в клетках легких экспериментальных животных 94
6.5. Уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легких больных различными легочными заболеваниями 98
6.6. Оценка дополнительных кариологических показателей, характеризующих цитогенетическое и цитотоксическое действие факторов окружающей среды 100
6.7. Сравнение цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека 103
Выводы 106
Список источников литературы
- Микроядерный тест на клетках костного мозга
- Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксидина в клетках легких и костного мозга мышей микроядерным методом
- Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов в эпителиальных клетках слизистой носа
- Разработка и усовершенствование методов оценки цитогенетических эффектов факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека
Введение к работе
В настоящее время возрастает техногенное загрязнение окружающей среды. В атмосферный воздух ежегодно выбрасываются миллионы тонн пыли, оксида углерода и диоксида серы, сотни тысяч тонн оксидов азота, десятки тысяч тонн других химических веществ. Поступление большого количества вредных веществ в организм человека через органы дыхания приводит к повышению распространенности легочной патологии, и особенно онкологической заболеваемости (Онищенко Г.Г., Новиков СМ., Рахманин Ю.А. с соавт., 2002; Пинигин М.А., 2004; Величковский Б.Т., 2003; Чучалин А.Г. 1998). Опухоли трахеи, бронхов, легкого в последние годы стабильно занимают первое место в общей структуре онкопатологии (41,3 на 100000 населения) (Социально значимые заболевания населения России в 2003 г., 2004; Государственный доклад, 2002). Возрастает необходимость оценки влияния канцерогенных факторов на систему органов дыхания. Проблема профилактики канцерогенного действия факторов окружающей среды является одной из важнейших в мировом сообществе. Первичная профилактика онкологической заболеваемости предусматривает выявление факторов, обладающим канцерогенным действием и их устранением или ограничением распространения в окружающей среде.
В настоящее время существует система исследования канцерогенной активности различных факторов окружающей среды, представляющая собой двухгодичные эксперименты на двух видах лабораторных животных. Однако эти исследования являются длительными, дорогостоящими и проводятся лишь для небольшой части веществ. По определению экспертов ВОЗ «канцерогеном (химическим, физическим или вирусным) называют агент, способный вызвать или ускорять развитие новообразования, независимо от механизма (или механизмов) его действия или от специфичности эффекта. Канцероген - это агент, который в силу своих физических или химических свойств может вызывать необратимые изменения или повреждение в тех частях генетического аппарата, которые осуществляют гомеостатический контроль над соматическими клетками». Вне зависимости от того, на какие организмы действуют канцерогенные факторы, объединяющей их чертой является мутагенный эффект (индукция генных, хромосомных, геномных мутаций). Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования является важнейшей задачей гигиены окружающей среды. (Сычева Л.П., Журков B.C., Рахманин Ю.А., 2003).
Разработаны краткосрочные тесты, позволяющие прогнозировать канцерогенные свойства химических веществ на основе определения их мутагенных свойств (Руководство ВОЗ, 1989; Руководство, 2000). Однако эти тесты не позволяют определять мутагенное действие факторов на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека. Этот аспект проблемы является особенно важным, поскольку доказана органная специфичность действия мутагенов, проявляющаяся в качественных и количественных различиях повреждения генетического аппарата клеток разных органов (Сычева, 2002).
В связи с этим актуальной проблемой является оценка цитогенетических и цитотоксических эффектов различных факторов (Журков B.C., 1986; Курило Л.Ф., Хилькевич Л.В., 1989; Беляева Н.Н., 1997), особенно в клетках органов дыхательной системы. В настоящее время распространен тест по оценке цитогенетической активности факторов на культуре фибробластов легких китайского хомяка. Разрабатываются системы in vitro на эпителиальных клетках легких для оценки мутагенных свойств. Однако, такие исследования не учитывают истинные взаимодействия структур целого организма на молекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях, метаболические особенности целого организма. Среди методов оценки мутагенности в легких in vivo проводятся исследования с помощью метода Comet, позволяющего определять повреждения ДНК, однако при этом не рассматривается дальнейшая судьба таких повреждений. Проводятся единичные исследования по оценке цитогенетической активности факторов в бронхоальвеолярном лаваже экспериментальных животных, при этом не оцениваются мутагенные эффекты в эпителиоцитах - клетках-мишенях канцерогенеза.
Разработанная Л.П.Сычевой (2002) система оценки цитогенетического эффекта in vivo микроядерным методом в клетках различных органов экспериментальных животных на суспензионных препаратах, позволяет проводить оценку мутагенного действия факторов, в том числе и в легких. Этот методический подход может быть использован для разработки методов оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека: эпителиальные клетки бронхов, легких, слизистой носа. Для этого необходима дальнейшая разработка и усовершенствование соответствующих методик, в первую очередь неинвазивных (Рахманин Ю.А., Михайлова Р.И., Зайцева Н.В. с соавт., 2001), их апробация при исследовании различных клеточных популяций дыхательной системы при действии различных факторов, а также определение дозо-временных закономерностей возникновения цитогенетического эффекта.
Таким образом, нерешенные вопросы этой актуальной проблемы позволили сформулировать цель исследования: оценить цитогенетический эффект факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Разработать методики оценки цитогенетического действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.
2. Изучить цитогенетическое действие отдельных химических соединений, их смесей и у-излучения на клетки легкого млекопитающих при ингаляционном или пероральном воздействии.
3. Изучить дозовые и временные параметры изменения уровня цитогенетического эффекта в клетках легкого млекопитающих.
4. Сравнить уровни цитогенетических эффектов в разных клеточных популяциях органов дыхательной системы.
5. Оценить спектр и частоту цитотоксических кариологических показателей эпителиальных клеток в слизистой носа и легких человека.
Научная новизна. Впервые:
- разработан метод комплексной оценки цитогенетических и цитотоксических
показателей клеток органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека;
- определены частоты клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, с центральной ядерной перетяжкой, двуядерных клеток в легких контрольных животных;
- проведена количественная оценка и определены дозовые и временные параметры цитогенетического и цитотоксического действия на клетки легких мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина, продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и пероральном воздействии;
- проведена комплексная оценка и установлены фоновые уровни цитогенетических (клеток с микроядрами и протрузиями) и цитотоксических показателей (клеток с вакуолизацией ядра, кариорексисом, двуядерных и клеток с перетяжкой ядра) в эпителии слизистой носа 224 жителей г. Москвы, а также частоты этих показателей в макрофагах бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальном эпителии браш-биопсии больных бронхолегочными заболеваниями.
Практическая значимость. Материалы исследований использованы при разработке:
- методических рекомендаций: «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным (Москва, 2001);
- методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным (Москва, 2005);
- изобретения «Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких» (заявка №2004113078, приоритет от 28.04.2004);
- изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» (заявка №2005108225, приоритет от 24.03.2005);
Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной активности использованы при обосновании гигиенических нормативов: - симвастатина - ПДК утверждена Минздравом РФ (Дополнение №1 к ГН 2.1.6.1338-03 г. -ГН 2.1.6.1765-03 г.);
- диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированию МЗиСР РФ (протокол от 28.12.04 г.) (Справка о внедрении №2 от13.01.05 г.);
- смеси триэтаполаминных солей сульфированных полихлорировапных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при иероральном поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ (ГН 2.1.5.1316-03).
Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки (Справка о внедрении от 06.12.04 г.).
Индивидуальные выписки, отражающие цитогенетические и цитотоксические показатели эпителия слизистой носа 205 обследуемых, служащих офиса, переданы в медсанчасть для практического использования с целью улучшения состояния здоровья обследованных.
Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках двух плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН (№ госрегистрации 01200303902 2003-2005 гг.; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007).
В работе использованы материалы совместных исследований по оценке цитогенетической активности различных факторов с _ сотрудниками лабораторий: комплексного эколого-гигиенического нормирования, гигиены атмосферного воздуха, гигиены почвы, экологии и гигиены жилой среды, цитогистологии ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН, Института общей генетики РАН, ВНИХФИ, ГУП МосНПО Радон.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на III международной научно-практической конференции «Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты» (Киев, 2002); научной конференции «Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха» и конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи - объект постоянного внимания В.А.Рязанова», посвященных 100-летию со дня рождения академика В.А.Рязанова (Москва, 2003); 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003); 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 124 страницах машинописи, иллюстрирован 29 таблицами и 10 таблицами (приложение) и 7 рисунками. Указатель литературы содержит 134 источника, из них 48 отечественных и 86. иностранных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту
• Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.
• Качественные и количественные параметры цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ (диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина), продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и пероральном воздействии, низких доз у-излучения.
Дозовые и временные закономерности изменения уровня цитогенетического и цитотоксического эффекта в клетках легкого экспериментальных животных.
Сравнение уровней цитогенетических эффектов в разных клеточных популяциях органов дыхательной системы.
Микроядерный тест на клетках костного мозга
Методика приготовления препаратов осуществлялась в соответствии с нашими методическими рекомендациями "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (2001). Кроме того, для ускоренного анализа препаратов клеток легких нами разработана методика приготовления суспензионных препаратов клеток ex tempore. Обе методики приведены ниже. Фиксация материала
Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, вскрывали, легкие выделяли, вырезали кусочек для фиксации. У крыс брали материал в одном и том же месте от определенной доли легкого (средней доли правого легкого), ближе к корню, пластом толщиной 0,5-0,8 см. У мышей фиксировали правое или оба легких полностью. Выделенный кусочек помещали в 10% раствор формалина с рН 7,0. Длительность фиксации не менее 1 месяца. 10% раствор формалина (4% по формальдегиду) готовили из нейтрального формалина, используя 0,1М фосфатный буфер с рН 7,0. Для приготовления фосфатного буфера использовали следующие растворы: А: 1/10 М КН2Р04, Б: 1/10 М ЫагНР04Х 12Н20. Фосфатный буфер готовили перед употреблением, смешивая 390 мл раствора А и 610 мл раствора Б.
Приготовление препаратов клеток легких после фиксации формалином
Фиксированные кусочки легкого промывали в проточной водопроводной воде в течение 8 часов. Затем кусочки помещали в центрифужные пробирки, заливали 1,5 мл 50% раствора КОН из холодильника. Выдерживали 12-14 часов при 20С. Щелочь сливали и добавляли в пробирку 3 мл дистиллированной воды. Выдерживали 1-1,5 часа. Осторожно пипетировали, используя пипетку с пластиковым наконечником, до образования суспензии. Центрифугировали 6 мин. при 1500 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, к осадку добавляли дистиллированную воду, слегка пипетировали для лучшего промывания клеток в суспензии. Центрифугирование повторяли в том же режиме. Пипеткой убирали надосадочную жидкость, оставив 1-2 капли. Осторожно пипетировали. Каплю густой суспензии с помощью пипетки наносили на край сухого, тщательно обезжиренного стекла. Мазок делали шлифованым стеклом под углом 45. Густоту расположения клеток контролировали на пробном препарате под микроскопом.
Приготовление суспензионных препаратов клеток легких ex tempore
Наряду с методикой фиксации клеток легких в формалине нами разработана методика приготовления суспензионных препаратов клеток легких ex tempore. После окончания эксперимента легкие мышей выделяли и измельчали ножницами на часовом стекле. Полученную кашицу помещали в эмбриональную телячью сыворотку и пипетировали. Суспензию фильтровали через капроновую сеточку и центрифугировали при 1500 об/мин. в течение 6 минут, надосадочную жидкость удаляли, из осадка делали мазки. Этот способ приготовления суспензионных препаратов позволяет ускорить анализ материала, но при этом затруднена дифференцировка различных типов клеток легкого. Окрашивание препаратов
Хорошо просушенный препарат помещали на 10 минут в свежеприготовленный фиксатор: смесь этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Высушивали на воздухе. Окрашивали свежеотфильтрованным 2,5% ацетоорсеином в термостате при 37С в течение 1 часа. Промывали в двух сменах дистиллированной воды. Высушивали на воздухе. Цитоплазму клеток докрашивали 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 3-10 мин. Промывали в двух сменах дистиллированной воды. Высушивали на воздухе. Окраску цитоплазмы контролировали под микроскопом.
Анализ препаратов
Препараты анализировали под микроскопом в проходящем свете с помощью объектива с масляной иммерсией при увеличении 10x90. Анализ проводили на зашифрованных препаратах. Подсчитывали не менее 1000 клеток легких на каждое животное, определяли количество клеток с микроядрами. Показателем качества препаратов является небольшое количество разрушенных клеток. Большинство клеток лежит отдельно, хорошо расправлены. Ядра бордового цвета, цитоплазма прозрачная зеленовато-голубая.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме клетки.
Микроядро в клетках с ядром представляет собой хроматиновое тельце, соответствующее следующим критериям: 1) четко отделено от ядра, расположено в цитоплазме клетки; 2) форма - округлая или овальная с ровными краями; 3) окраска соответствует окраске основного ядра клетки; 4) структура - гомогенная, оптически плотная, или, подобно основному ядру клетки, хроматин может иметь диффузный сетчатый рисунок; 5) размер не превышает 1/3 диаметра ядра анализируемой клетки; 6) плоскость расположения микроядра соответствует плоскости основного ядра (определяется при вращении микровинта микроскопа);
Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксидина в клетках легких и костного мозга мышей микроядерным методом
Эксперимент проведен на самцах мышей С57В1/6, масса которых в конце эксперимента составила 20-25 г. Животным ежедневно внутрибрюшинно вводили раствор диоксидина (ex tempore). Животных забивали на 5 и 16 день эксперимента. Исследуемые дозы составили 10, 100 и 300 мг/кг. Контрольным животным вводили дистилированную воду. Приготовление препаратов и оценку мутагенного действия диоксидина в клетках легкого и костного мозга осуществляли в соответствии с разделами 2.3 и 2.2, соответственно. На препаратах клеток легкого анализировали по 1000 клеток трех типов (пневмоциты I типа, пнвмоциты II типа и альвеолярные макрофаги) суммарно.
Полученные результаты по частоте полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами в костном мозге мышей C57BI/6 у отдельных животных и в среднем по группам представлены в таблицах 2 (приложение) и 4.1.1.
Частота ПХЭ с микроядрами в контрольной группе составила 3,13%о. Частота ПХЭ с микроядрами в опытных группах животных после 4 кратного введения диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг была 3,83; 33,0 и 47,4%о, соответственно. Частота ПХЭ с 2 и более микроядрами на 5 день эксперимента после введения диоксидина в дозах 100 и 300 мг/кг была 1,0 и 6,4%о. Отмечается достоверное возрастание частоты ПХЭ с одним микроядром (рис. 4.1.1), а также частоты ПХЭ с 2 и более микроядрами в зависимости от дозы вещества (11=0,80; df=22; Р 0,001) на 5 день эксперимента.
Полученные данные хорошо согласуются с результатами учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей С57В1/6. После пятикратного введения диоксидина в дозе 300 мг/кг отмечалось возрастание цитогенетического эффекта приблизительно в 20 раз (Гусева Н.В. с соавт., 1995).
Полученные результаты по частоте микроядер в клетках легких мышей по отдельным животным и в среднем по группам С57В1/6 представлены в таблицах 3 (приложение) и 4.1.1.
Средняя частота клеток легкого с микроядрами в контрольной группе (объединенная группа животных по 2 срокам воздействия) составила 0,25%о (табл. 4.1.1). Средняя частота клеток легкого с микроядрами в опытных группах животных после введения диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг на 5 день эксперимента была 0,0; 0,4 и 1,6%о,соответственно (табл. 4.1.1). Средняя частота клеток легкого с микроядрами у мышей С57В1/6 на 16 день эксперимента после введения диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг была 0,5; 0,5 и 1,4%о.
Отмечается достоверное возрастание частоты клеток легкого с микроядрами над контрольным уровнем после введения диоксидина в дозе 300 мг/кг при обоих сроках воздействия (рис. 4.1.1). Уровень показателя значимо возрастал с увеличением дозы диоксидина (r=0,51; df=22; Р 0,05).
Доля двуядерных клеток на 5 день воздействия диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг составила 12,67; 8,6 и 11,8%о соответственно и не отличалась от контрольного уровня (9,33 %о). На 16е сутки при действии таких же дозовых уровней доля двуядерных клеток составила 17,0; 19,33 и 25,5%о (табл. 4.1.1). Отмечено зависимое от дозы возрастание доли двуядерных клеток, которое удовлетворительно описывалось линейным уравнением у =13,19 + 0,44х (Fperp = 8,35; Yi = 1; У2 = 19; Р - 0,009) где х - дозы диоксидина (мг/кг), а у - доля двуядерных клеток В %о.
По данным литературы увеличение числа двуядерных клеток легких показано также при действии асбестовых волокон (Lemaire I., 1985), для которых известен свободно-радикальный механизм мутагенного действия, характерный также и для диоксидина (Серединин СБ., Дурнев А.Д., 1992). Минимально действующие дозы (МДД), удваивающая доза (УД) и кратность повышения эффекта над контролем при исследуемых дозах диоксидина были различны в клетках легких и костного мозга (табл. 4.1.2). УД диоксидина по показателю частоты клеток с микроядрами для костного мозга в 5 раз выше, чем для легкого. Возможно, более высокий уровень эффекта диоксидина в костном мозге обусловлен присутствием большого количества макрофагов и нейтрофилов, которые являются основными клетками-индукторами свободных радикалов. Мутагенное действие диоксидина в клетках легких подтверждается выявленным ранее методом щелочной элюции ДНК-повреждающим действием препарата при внутрибрюшинном введении мышам (Абилев С.К., Абдразаков М.М., 1991). В этой работе также показано, что диоксидин индуцирует меньше ДНК-повреждений в клетках печени и почек (МДД -200 мг/кг), чем в легких (МДД - 100 мг/кг). В клетках толстой кишки также показан меньший, по сравнению с легкими, уровень цитогенетического эффекта (Сычева Л.П. с соавт., 2004). С.К.Абилев и М.М. Абдразаков (1991) связывают мутагенный эффект диоксидина в клетках легких с насыщенностью этой ткани кислородом, что способствует генерации свободных радикалов. Более низкая мутагенная активность при действии высоких доз диоксидина в клетках печени, почек и толстого кишечника, вероятно, связана с меньшей интенсивностью свободно-радикальных реакций в этих органах.
Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов в эпителиальных клетках слизистой носа
В процессе отработки методики получения препаратов эпителиоцитов слизистой носа человека оценены предварительные частоты цитогенетических и цитотоксических показателей у 19 волонтеров, проживающих в г.Москве. На препаратах подсчитывали от 250 до 1000 клеток, в сумме проанализировали 11200 эпителиоцитов. Полученные результаты по уровням исследуемых показателей представлены в таблице 5.1.1.
Корреляционный анализ не выявил связи исследуемых показателей с курением и полом обследуемого.
Впервые проведено комплексное исследование нескольких цитогенетических и цитотоксических показателей в назальном эпителии 205 человек, служащих офиса. Оценка исследуемых показателей в эпителиальных клетках слизистой оболочки носа человека проведена в соответствии с разделом 2.5. Полученные результаты по уровням показателей в клетках слизистой носа служащих офиса по каждому индивидууму и в среднем по всей выборке представлены в таблицах 10 (приложение) и 5.1.2.
Доля клеток с микроядрами в эпителии слизистой носа варьировала от 0 до 3 на 1000. Средняя частота равнялась 0,35%о. По 2 микроядра в клетке обнаружены только у 6 человек, и 3 микроядра - у одного из 205 обследованных.
Доля клеток с ядерными протрузиями в эпителии слизистой носа варьировала от 1 до 8, в среднем составляла 1,51%о.
Доля клеток с вакуолизацией ядра варьировала от 3 и до 144, а в среднем составила 58,41%о. Доля клеток с кариорексисом изменялась от 0 до 15, у одного индивидуума составила 22 клетки, в среднем по всей выборке составляла 2,27%о.
Доля двуядерных клеток и клеток с ядерной перетяжкой варьировала от 0 до 10 и 12 клеток на 1000. Средние значения долей по этим показателям составили 2,29%о и 2,849Цсоответственно.
Среди 205 обследуемых в группу риска выделено 44 индивидуума, у которых доля клеток с одним из исследуемых кариологических показателей выходит за пределы За, из них 17 (8,3%) человек по цитогенетическим показателям (табл. 5.1.3). Выявлено 7 человек, у которых доля клеток превышает этот диапазон по 2 показателям, у 1 - по 3 показателям и у 1 - по 4 показателям.
Проведен корреляционный анализ между уровнями показателей в назальном эпителии и индивидуальными данными обследуемых (табл. 5.1.4). Отмечена статистически значимая положительная корреляционная связь доли клеток с центральной ядерной перетяжкой и полом обследованных (более высокие уровни показателей отмечаются у женщин).
Отмечается достоверное увеличение доли двуядерных клеток и клеток с вакуолизацией ядра с возрастом обследуемого. При анализе взаимосвязи между цитогенетическими и цитотоксическими показателями выявлена корреляция частоты микроядер, протрузии, двуядерных и кариоректических клеток с частотой клеток с центральной ядерной перетяжкой. Выявлена значимая связь между долей двуядерных клеток и долями клеток с вакуолизацией и кариорексисом. Также выявлена высоко значимая связь между долей клеток с вакуолизацией ядра и кариорексисом
Таким образом, проведенное исследование позволило отработать методические приемы, установить средние величины и пределы варьирования цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках слизистой оболочки носа человека, выделить индивидуумов в группу риска.
Для оценки частоты микроядер, ядерных протрузий и другими кариологическими показателями в клетках легких человека проведено совместное исследование с сотрудниками ЦНИИ туберкулеза, в котором обследованы больные бронхолегочными заболеваниями. Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легкого человека проведена в соответствии с разделом 2.6. Приготовлены и проанализированы 23 препарата бронхоальвеолярного лаважа и 16 препаратов чрезбронхиальной биопсии легких больных саркоидозом (МКБ - D86.9). Параллельно приготовлены и проанализированы препараты бронхоальвеолярного лаважа больных другими заболеваниями легких. Изучен лаваж 10 больных: 3 случая -экзогенно-аллергическии альвеолит, 2 случая - фиброзирующий альвеолит (J67.9); 2 случая - бронхиальная астма (J45.8); 1 - альвеолярный протеиноз; 1 -хронический бронхит (J42) и пневмония (Л 8.9); 1 - киста и пневмония (Л 8.9). Полученные результаты по частоте цитогенетических и цитотоксических показателей представлены в таблицах 5.2.1 и 5.2.2.
Средние частоты макрофагов с микроядрами в бронхоальвеолярном лаваже в исследуемых группах больных варьировала от 0 до 0,75%о, доля бронхиальных эпителиоцитов с микроядрами составляла 0,42%о. Не найдены достоверные межгрупповые отличия по этому показателю.
Доля макрофагов с ядерными протрузиями варьировала от 0 до 1,0%о, в бронхиальных эпителиоцитах достигала 1,63%о, однако достоверные отличия между группами также отсутствовали.
Разработка и усовершенствование методов оценки цитогенетических эффектов факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека
Одной из важных задач при отработке новых подходов является определение показателей в контрольных группах животных. Нами оценивались уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легких мышей и крыс (табл. 6.2.1). Доля клеток с микроядрами у мышей линий BALB/c, 101/Н, СВА, С57В1/6, гибридов (CBAxC57Bl/6)F, варьировала от 0,5%о до 1,4%о. Наши данные хорошо соответствуют результатам Л.П.Сычевой (2001), где доля клеток с микроядрами для легких гибридных мышей (CBAxC57Bl/6)Fr составила приблизительно 1,0%о и результатам Talbot R.J. с соавторами (1989), которые показали, что доля макрофагов с микроядрами в бронхоальвеолярном лаваже составляет 1,0%о.
Доля клеток легких с микроядрами у белых беспородных крыс (пневмоцитов I типа, пневмоцитов II типа и альвеолярных макрофагов суммарно) варьировала от 0,2%о до 0,5%о, и в среднем составляла 0,43%о. Это значение приближается к данным других исследователей но частоте альвеолярных макрофагов с микроядрами (0,5%о -1,5%о) в бронхоальвеолярном лаваже крыс (Izzotti A. et all., 1996; Das R.K. et all., 1994).
Впервые определена доля двуядерных, клеток на суспензионных препаратах легких мышей (CBAxC57Bl/6)F) и С57В1/6, которая составила 3,0%о и 9,33%о соответственно. Также отмечено соответствие наших данных и результатов Talbot R.J. с соавторами (1989) по доле альвеолярных макрофагов с несколькими ядрами (3,0%о) в бронхоальвеолярном лаваже самок мышей СВА.
В исследованиях на крысах средняя доля двуядерных клеток легкого варьировала от 8,17%о до 15,67%о. В бронхоальвеолярном лаваже крыс доля двуядерных макрофагов варьировала от 11,83%о до 13,3% (Izzotti A. et all., 1996; DasR.K. etall.,1994).
Впервые установлен спонтанный уровень таких показателей как доля клеток с ядерными протрузиями и доля клеток с центральной ядерной перетяжкой в легких. У мышей (CBAxC57Bl/6)Fi и С57В1/6 доля клеток с ядерными протрузиями варьировала от 0,83%о до 2,0%о, а доля клеток с центральной ядерной перетяжкой у мышей (CBAxC57Bl/6)F! составила 19,0%о.
Для легких крыс установлены спонтанные уровни частоты клеток с ядерными протрузиями (в среднем - 1,35%о) и частоты клеток с ядерными перетяжками, которая варьировала от 8,17%о до 14,4%о и в среднем составляла 10,06%о.
Разработанные нами методики оценки цитогенетического и цитотоксического статуса клеток назального эпителия позволило провести массовое обследование здоровых волонтеров обоего пола (выборки из 19 и 205 человек, жителей г. Москвы). Исследование назального эпителия с учетом комплекса цитогенетических и цитотоксических кариологических показателей проведено впервые. Определены значения показателей, которые можно считать фоновыми (табл. 6.3.1). Средние значения и пределы варьирования некоторых из этих показателей определены нами впервые и могут служить ориентиром в дальнейших исследованиях назального эпителия человека. При обследовании 205 служащих офиса доля клеток с микроядрами составила в среднем 0,35%о. Доля клеток с ядерными протрузиями - 1,51%о. Несколько более высокие показатели частоты клеток с микроядрами получены нами ранее на 19 волонтерах - жителей г.Москвы (табл. 6.3.1). Доля клеток с микроядами и ядерными протрузиями в этом исследовании составила 0,8%о и 0,62%о соответственно. Однако суммарный уровень цитогенетических повреждений (доли клеток с микроядрами и протрузиями) был в двух исследованиях близок -1,86%о И 1,42%О. В небольшом числе исследований зарубежных авторов установлены значения некоторых показателей, которые соответствуют нашим данным для условно контрольных групп. Средняя доля клеток с микроядрами в эпителии носа в исследованиях разных авторов определена как 0,25%о (Ballarin
С. et al., 1992); 0,41 %o (Suruda A. et al., 1993); 1,2 %o (Ying C.J. et al., 1997); 2,0%o (Titenko-Holland N. et al., 1996). В этих исследованиях значения показателей почти не отличаются от установленных нами, кроме данных Titenko-Holland N. с соавторами, в работе которых частота клеток назального эпителия с микроядрами оказалась выше. По-видимому, эти отличия определяются разными обследуемыми популяциями.
Впервые установлены фоновые значения доли двуядерных эпителиальных клеток в слизистой носа человека (2,29%о), доли клеток с ядерной перетяжкой (2,84%о). Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными нами ранее на 19 волонтерах, проживающих в г.Москве, где доля клеток с двумя ядрами и центральной перетяжкой ядра составила 3,3%о и 5,71%о соответственно. Также определена доля клеток с кариорексисом и с вакуолизацией ядра, полученные величины составили 2,27%о и 58,41%о соответственно.
Результаты оценки генетических повреждений эпителиальных клеток слизистой носа позволили отнести к группе риска индивидуумов, у которых значения кариологических показателей вышли за пределы За.
![Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс]](/i/i/4357/184412.png "Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс] Бескоровайная Татьяна Сергеевна")