Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1.1. Клинические и гистопатологические признаки Болезни Альцгеймера 11
1.1.2. Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера 13
1.2. Функции генов пресенилшюв , 19
1.2.1.1. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении АРР 20
1.2.1.2. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении Notch 24
1.2.1.3. Другие субстраты внутримембрапного протеолюа пресенилина 30
1.2.2. Обнаружение компонентов -у-секретазного комплекса 34
1.2.3. Участие пресенилинов в аполтозе , , „38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Программы биоинформатики 40
2.2. Векторы, использованные для клонирования 41
2.3. Набор методов для получения рекомбинантных конструкций 42
2.3.1. Эндонуклеазное расщепление ДНК , 42
2.3.2. Переосаждение ДНК 42
2.3.3. Электрофоретическое разделение ДНК фрагментов 42
2.3.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. 42
2.3.5. Лигирование фрагментов ДНК 43
2.3.6. Культивирование клеток Е. coli 43
2.3.7. Транформация клеток Е. coli 43
2.3.8. Отбор клонов, содержащих плазмидные конструкции 43
2.3.9. Секвенирование 44
2.4. Общие методы получения кДНК, геномных копий генов, изучения экспрессии генов (ОТ-ПЦР) 44
2.4.1. Вьщеление геномной ДНК из периферической венозной крови человека , 44
2.4.2. Вьщеление тотальной РНК из периферической венозной крови человека 44
2.4.3. Выделение мРНК 45
2.4.3. Получение кДНК 45
2.4.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 45
2.5. Частные методы, использованные при клонировании, изучении экспрессии генов на уровне транскрипции,., 46
2.5.1. Получение конструкции для наработки N-концевого фрагмента белка hPSl в клеткахE.coli 46
2.5.2. Получение конструкций для экспрессии форм альтернативного сплайсинга hPSl в культурах клеток млекопитающих 46
2.5.3. Изучение экспрессии форм альтернативного сплайсинга hPSl в клетках крови человека 47
2.5.4. Исследование экспрессии IMPAS генов человека . 50
2.5.4.1. Анализ экспрессии ЫМР1 гена в различных тканях и органах человека 50
2.5.4.2. Исследование альтернативных транскриптов гена ЫМР1 50
2.5.4.3. Получение и клонирование полноразмерных копий альтернативных форм сплайсинга гена hIMPI 51
2.5.4.4. Получение и клонирование мутантных форм гена hJMPl 55
2.5.4.5. Клонирование делеционных и мутантных форм гена hPSl 56
2.6. Набор методов для получения и исследования трансфицированных культур клеток млекопитающих 57
2.6.1. Культивирование клеток млекопитающих 57
2.6.2. Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих 58
2.6.3. Трансфекпия культур клеток РС12 с помощью электропорации 58
2.6.4. Траисфекция культур клеток НЕК293 с использованием набора
LipofectAMINE PLUS 58
2.6.5. Получение трансфицированных поликлональных культур клеток РС12 и клонов индивидуального происхождения 58
2.6.6. Выделение высокополимериой геномной ДНК клеточных культур 59
2.6.7. Анализ стабильно-трансфицировапных культур PC 12 с помощью полимеразной цепной рсавдии (ПЦР) 59
2.6.8. Хранение полученных клеточных линии 60
2.6.9. Изучение дифференцировки РС12 клеток.. . 60
2.6.10. Анализ пролиферации клеток РС12 , 60
2.6.11. Изучение апоптоза в трансфицированных культурах клеток РС12 61
2.6.12. Выделение белковых гомогенатов из культур клеток PC 12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг 61
2.6.13. Получение белковых лизатов культур клеток НЕК293. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг ,... 62
2.6.14. Получение антител, использованных в работе 62
2.6.15. Изучение гликозилирования белков , 63
2.7. Материалы и методы исследования на модели дрожжей Saccharomyces cerevisiae 64
2.8. Материалы и методы исследования иа модели нематоды Caenorhabditis elegans 64
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Создание набора плазмидных конструкций, трансфицированных культур клеток млекопитающих, трансгенных линий Drosophila melanogaster , ,. 66
3.1.1. Создание набора плазмидных конструкций 66
3.1.1.1. Плазмидпые конструкции для экспрессии в культуре клеток млекопитающих , 66
3.1.1.2. Плазмидные конструкции для экспрессии генов в трансгенных Drosophila melanogaster 69
3.1.1.3. Плазмидные конструкции для наработки белка в Escherichia coli 71
3.1.1.4. Плазмидные конструкции для дцРНКи в Caenorhabditis elegans 72
3.1.2. Создание набора стабильно трансфицированных культур клеток млекопитающих 73
3.1.3. Получение и анализ трансгенных линий Drosophila melanogaster 74
3.2.1. Исследование изоформ генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур 75
3.2.2. Апоптоз и мутантные пресенилины в поликлоиальных клеточных культурах 77
3.2.3. Мутации и высокий уровень непроцессированной формы hPSl замедляют пролиферативную активность и повышают чувствительность к апоптозу моноклональных PC 12 культур , 83
3.3. Изучение альтернативных транскриптов гена. PSJ человека 90
3.4.1. Обнаружение новых семейств белков, имеющих сходство с пресенилинами 93
3.4.2. РА-домен 99
3.4.3. Ш/М-гены и IMPAS-белки человека 102
3.4.4. Изучение экспрессии ММР1 гена в тканях и органах человека. Исследование альтернативных транскриптов гена hlMPl 105
3.4.5. Изучение экспрессии белка ЫМР1 в клетках млекопитающих. 108
3.4.6. Участие ЫМР1 в протеолитическом расщеплении полноразмерного белка hPSl Ill
3.4.7. IMPAS не является критическим фактором индукции UPR (Unfolded-Protein Response) в Saccharomyces cerevisiae , 114
3.4.8. Ингибирование гена-ортолога hlMPl у нематоды Caenorhabditis elegans
(Ce-imp-2) 116
Заключение 118
Выводы 121
Список литературы 123
- Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении Notch
- Общие методы получения кДНК, геномных копий генов, изучения экспрессии генов (ОТ-ПЦР)
- Анализ стабильно-трансфицировапных культур PC 12 с помощью полимеразной цепной рсавдии (ПЦР)
- Исследование изоформ генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур
Введение к работе
Актуальность темы
Болезнь Альцгенмера (БА) - распространенное нейродегенеративное заболевание людей среднего и позднего возраста. Обнаружение генов ранних семейных форм БА позволило открыть новую область в исследовании молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе БА. Несмотря на значительное число исследований в данной области, патологические механизмы развития БА и, в частности, причины нейродегенеративного процесса, лежащие в основе заболевания, остаются до конца не выясненными. В этой связи, остается актуатьным создание различных моделей БА in vivo и in vitro. Такие модели необходимы для изучения молекулярных основ заболевания, в частности, механизмов взаимодействия генов и регуляции экспрессии генов и белков, лежащие в основе патологии БА. Исследование генов БА важно также для понимания их роли в жизнедеятельности специализированных клеток (нейронов) и функций целого организма (пролиферации, дифференцирОБКи, гисто- и органогенеза). Такие модельные системы чрезвычайно важны для тестирования и поиска лекарственных средств и препаратов, которые можно было бы использовать для терапии БА.
Исследование функций генов пресенилинов {PS), мутации в которых ответственны за большую часть семейных случаев Б А, является приоритетным направлением исследований, важным для понимания молекулярных процессов, приводящих к БА. На сегодня известно около 150 мутаций в генах пресенилинов, вызывающих БА. Детальное изучение механизмов действия различных мутаций в генах PS и форм альтернативного сплайсинга генов PS в модельных системах позволит охарактеризовать особенности патогенеза, вызываемого мутантными формами белков PS.
За последнее время собраны данные, показывающие, что белки PS могут быть особыми аспартатными протеазами, участвующими во внутримембранном расщеплении рецепторных белков типа 1. Одним из субстратов пресенилинов является белок предшественника амилоида АРР. Изменение соотношения продуктов протеолиза АРР в сторону труднорастворимого, фибриллогенного пептида АР42, предполагается, может быть основной причиной амилоидных отложений при БА, запускающих каскад молекулярных процессов, ведущих к гибели нейронов в специфических отделах мозга. Неизвестным остается, каковы тонкие механизмы расщепления АРР белками пресенилинов, и как на эти механизмы влияют мутации в генах PS. Недавно стало ясно, что пресенилины функционируют в составе так называемого у-секретазного комплекса белков. Было установлено, что в состав у-секретазного комплекса, помимо пресенилинов, входят никастрин, АРН-1 и PEN-2. Важно изучить взаимодействия пресенилинов с белками у-секретазного комплекса для выяснения возможных механизмов регуляции протеолитической активности.
Таким образом, актуальной задачей является создание генных конструкций, несущих нормальные и мутантные формы пресенилинов и других компонентов у-секретазного комплекса для исследования экспрессии этих генов в клетках млекопитающих или беспозвоночных. Кроме того, важное направление исследований представляет поиск новых генов, имеющих структурное или функциональное сходство с пресенилинами. В этой связи, поиск и исследование отдаленных гомологов, внутримембранных аспартатных протеаз, работающих по сходным механизмам, позволили бы выделить общие закономерности функционирования протеаз в норме и патологии.
Цели работы и задачи исследования
Целью данной работы было исследовать функции мутантных и нормальных форм генов пресенилинов в различных модельных системах. Был также проведен поиск возможных гомологов пресенилинов с последующей целью описания и первичного определения функций этих белков.
В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
1. Создать модельные системы in vitro и in vivo для изучения функций генов БА. Получить набор рекомбинантных ДНК конструкций, трансфицированных клеточных линий млекопитающих и трансгенных линий плодовых мушек D. melanogaster.
2. Изучить влияние нормальных и мутантных генов пресенилина 1 человека на пролиферацию и чувствительность к апоптотическим стимулам в культуре трансфицированных клеток феохромоцитомы крысы PC 12.
3. Определить и описать формы альтернативного сплайсинга гена пресенилина 1 человека.
4. Провести поиск возможных клеточных гомологов генов PS.
Клонировать удаленные гомологи генов пресенилинов и провести первичный анализ экспрессии в клеточной культуре млекопитающих in vitro, и in vivo - на модели нокаутированных дрожжевых клеток и при ингибировании генов у почвенных нематод C.ekgans методом дцРНК интерференции.
Научная новизна и практическая ценность работы
1. В настоящей работе создан набор плазмидных конструкций, использованных для получения трансфицированных клеточных линий млекопитающих и трансгенных линий D. melanogaster, которые представляют собой модельные системы in vitro и in vivo для изучения молекулярно генетических механизмов Болезни Альцгеймера.
2. Впервые исследовано влияние мутаций C410Y и M146V в генах пресенилинов на пролиферацию и чувствительность к апоптотическим стимулам на модели трансфицированных клеточных культур феохромоцитомы крысы РС12.
3. Выявлены и описаны различные формы альтернативного сплайсинга гена пресенилина 1 человека, а также впервые разработан чувствительный метод детекции транскрипта пресенилина 1 человека с делецией экзона 9.
4. Идентифицировано новое семейство генов-гомологов пресенилинов IMP AS {IMP). Впервые клонированы три изоформы гена ЫМР1, определены некоторые структурно-функциональные особенности IMPI гена человека и его гомологов в системах клеток млекопитающих, беспозвоночных и дрожжей. Получены как теоретические, так и экспериментальные данные свидетельствующие о том, что ЫМР1, как и пресенилин, является политопной аспартатной протеазой.
Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении Notch
Другим наиболее известным субстратом пресенилинов является Notch - важный рецептор сигнальной транедукции, регулирующий выбор путей диффереццировки различных клеток в развитии многоклеточных организмов. Семейство Notch включает эволюционно консервативные белки типа I - с одним трансмембранным доменом, протяженным эктодоменом, направленным во внеклеточное пространство, и более коротким цитоплазматическим С-концом, Экто домен белка содержит EGF-подобные повторы, необходимые для связывания лиганда. После синтеза белок Notch подвергается протеолитическому расщеплению в сайте SI фурин-подобной конвертазой (Рис. 4) и транспортируется в клеточную мембрану в виде гетеро дим ера (Logeat et al., 1998). Активация сигнального пути Notch зависит от связывания лигандов -трансмембран кых рецепторов соседних клеток, принадлежащих к семействам DSL (Delta/Serrate/Lag-2) (Табл. 1). Связывание лиганда активирует протеолиз в S2 сайте при участии металлопротеазы ТАСЕ и с образованием ANotch С-копцевого фрагмента (или NEXT - от Notch Extracellular Membrane Truncation) (Brou et al.,.. 2000) (Рис. 4). ANotch подвергается процессиигу во внутримембранном домене (сайт S3, Рис. 4), с высвобождением внутриклеточного домена NICD (Notch Intracellular Domain). NICD попадает в ядро, где участвует в регуляции многих генов, связываясь с транскрипционными факторами семейства CSL (CBF1, Suppressor of Hairless, Lag-1) (Jarriault et al., 1995; Schroeter et al., 1998; Struhl & Adachi, 1998) (Табл, 1). NICD-CSL комплекс активирует белки семейств HES и HERP - основных репрессоров , содержащих домен Helix-Loop-Helix (bHLH), которые в свою очередь ингибируют тканеспецифичные активаторы транскрипции (Iso et al.,. 2003; обзор). Кроме S3 сайта расщепления известен также S4 сайт, протеолиз в этих сайтах, расположенных внутри мембраны, определяется активностью 7" секретазы (Рис. 4; см.ниже; Okochi et al, 2002). Перечень основных генов, участников Notch -сигнального пути у различных организмах приведен в табл. 1.
Участие пресенилинов в регуляции Notch сигнального пути было впервые показано на нематодах (Caenorhabditis elegans). Один из генов-гомологов пресенилинов у С. elegans - sel-12 был впервые обнаружен при скрининге генов-супрсссоров гиперактивного аллеля lin-12 - гомолога Notch, проявляющегося в фенотипе развития множества вульв. Мутации в sel-12 приводили к нарушению откладки яиц за счет недоразвития вульвы, фенотипу, характерному для мутантов с гипоморфпым аллелем lin-12 (Levitan & Greenwald, 1995). При инактивации двух гомологов пресенилинов у С. elegans (генов sel-12 и hop-І) наблюдали гибель эмбрионов, недоразвитие передней части глотки и экскреторной системы и другие фенотипы, встречающиеся при. инактивации двух Notch генов {lin-12 и glp-1) (Li & Greenwald, 1997) (Табл. I, 3). На модели С. elegans было также показано, что мутантный sel-12 не изменял фенотипа "мультивульв" при повышенной активности Notch гена, получаемой за счет экспрессии внутриклеточного домена NICD (Struhl et al., 1993; Levitan & Greenwald, 1998). Levitan и Greenwald предположили, что SEL-12Упресенилины могут участвовать в расщеплении LIN-12/Notch (Levitan & Greenwald, 1998).
Гомолог пресенилина у плодовой мушки (Drosophila melanogaster) был клонирован в 1997 году (Boulianne et al., 1997). Мутантные линии D. melanogaster с делециями в гене PS имели такие же фенотипические дефекты, как и линии с инактивацией Notch (нейральная гиперплазия, нарушение сегрегации нейробластов, специфические нарушения при дифференцировке имагинальных дисков, гибель на стадии сформировавшейся личинки первого возраста с недоразвитием дорсальной и вентральной кутикулы и. др.) (Struhl & Greenwald, 1999; Ye et al., 1999). На модели трансгенных D. melanogaster было также показано, что Notch белок (полноразмерный, а также ANotch) с транскрипционным фактором GaI4-VP16 (GV), искусственно введенным сразу после трансмембранного домена Notch, подвергался внутримембранному расщеплению. GV-NICD попадал в ядро и активировал репортерную конструкцию UAS-lacZ, регулируемую фактором GV. Такой сигнальный путь был возможен только при нормальной функции PS гена. Экспрессия GV-NICD, приводящая к конститутивной активации UAS-lacZ, не зависела от наличия PS (Struhl & Greenwald, 1999). Показано также, что экспрессия NICD, но не ANotch, могла приводить к спасению фенотилических нарушений при инактивации PS (Struhl & Greenwald, 2001). Из полученных данных следовало, что, как и у С. elegans, действие PS D. melanogaster предшествует ядерной активации генов, и, по всей видимости, PS отвечает за высвобождение NICD в цитоплазму, способствуя расщеплению Notch внутри мембраны.
При изучении фенотипа мышей нокаутированных по гену PSI было обнаружено, что такие мыши умирали вскоре после рождения и имели нарушения развития скелета и структур мозга (Shen et al., 1997). Нокауты по PS2 были жизнеспособны и фертильны. При анализе фенотипа этих мышей были найдены лишь не сильно выраженные сосудистые изменения в легочной паренхиме (Herreman et al., 1999). Мыши с двойными нокаутами по пресенилинам {PSI-!-, PS2-I-) умирали на 9,5-й день внутриутробного развития со множественными дефектами . эмбриональной дифференцировки, которые связывали с глобальным нарушением паттернинга мезодермы (Donoviel et al., 1999; Herreman et al., 1999), Похожий фенотип у мышей наблюдали при инактивации гена Notch] (Swiatek et at., 1994; Conlon et al., 1995).
De Strooper и др. (De Strooper et al., 1999) показали, что в гомогенатах мозга эмбрионов мыши PSJ-/-, количество зрелого белка Notch (процессированного в сайте S1), по сравнению с мышами дикого типа, не изменялось. При трансфекции нейрональпых клеточных культур и фибробластов мышей PS1-/- или PS1+/+ конструкцией, содержащей ANotch, было показано, что продукция NICD ингибировалась в клетках PSl-f- (De Strooper et al,, 1999). В аналогичных экспериментах на бластоцистах с двойными нокаутами по PS1-1-, PS2-I- продукция NICD не детектировалась совсем (Zhang et al,, 2000). Протеасомные ингибиторы MG132, MDL 28170, а также у-секретазный ингибитор на основе конфигурации субстрата - дифлюро-кетонный пептидомиметик MW167, снижали продукцию NICD. При экзогенной экспрессии NICD в иейрональных культурах, внутриклеточный- домен транспортировался в ядро вне зависимости от генотипа PS1-1- или PS1+/+ (De Strooper etal., 1999).
Таким образом, данные об участии пресенилинов в протеолизе Notch и регуляции Notch-зависимой сигнальной трансдукции, согласовывались в различных моделях in vitro и in vivo, как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных. Более того, в экспериментах по коиммунопреципитации на клетках человека и D. melanogaster, было показано физическое связывание пресенилинов с Notch субстратом (Ray et al.,. 1999).
Общие методы получения кДНК, геномных копий генов, изучения экспрессии генов (ОТ-ПЦР)
Клетки PC 12 после электропорации рассевали как для получения поликлоналъных культур трансфектантов (по 250 тыс. на чашку 060мм в 5мл стандартной среды), так и для выделения индивидуальных клонов (по 1 тыс. клеток на лунку 96-ти луночной плашки в 100 мкл стандартной среды). Селекцию начинали на вторые сутки после рассева добавлением в кулътуральную среду антибиотика G418 до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Смену селективной среды проводили через 3-4 суток. Поликлопальные культуры каждого варианта трансфекции снимали с чашек па 14-16-й день селекции в виде суммарного пула G418-резистентных клонов. Индивидуальные клопы трансфектантов выделяли только из тех лунок, в которых в результате селекции выросли единичные колонии. В результате указанной схемы достигалась независимость происхождения индивидуальных клонов.
Растущие в монослое клетки РС12 (5-10 млн.) снимали механически с подложки, осаждали центрифугированием при 1500 об./мин. в течение 5 мин. при 4С, отмывали буфером TBS (135 мМ NaCl, 5 мМ КС! и 25мМ Трис-НСІ, рН 7,4) и центрифугировали (1500 об./мин., 10 мин.). Для выделения препарата ядер осадок клеток ресуспендировали в 2 мл раствора CLB (0,32 М сахарозы, ЮмМ Трис-HCl рН 7,6, 5мМ MgCh, 1% Triton Х-100) и лизат центрифугировали при 4000 об./мин., 5 мин., 4С. Осадок ядер ресуспендировали в 3 мл раствора PLB (ЮмМ Трис-НСІ рН 8Д ЮмМ NaCI, 10мм ЭДТА), добавляли саркозил (до конечной концентрации 2%) и протеиназу К (до конечной концентрации 100 мкг/мл) и инкубировали при 65С в течение 2 ч. Затем последовательно осуществляли деиротеи низанию равным объемом фенола, смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1). К раствору ДНК добавляли 2.5 объема 96% этанола, осаждали ДНК центрифугированием (4000 об./мин., I мин.), ДНК промывали 70% этанолом и растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-НСІ, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). полимерашой цепной реакции (ПЦР)
ПЦР-анализ проводили в стандартных условиях (см. выше) при 25 циклах амплификации с использованием Taq-полимеразы и пары праймеров 5 -CTCCAGCAGGCATATC, 5 -ACCTCGTCCCTCAAATCTG. Геномную ДНК клеточных культур добавляли в количестве 40 нг на одну реакцию. Размер ПЦР- продукта составлял 1007 п.н, Полученые ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле.
Для сохранения полученных линий, клетки замораживали. Клетки механически сбивали с поверхности чашки или флакона, гомогенизировали в 100% сыворотке и добавляли 7% ДМСО (Serva), после чего аликвоты клеток по 1 мл охлаждали в холодильнике при +4С, затем переносили в кельвинатор, для кратковременного хранения при -70С и, наконец, в жидкий азот для долговременного хранения.
Для индукции иейрональной дифференцировки под действием фактора роста нервов (NGF) клетки изучаемых линий и клонов рассев ал и на среду, содержащую 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 нг/мл NGF, по 2 тыс. на лунку 9б-луночной плашки и по 12,5 тьтс. на лунку 24-луночной плашки. Каждые 3 дня в культуральную среду добавлялим свежий NGF до концентрации 100 нг/мл.
Рост и гибель клеток определяли по изменению их числа, вычисляемого по показателям оптической плотности при добавлении МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил тетразолиум бромид) - витального реагента, имеющего тропность к митохондриям живых клеток (Shearman, 1994). Для определения ростовых характеристик клетки рассевали по 2 тыс. на лунку 96-луиочной плашки плашки-и по 12,5 тыс. на лунку 24-луночной плашки. В каждой временной точке показатели снимались с 3-4 лунок после инкубации с ОД мг/мл МТТ в течение 4 ч с последующим 3-часовым лизисом и определением оптической плотности при 600 нм. Полученные в результате эксперимента значения соотносили с числом клеток по предварительно построенной калибровочной кривой.
В экспериментах по изучению апоптоза клетки каждой культуры рассевали на покровные стекла. Визуализацию апоптоза в клетках проводили при помощи окраски флуоресцентным красителем Hoechst 33258, связывающим ДНК (возбуждение 340 им, барьерный фильтр 510 нм). Подсчет клеток проводили на 3-4 стеклах в 5 случайных полях на каждом стекле при увеличении х400. Апоптотическими считали клетки с ядрами, окрашенными флуоресцентным красителем, сжатыми или демонстрирующими явную фрагментацию.
Электрофорез белков в полнакриламидном геле. Вестерн-блоттингАнализируемый белок выделяли из трансфицированных и контрольных клеток. Клетки млекопитающих (5-10 млн.) снимали механически с подложки и осаждали центрифугированием в течение 5 мин. при 1000 об./мин. Осадок отмывали дважды путем ресуспендирования в 7 мл буфера PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCI, 1,5 мМ КН2РО4, 8 мМ Na2HP04) и последующего центрифугирования (5 мин., 1000 об/мин.). Затем осадок ресусиендировалн в ЮРА-буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), содержащем ингибиторы протеаз (1 мМ бензамидина, 50 мкг/мл PMSF, 1 мкг/мл апротинина) из расчета 75 мкл на 10 млн. клеток и лизировали с помощью 3 кратного замораживания-оттаивания. Для механического разрушения мембраны клеточный лизат 12-15 раз пропускали через иглу Гамильтоновского микрошприца, добавляя 25 мкл (на 10 млн. клеток) RIPA-буфера с детергентами (до конечной концентрации 0,1% ДСН, 1% Тритон Х-100, 1% дезоксихолат Na) и инкубировали в течение ночи при 4С. Пробирку с гомогенатом центрифугировали в течение 1 часа при 14000 об./мин., 4С. Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку и хранили в кельвинаторе при -70С. Определение количества тотального белка в клеточных гомогенатах проводили с помощью метода Лоури в модификации Петерсона (Peterson, 1977), используя в качестве стандарта БСА (Sigma, США). Электрофоретическое разделение проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в 10-12% ПААГ гелях. На каждую дорожку наносили по 30 мкг белка. Использовали камеру для электрофореза и оборудование для приготовления гелей фирмы Hoeffer Scientific Instruments.
После электрофоретического разделения белки переносили на нитроцеллтолозную мембрану Hybond ECL (Amersham) с помощью прибора Bio-Rad при 0,8 мА/см2 в течение 90 мин, в буфере для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 15% метанол, рН 8,3). Для детекции белковых полос на нитроцеллюлозной мембране использовали первичные антитела к N-концевой части PS1 (ак 1-92). В качестве вторых антител применяли антитела против IgG кролика коньюгировашше с пероксидазой хрека (Amersham). Визуализацию комплексов проводили с использованием набора ECL (Amersham). 2.6.13. Получение белковых лизатов культур клеток НЕК293. Электрофорез белков в полиакриламндном геле, Вестсри-блоттинг Клетки перед лизисом два раза промывали холодным PBS-буфером, лизировали в модифицированном RIPA-буфере (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1% NP-40, 0,25% дезоксихолата натрия, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 таблетка «коктейля» ингибиторов "Complete, Mini, EDTA-free" (Roche) на 10 мл буфера) в течение одного часа при 4С, центрифугировали при 10000 об,/мин. в течение 15 мин. при 4С. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку, определяли концентрацию белка по методу Брэдфорда (Bredford, 1976) , и использовали для нанесения на гель. Электрофоретическое разделение проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в 10-12% ПААГ гелях. На каждую дорожку наносили по 5-10 мкг белка. Белковый перенос осуществляли на мембрану PVDF ("Amersham Pharmacia Biotech") в буфере для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 15% метанол, рН 8,3), в течение 12 часов при 30 В. Для детекции белков на блоте использовали первичные антитела к N-концевой части PS1 (ак 1-92), антитела к 17 ак N-терминального участка белка ЫМР1, коммерческие антитела к эпитопам V5, с-тус, и соответствующие вторичные антитела.
Анализ стабильно-трансфицировапных культур PC 12 с помощью полимеразной цепной рсавдии (ПЦР)
Конструкции, представленные в табл. 11, были использованы для получения и анализа трансгенных линий D. melanogaster, экспрессирующнх нормальные и мутантные формы генов пресенилина и никастрина. Целью исследования было изучить влияние экспрессии генов нресепилинового комплекса на алоптоз в различных тканях, при скрещивании полученных
трансгениых линий с различными GAL-4 линиями. Л инии D. melanogaster с направленной экспрессией фактора транскрипции GAL-4 широко используются для тканеспецифической экспрессии любых эффекторных генов. Изучаемые гены были клонированы в pUAST вектор, содержащий сайты связывания GAL-4, ТАТА-бокс гена теплового шока hsp 70, маркерный ген окраски глаз white, ограниченные концевыми повторами Р-элемента (РЗ and Р5 ) (Табл. II).
Трансгенные линии были получены в сотрудничестве с Шостак Н.Г. и Павловой Г.В. (ИМБ РАН, ИБГ РАН). Конструкции вместе с коиструвдией-хелиером, инъецировали в яйца мух линии Df(l)w67c23(2)y, мутантньтх по окраске глаз (белые глаза). Трансформантов (F0) отбирали по окраске глаз (от желтого до морковного). Далее самцов-трансформантов (F0) скрещивали с Df(l)w67c23(2)y, F1 трапсформантов скрещивали между собой для выведения гомозиготных линий, которые далее скрещивали с балансерной линией ТМЗ. Независимые гомозиготные трансгенные линии с определенной локализацией вставки были получены для следующих конструкций (подробные данные не приведены, в скобках указано число линий):
1) PS1 человека - hPS 1 wt -pUAST (7)
2) PS D.melanogaster pUAST - PS wt (1), pUAST - PS C114S (6), pUAST - PS L468V (15), pUAST - PS N1571 (1);
3) Net человека pUAST - HumPAMP(6), pUAST - rautHumPAMP(12), pUAST -delHumPAMP (9);
4) Net D.melanogaster pUAST -DrPAMP (15).
Полученные линии были в дальнейшем исследованы в Университете Торонто (Канада, PS линии) и в Университете Пенсильвании (США, N. Lukinova, М. Fortini, Net линии). Было изучено влияние гиперэкспрессии нормальных и мутантных форм гена PS (несущих мутации, аналогичные мутациям при БА в генах hPSl (C92S, L392V) и hPS2 (N1411)), а также нормальных и мутантных форм гена Net (несущих мутации или делению функционально-критического сайта для АРР протеолиза - DYIGS) на развитие фасеток глаз D. melanogaster. Известно, что развитие глаза у мух происходит при участии Notch системы сигнальной трансдукции, нарушение функций гена PS приводило к нарушению структуры фасеток, увеличению числа апоптотических клеток в развивающемся глазе (Ye & Fortini, 1999). Направленная экспрессия трансгена в имагинальных дисках глаз мухи в наших экспериментах ни в одном из случаев не приводила к феиотипическим изменениям структуры фасеток глаз и соответствовала контрольной линии, экспрессирующей только GAL-4. Это свидетельствует о том, что мутации БА в PS, а также мутации в Net, критические для протеолиза АРР, не нарушают основных функций, важных для развития и жизнедеятельности организма, например, Notch системы сигнальной трансдукции.
Исследование функций различных форм гена hPSl было проведено на трансфицированных культурах, созданных па основе клеток феохромоцитомы крысы РС12, которые являются удобной и широко используемой моделью для изучения процессов нейрональной дифференцировки и клеточкой гибели, т.к. под действием фактора роста нервов (NGF), добавляемого в культуральную среду, данные клетки приобретают нейрональноподобный фенотип.
На первом этапе работы в клетки PC 12 методом электропорации вводили ДНК вектора pcDNA3 и сконструированных на его основе плазмид: pcPSIwt (со вставкой кДНК формы гена hPSl дикого типа) и pcPSlC410Y (со вставкой кДНК мутантной С410Y формы гена hPSl), а также в следующей серии экспериментов — pcPSlM146V (со вставкой кДНК мутантной M146V формы гена hPSl).
Точечные мутации C410Y и M146V в гене hPSl характеризуются аутосомно-доминантным наследованием и приводят к развитию наиболее агрессивной ранней семейной формы БА (Sherrington, RogaeY et al., 1995; Alzheimer s Disease Collaborative Group, 1997). Выбор мутаций, использованных в работе, определялся также положением аминокислотных замен как в амино-(M146V), так и в карбокси- (C410Y) терминальных участках белка,
В результате трансфекции и последующей селекции на устойчивость к антибиотику G418 (все рекомбинантиые плазмиды несли ген резистентности к неомидину пеог) были получены 4 поликлональные культуры, а именно: К-poly (трансфекция вектором pcDNA3), wt-poly (pcPSlwt) и C410Y-poly (pcPSlC410Y) и M146V-poly (pcPSlM146V).
Каждая поликлопальная культура представляла собой суммарный пул из 300-400 G418-pe3HCTeHTHbrx клонов. Параллельно с выделением поликлональных культур были отобраны индивидуальные клоны независимого происхождения для каждого варианта трансфекции (Табл. 14). Независимость происхождения клонов обеспечивалась с помощью экспериментально подобранной стратегии рассева и селекции трансфицированных клеток (см. Материалы и методы).
ПЦР-анализ геномной ДНК полученных поликлональных культур и клонов показал, что в каждом варианте трансфекции все поликлональные культуры и приблизительно 75-80% клопов, резистентных к G418, содержали вставки кДНК гена человека PS1.
В положительных по данным ПЦР-анализа культурах и клонах была проанализирована экспрессия белкового продукта трансгена. Для проведения Вестерн-анализа использовали полученные нами поликлональные антитела к N-конпевому участку белка hPSl (см, Материалы и методы).
Вестерн-анализ показал, что в поликлональных культурах wt-poly, C41QY-poly и M146V-poIy, в отличие от контрольной культуры К-ро1у, наблюдался сигнал в районе 43-45 кД, соответствующий непроцессированному белку экзогенного PS1 человека. Кроме того, во всех культурах присутствовала 30 кД форма эндогенного пресснилина крысы (степень гомологии крысиного и человеческого пресенилинов 96%) (Рис. 7, А).
Исследование изоформ генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур
В дальнейших экспериментах проверялось как мутации в критических аспартатных остатках hlMPl (D219A, D265A), а также в консервативном пролиновом остатке (P317L) повлияют на протеолиз hPSl holo. Оказалось, что перечисленные мутации в высоко-консервативных сайтах hlMPl ингибировали протеолиз hPSl holo (Рис. 28). Напротив, искусственная БА-мутация (аналогичная замене в пресенилине, вызывающей БА) - G264A в ЫМР1 не приводила к какому-либо видимому изменению протеолиза в отношении hPSl holo (Рис. 28). 3.4.7. IMP AS ие является критическим фактором индукции UPR (Unfolded-Protein Response) в Saccharomyces cerevisiae UPR - ответ эукариотических клеток на накопление "несвернувшихся" белков в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). У Saccharomyces cerevisiae ответ начинается с активации IRElp - бифункционального белка ЭР, имеющего серин-треонинкиназную и эндорибонуклеазную активности. IRElp единожды пронизывает мембрану ЭР, ориентирован N-терминалъным концом в полость ЭР и С-концом (несущим киназный и нуклеазный домены) - в цитозоль. N- терминальный конец выполняет роль сенсора, улавливающего накопление непроцессированных белков в ЭР. Активация IRElp приводит к его аутофосфорилированию и олигомеризации, что в конечном итоге включает эндорибонуклеазную активность. Субстратом для IRElp является мРНК, кодирующая UPR-специфический фактор транскрипции - HAClp, активирующий гены-регуляторы нормального свертывания белков в ЭР, а также гены, ответственные за уничтожение белков ЭР.мРНК НАС1 экспрессируется конститутивно, но для начала трансляции необходим сплайсинг, происходящий при участии IRElp рибонуклеазы и тРНК лигазы RLGlp и не требующий образования сплайсосомы (Tirasophon et al., 1998).
У млекопитающих идентифицированы два гомолога дрожжевого IRElp - IRE1 аи IRElp (Tirasophon et al., 1998; Wang et al., 1998). HAC1 mRNA дрожжей может корректно сплайсироваться в клетках млекопитаюпщх (гомолог НАС1 у млекопитающих не был найден); сплайсинг регулируется по механизму UPR. Кроме того, показано, что UPR в клетках млекопитающих индуцирует внутримембранное протеолитическое расщепление олигомера IRE1, С-фрагменты которого попадают затем в ядро для возможного участия в сплайсинге (Niwa et al., 1999), Было показано, что в клетках, нокаутированных по пресенилину 1 {PS1-1-), либо несущих мутации БА (Katayama et al., 1999), снижалось индуцирующее воздействие стресса ЭР на экспрессию ВІР (белка-шаперона ЭР, обеспечивающего правильное свертывание белков), уровень IRE la и IRElp С-фрагментов в ядре при ЭР-стрессе снижался. Предполагается, что IRE1 могут быть дополнительным субстратом для пресенилинов, участвующих в у-секретазном расщеплении трансмембранных белков первого типа (Katayama et al., 1999). Следует отметить, однако, что исследования другой группы не подтвердили участие пресенилииов в индукции UPR через IRE1-компонент (Sato et al., 2000).
Вопросы о том, происходит ли протеолитическое расщепление IRElp у дрожжей, и если да, то необходимо ли оно для индукции UPR ответа, до сих пор остаются нерешенными. Поскольку гомолог пресенилина у дрожжей найден не бьш, то мы решили проверить, возможно ли участие IMPAS белка в протеолитического расщепления IRElp - повлияет ли отсутствие гена, кодирующего IMPAS S, cerevisiae на индукцию UPR - ответа. Для этого были заказаны гаплодные линии а и а, у которых необходимый ген {IMPAS YKLlOOc или Irel - YHR079c) замещался геном устойчивости к канамицину (Euroscarf). Irel (-) линии использовались в качестве положительного контроля, т.к. такие линии не должны были расти при индукции стресса в ЭР (Сох et al., 1993). В качестве отрицательного контроля мы использовали исходные линии, используемые для получения нокаутов. Дрожжевые клетки различных гаплоидных линий высевались на чашки со средой, содержащей 1 мкг/мл туникамицина (антибиотика, ингибирующего N-гликозилирование и вызывающего UPR). Чашки инкубировали в течение трех суток в темноте при 37С. В то время как линии с делецией Irel не росли на чашках с туникамищшом, ли нии YKLlOOc (IMPAS -) ничем не отличались в росте от контрольных. Т.е. индукция UPR-ответа в линиях с делецией IMPAS гена проходила так же, как и в исходных линиях.
Кроме того, мы исследовали морфологию и время начала споруляции в полученных диплоидных линиях (Ire - /-, IMPAS - /- и исходной линии), т.к. известно, что транскрипция гена импаса у S. cerevisiae активируется во время споруляции (Chuet al., 1998). Отличий в сроках начала споруляции и в морфологии спорулирующих клеток в опытных и контрольных линиях не найдено.
Таким образом, мы показали, что IMPAS не является жизненно-необходимым геном и необходимым фактором индукции UPR-ответа у S. cerevisiae.
3.4.8. Иигибировашіе геїіа-ортолога ЫМР1 у нематоды Caenorhabditis elegans (Ce-imp-2)
Почвенная нематода Caenorhabditis elegans - одна из наиболее популярных моделей изучения функций генов in vivo. В процессе развития черви последовательно проходят следующие этапы развития: яйца (эмбриональное развитие), личиночных стадий LI, L2, L3, L4 и взрослой особи. Личиночные стадии разделяются четырьмя линьками (L1-L2; L2-L3; L3-L4; Ь4-взрослая особь), при которых происходит сброс старой кутикулы.
Для определения функций IMP AS генов и кодируемых ими белков в целом организме, проводили инактивацию ортолога MMPI гена в С. elegans с помощью двуцепочечной РНК интерференции (дцРНКи, dsRNAi) и изучали полученные фенотипы (см. Материалы и методы). В качестве контроля использовали дцРНК гена GFP.
В геноме С. elegans было идентифицировано три гена IMPAS, названных Ce-imp-1, Ce-imp-2, Се-Ітр-3. С помощью филогенетического анализа было установлено, что ортологом человеческого гена ІМР1 является Ce-imp-2. Процент идентичных/сходных ак для полноразмерных IMPAS белков составлял hlMPl/ Ce-IMP-1 (14/27); ЫМР1/ Се-ІМР-2 (30/46); ЫМР1/ Се-ЇМР-3 (12/29) (группы сходных аминокислот: 1-DN,2-EQ,3-ST,4-KR,5-FYW,6-LIVM). Ген Ce-imp-2 был выбран для дальнейшего исследования методом дцРНКи.
При инъекции дцРНК Ce-imp-2 в полость тела червя (Р0), наблюдали гибель 80-100% червей первого поколения (F1) из поздней эмбриональной -ранней личиночной (L1) стадиях (Табл. 18). Известно, что метод инъекции дцРНК часто обладает более сильным эффектом, чем метод "кормления" (см. Материалы и методы). Поэтому, для изучения возможных фенотипов, связанных с умеренной инактивацией гена, проводили ингибирование Ce-imp-2 с использованием в качестве корма клеток Е. coli, продуцирующих дцРНК данного гена. При этом, помимо эмбриональной гибели, наблюдали задержку роста личинок, нарушение координации движения, а также гибель червей на всех личиночных стадиях в результате нарушения процессов линьки. Специфический фенотип нарушения процессов линьки был связан с невозможностью сброса старой кутикулы в голове и, реже, в хвостовой области или в средней части тела (Рис. 29). На контрольных чашках фенотип червей соответствовал дикому типу, видимых аномалий в развитии выявлено не было.
Таким образом, было показано, что ген Ce-imp-2 критически важен для
нормального морфогенеза червя. Ce-imp-2 играет важную роль как в
эмбриональном развитии С elegans, так и в личиночном, обеспечивая нормальное прохождение процессов линьки. Т.к. Ce-imp-2 является высококонсервативным гомологом гена ММР1 можно сделать предположение о важной роли гена IMP1 человека в развитии.
