Содержание к диссертации
Введение
1. Геномный импринтинг - эпигенетическиии феномен регуляции дифференциальной активности аллельных генов импринтированных локусов 14
1.1. Геномный импринтинг фактор неэквивалентности материнского и отцовского геномов у млекопитающих 16
1.2. Геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы 21
1.3. Идентификация и особенности импринтированных генов 24
2. Процессы метилирования деметилирования ДНК основной механизм возникновения геномного импринтинга 31
2.1. Формирование паттернов метилирования 31
2.2. Метилирование ДНК - основной механизм импринтирования генов 38
2.2.1. Этапы метилирования - деметилирования генома в онтогенезе мыши 38
2.2.2. Нарушение геномного импринтинга в результате мутаций, затрагивающих процессы метилирования 44
2.3. Болезни человека, обусловленные нарушением геномного импринтинга 48
3. Геномный импринтинг и проблема партеногенеза у млекопитающих 52
3.1. Способность к партеногенезу в различных группах животных 52
3.2. Типы партеногенетических зародышей и особенности партеногенетического развития яйцеклеток млекопитающих , 54
3.3. Получение искусственных партеногенов млекопитающих 56
3.4. Развитие и причины гибели партеногенетических зародышей млекопитающих 58
3.5. Развитие партеногенетических клеточных клонов в составе химерных организмов млекопитающих 61
3.5.1. Партеногенетические химеры 64
3.5.2. Андрогенетические химеры 69
4. Партеногенез и модуляция эффектов геномного импринтинга 73
4.1. Деметилирование ДНК и модуляция эффектов геномного импринтинга 73
4.2. Характеристика соединений, обладающих выраженными деметилирующими свойствами 78
4.2.1. Деметилирующее действие 5-азацитидина и модуляция экспрессии генов 78
4.2.2. Деметилирующие свойства ретиноевой кислоты 80
4.3. Влияние генетической среды на эффекты геномного импринтинга 82
4.4. Модуляция экспрессии импринтированных генов полипептидными ростовыми факторами 84
Часть II Собственные исследования
5. Материалы и методы 88
5.1. Экспериментальные животные 88
5.1.1. Анестезия, умерщвление 88
5.1.2. Вазэктомия 89
5.1.3. Суперовуляция, датировка беременности, выделение ранних эмбрионов мышей 89
5.2. Получение партеногенетических зародышей 90
5.3. Культивирование in vitro одноклеточных эмбрионов до стадии бластоцисты 90
5.4. Получение партеногенетических химер 91
5.4.1. Агрегация восьмиклеточных эмбрионов и трансплантация бластоцист в матку ложнобеременных самок 91
5.4.2. Анализ распределения партеногенетических клеточных клонов в составе химерного организма 93
5.4.2.1. Распределение партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове химер C57BL/6 D BALB/c 93
5.4.2.2. Распределение партеногенетических клонов в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаза 95
5.5. Культивирование in vitro нормальных (оплодотворенных) и партеногенетических эмбрионов мышей на постимплантационных стадиях развития 97
5.6. Электрофоретический анализ изоферментов глюкозофосфатизомеразы 97
5.7. Анализ влияния деметилирующих соединений на нормальные (оплодотворенные) и партеногенетические эмбрионы мышей 100
5.7.1. Обработка 5-азацитидином 100
5.7.2. Обработка ретиноевой кислотой 101
5.8. Анализ влияния ростовых факторов на партеногенетических эмбрионов мышей 101
5.9. Анализ экспрессии импринтированногр гена Igf-2 методом in situ гибридизации на тотальных препаратах и гистологических срезах 102
5.10. Статистическая обработка данных 104
6. Результаты 105
6.1 Партеногенетическое развитие эмбрионов мышей - модельная система для изучения геномного импринтинга в эмбриогенезе млекопитающих 105
6.1.1. Изучение межлинейных различий в способности к партеногенетическому развитию эмбрионов мышей C57BL/6 и СВА 105
6.1.2. Влияние 5-азацитидина на экспрессию генов локуса Gpi-1 на ранних стадиях преимплантационного развития нормальных (оплодотворенных) эмбрионов мышей C57BL/6 и СВА 110
6.1.3. Пролонгирование развития нормальных и партеногенетических эмбрионов на постимплантационных стадиях in vitro 113
6.1.3.1. Культивирование нормальных (оплодотворенных) постимплантационных эмбрионов 114
6.1.3.2. Культивирование диплоидных партеногенетических эмбрионов линии СВА 117
6.1.3.3. Культивирование диплоидных партеногенетических эмбрионов (СВА xC57BL/6)Fl 120
6.2. Модуляция эффектов геномного импринтинга при изменении генетической среды 121
6.2.1. Анализ партеногенетических клеточных клонов у химерных мышей C57BL/6(PG) -»BALB/c 121
6.2.1.1. Постнатальное развитие партеногенетических химер 121
6.2.1.2. Распределение партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове 122
6.2.1.3. Распределение партеногенетических клеточных клонов в ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке ретинальном пигментном эпителии и сосудистой оболочке глаз 126
6.2.1.4. Распределение партеногенетических клеточных клонов во внутренних органах и тканях химер шестимесячного возраста 129
6.2.1.5. Постимплантационное развитие и клональный анализ партеногенетических химерных эмбрионов 130
6.3. Модулирующее влияние деметилируюііщх соединений на эффекты геномного импринтинга 133
6.3.1. Влияние неспецифического деметилирующего соединения ретиноевой кислоты на развитие диплоидных 134
партеногенетических эмбрионов мышей C57BL/6, СВА 134
6.3.1.1. Применение ретиноевой кислоты на доимплантационных стадиях развития 136
6.3.1.2. Влияние на имплантацию и постимплантационное развитие 137
6.3.1.3. Применение ретиноевой кислоты в постимплантационном периоде развития 138
6.3.2. Действие 5-азацитидина на развитие диплоидных партеногенетических эмбрионов мышей C57BL/6, СВА и (CBAxC57BL/6)Fl 139
6.3.2.1. Влияние 5-азацитидина на развитие яйцеклеток, активированных к партеногенезу 140
6.3.2.2. Воздействие 5-азацитидина на развитие партеногенетических зародышей на стадии бластоцисты 143
6.3.2.3. Влияние 5-азацитидина на постимплантационное развитие партеногенетических эмбрионов после внутрибрюшинных инъекций различных доз препарата самкам-реципиентам 144
6.4. Модуляция эффектов геномного импринтинга ростовыми факторами 148
6.4.1. Изучение влияния ростовых факторов семейства факторов роста фибробластов (FGF) на развитие диплоидных партеногенетических зародышей (СВА х C57BL/6)F 1 149
6.4.1.1. Действие FGF2 и FGF4 на развитие партеногенетических зародышей на стадии морулы 150
6.4.1.2. Совместное влияние FGF2 и инсулиноподобного ростового фактора (IGF2) на партеногенетические зародыши in vitro 153
6.4.2. Изучение влияния трансформирующего ростового фактора а (TGFa) 158
6.4.2.1. Влияние на развитие эмбрионов доимплантационнных стадий и имплантацию в матку ложнобеременных самок 159
6.4.2.2. Влияние на постимплантационное развитие эмбрионов и плаценты 160
6.4.3. Анализ влияния TGFa на экспрессию импринтированного reHa/gf-2 161
Обсуждение 165
Выводы 184
Список литературы 188
Приложение 217
1 .Паттерны распределения пигментированных участков шерстного покрова у партеногенетических химер C57BL/6(PG)«-»BALB/c 218
2.Список сокращений 221
- Идентификация и особенности импринтированных генов
- Деметилирование ДНК и модуляция эффектов геномного импринтинга
- Распределение партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове
- Анализ влияния TGFa на экспрессию импринтированного reHa/gf-2
Идентификация и особенности импринтированных генов
Ряд исследователей, используя мышей, гетерозиготных по робертсоновским или сбалансированным (реципрокным) транслокациям, получили однородительские дисомии - диплоидии по той или иной хромосоме или отдельным их участкам (Searle, Beechey, 1978, 1990; Cattanach, 1982, 1986; Cattanach, Kirk, 1985; Cattanachet al., 1991).
В этих и других исследованиях, выполненных позднее, было установлено, что в определенных случаях мыши наследовали характерные дефекты однородительского происхождения, причем это было связно с дупликацией специфических участков материнской или отцовской хромосом, сопровождающихся делецией соответствующих участков гомологичной хромосомы. В то же время при других однородительских дисомиях, когда две копии некоторых аутосом наследовались целиком от одного родителя, не возникали какие-либо дефекты у потомства. Возникновение дефекта развития, обусловленного однородительской дисомией по определенному участку хромосомы, указывает на наличие импринтированных генов в этом хромосомном сегменте. Было установлено, что импринтированные гены распределены неравномерно в хромосомах мыши: в одних хромосомах они могут вообще отсутствовать, а в других хромосомах (2, 6, 7, 9, 11, 12, 14, 17, 18, 19, X) импринтированные гены локализованы в одном, двух или даже трех участках (Beechey, Cattanach, 1996; Morison, Reeve, 1998).
Изменение дозы генетического материала одного из родителей может вызвать серьезные нарушения в развитии потомков в одних случаях и не отразиться на развитии - в других. Нормальное развитие мышей отмечено при наличии двойной дозы генов, происходящих от отца на 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 13, 14, 15-й хромосомах. В то же время удвоение дистальной части 7-й хромосомы в мужских гаметах приводит к гибели эмбрионов мышей в постимплантационном периоде. Удвоение же проксимальной части 11-й хромосомы сопровождается рождением патологически крупных особей (Cattanach, 1996). Иначе влияет удвоение дозы генетического материала, получаемого потомком с ооцитом. Полноценное развитие потомства происходит при удвоенной дозе материнских 1, 4, 5, 9, 13, 14, 15-й хромосом и нарушается, если они получают с. яйцеклеткой двойную дозу хромосом 2, 6,7,8, 11, 17-й. Дупликация проксимальной части. 11-й хромосомы приводила к двукратному уменьшению размеров тела у потомков. Следовательно, хромосомы 2, 6, 7, 8, 11, 17-я, так же как и Х-хромосомы, подвержены импринтингу, причем моиосомия по 2, 7, 17-й хромосомам сказывается на развитии особей раньше, чем даже их гаплоидия, при этом утрата материнской 17-й хромосомы проявляется быстрее отцовской. Таким образом, влияние дозы гена и, по-видимому, трансдействующих сигналов от хромосом различного родительского происхождения очень важны в развитии потомков.
Различают четыре типа генов, отличающихся по их способности активации в зиготе: группа С-гены домашнего обеспечения, не зависящие от родительского происхождения: гены хромосом 1, 4, 5, 9,13, 14, 15-й; группа G-гены регуляторного типа, способные нормально включаться и функционировать, если наследуются с ооцитом; гены 2, 6, 7, 8, 11, 17-й хромосом; группа W-гены регуляторного типа, контролирующие развитие при передаче с отцовским аллелем и ответственные за развитие плаценты, гены 7-й хромосомы; группа Z - активация возможна при наличии обоих родительских гомологов: хромосомы 2, 5, 17-я (Баранов, 1988). Следует отметить, что эффекты и механизмы геномного импринтинга, идентификация импринтированных генов и роль их в регуляции процессов развития в основном исследованы на мыши и человеке. Одними из первых эндогенных импринтированных генов у мыши были идентифицированы гены Ig/2 (DeCiara et al., 1991), Igf2r (Barlow et al., 1991) и HI9 (Bartolomei, 1991). В настоящее время у мыши идентифицировано около 30 импринтированных локусов (Morison, Reeve, 1998). Локализация некоторых импринтированных локусов и сведения об экспрессии одного из родительских аллелей приведены в таблице 1. Во многих случаях у человека известен гомолог соответствующего импринтированного гена мыши.
Интересно отметить, что у мыши экспрессия отцовских аллелей импринтированных локусов наблюдается вдвое чаще, чем экспрессия материнских аллелей. У мыши имеются две крупные синтенные группы импринтированных генов в центральной и дистальной областях хромосомы 7, выявленные также в двух хромосомах человека, в 15 и 11 (15qll—ql3 и lip 15.5) соответственно (Morison, Reeve, 1998). Очевидно, расположение этих двух генных ассоциаций в одной хромосоме мыши является предковым в геноме млекопитающих, в ходе эволюции человека произошло разделение таких двух групп импринтированных генов.
Репрессированный аллель импринтированного генного локуса характеризуется рядом особенностей и, прежде всего тем, что моноаллельная экспрессия не является абсолютной. Было показано, что репрессированный родительский аллель отличается от экспрессирующегося аллеля очень значительным уменьшением синтеза иРНК, составляющей примерно 5% от количества иРНК, продуцируемой экспрессируемым аллелем. Однако, еще не доказано характерна ли такая неполная репрессия импринтированного аллеля для всех клеток данной клеточной популяции или репрессирование является стохастическим в результате чего небольшая часть клеточной популяции показывает биаллельную экспрессию, а подавляющее большинство клеточной популяции имеет моноаллельную экспрессию .27 импринтированного локуса. Во всяком случае, можно утверждать, что репрессия импринтированного аллеля является неполной для клеток определенной популяции. Моноаллельная экспрессия может замещаться биаллельной, то есть происходит потеря импринтирования при различных заболеваниях человека, в частности в канцерогенезе. Принимая во внимание эти факты Барлоу (Barlow, 1997) считает, что механизм импринтинга легче понять, если рассматривать участок хромосомы, содержащий импринтированные гены, как "активный" на обеих родительских хромосомах.
Интересно отметить, что в генных ассоциациях (кластерах) импринтированных локусов наблюдается экспрессия как отцовских, так и материнских аллелей. Другой интересной особенностью функции импринтированных генов является кодирование и продукция нетранслируемой РНК, причем это определяется экспрессией как отцовского аллеля - ген Ipw (Wevrick, Francke, 1997), так и материнского аллеля - ген HI9 (Brannan et aL, 1990).
Экспрессия импринтированных генов характеризуется стадио- и тканеспецифичностью. Некоторые импринтированные локусы (Igf2r, Mash2) проявляют биаллельную экспрессию в преимплантационном периоде развития мыши, а затем позднее в процессе имплантации или в раннем постимплантационном периоде устанавливается моноаллельная экспрессия только материнского аллеля (Guillemot et aL, 1995; Lerchner, 1997). В течение эмбрионального развития человека ген IGF2 экспрессируется с трех разных промоторов, активность которых ограничена отцовской хромосомой. После рождения ребенка в печени дистальный промотор активизируется на обеих хромосомах, что приводит к биаллельной экспрессии данного локуса у взрослых (Vu, Hoffman, 1994; Ekstrom et aL, 1995). Ген Ig/2 мыши не имеет дистального промотора и поэтому не наблюдается биаллельной экспрессии этого гена в печени в постнатальный период развития. Следовательно, импринтирование гена IGF2 у человека является промотор-специфическим.
Деметилирование ДНК и модуляция эффектов геномного импринтинга
Несмотря на большое число исследований посвященных изучению механизмов реализации геномного импринтинга, его эффекты в эмбриогенезе млекопитающих к настоящему времени изучены недостаточно. Единичные работы посвящены изучению обратимого характера импринтинга и возможности модулирования его эффектов в эмбриогенезе. Надежды на возможность конструктивно изменять паттерн импринтинга, ослабить или снять импринтинг определенных локусов поддерживаются существованием эпигенетического репрограмирования геномного импринтинга, которое происходит в примордиальных половых клетках (Szabo, Mann, 1995). Импринтинг, представляющий собой многоступенчатый процесс, вначале приводит к стиранию аллель-специфических эпигенетических модификаций как у мужских , так и у женских примордиальных половых клеток (Brandeis et al., 1993). Вслед за этим происходит специфическое метилирование генов, которое приводит к специфичному для пола переключению эпигенотипа гамет, что является решающим фактором для дальнейшего нормального осуществления эмбрионального развития (Brandeis et al., 1993; Stoger et al, 1993; Kono et al., 1996).
Като с соавторами (Kato et al., 1999), чтобы ответить на вопрос как влияют на эмбриональное развитие мышей потенциально лишенные импринтов ядра примордиальных половых клеток, пересаживали их в энуклеированные ооциты. Реконструированные таким образом ооциты развивались только до 9,5 суток эмбриогенеза. Из них возникали мелкие зародыши с характерной аномалией плаценты. Собственно зародыш не развивался дальше даже в тех экспериментах, когда внутреннюю клеточную массу пересаживали в тетраплоидную реципиентную бластоцисту. Было установлено, что развитие реконструированных зародышей нарушалось в результате отсутствия у них гаметических импринтов. Об этом свидетельствуют анализ метилирования ДНК и изучение экспрессии различных импринтированных генов. Некоторые импринтированные локусы были репрессированы, а другие экспрессировались биаллельно. Авторы указывают, что гаметические импринты имеют важное значение для нормального развития. Они не могут ни устанавливаться и ни стираться в зрелых ооцитах. К этому следует добавить данные Вейса с соавторами (Weiss et al., 1996), сообщивших о существовании особых белков ингибиторов метилирования, которые защищают гены от беспорядочного деметилирования. Тем не менее известны примеры, когда определенные импринтированные локусы деметилируются в ответ на неспецифические воздействия. В частности, в определенных условиях культивирования, у гена HI 9, метилированного на отцовской хромосоме и проявляющего в норме моноаллельную экспрессию материнского аллеля in vivo на стадии бластоцисты, наблюдается биаллельная экспрессия. После культивирования 2-х клеточных эмбрионов мышей до стадии бластоцисты в двух питательных средах различного состава (среда Виттена и среда KSOM+AA) импринтированный отцовский аллель HI9 аномально экспрессировался с несколько разной активностью в каждой питательной среде. Одновременно с этим, сохранялся неизменным в частности импринтинг гена Snrpn в изученных питательных средах, что в свою очередь указывает на сохранение строгого генетического контроля за общим статусом импринтинга (Thorvaldsen, Bartolomei, 2000).
Коно с соавторами (Kono et al.„ 1996) сообщили, что диплоидные партеногенетические эмбрионы (РЕ) мышей, обозначенные как ng/fg РЕ, содержащие один геном от незрелого (нерастущего) ооцита и другой геном от зрелого (полностью выросшего) ооцита, развивались до 13,5 суток эмбриогенеза, т.е. на 3 дня дольше по сравнению с обычными диплоидными партеногенетическими зародышами мышей. В этой работе ng/fg РЕ получали путем серийной пересадки ядер ооцитов. Авторы считают, что полученные ими данные позволяют утверждать об установлении первичного ймпринтинга материнского генома, по крайней мере частично, в течение роста ооцита. Они высказали гипотезу, что нарушение этого процесса модифицирует экспрессию аллелей импринтированных локусов, приводя к пролонгированию развития ng/fg РЕ. В другой работе, выполненной на реконструированных таким же образом диплоидных партеногенетических эмбрионах мышей ng/fg РЕ , было показано, что импринты устанавливаются в течение роста ооцита, приводя к специфической для материнского генома экспрессии и репрессии аллелей импринтированных локусов (Obata et al.„ 1998). Было установлено, что нарушение первичного ймпринтинга в течение роста ооцита может приводить к изменению экспрессии импринтированных генов в эмбриогенезе. У 9.5 и 12.5-суточных эмбрионов ng/fg РЕ была обнаружена экспрессия трех отцовских экспрессирующихся аллелей (Pegl/ Mest, Peg3, Snrpri) и, наоборот, репрессия двух материнских экспрессирующихся аллелей импринтированных локусов (Igf2r, р57 ). У обычных диплоидных партеногентических эмбрионов должны быть активны только материнские экспрессирующиеся аллели импринтированных локусов и ни в коем случае не отцовские.
Применение ингибиторов метилирования, в частности 5-азацитидина (5-азаЦ) и 5-аза-2 -деоксицитидина (5-аза-деоЦ), позволило установить связь между изменением метилирования ДНК, экспрессией генов (неимпринтированных и импринтированных) и дифференцировкой клеточных клонов и развивающихся зародышей.
Распределение партеногенетических клонов меланобластов в шерстном покрове
В таблице 11 приведены данные по распределению у химер пигментированных участков шерстного покрова, их величине в условных единицах в определенных секторах и общая площадь пигментации в %. Паттерны пигментированных участков шерстного покрова химер приведены в разделе "Приложение".
Анализ распределения пигментированных участков химер C57BL/6(PG)oBALB/c выявил сходные паттерны у нескольких групп животных. У химер Х6, Х7, Х8 (самки) и Х9 (самец), для которых количество партеногенетического компонента, судя по пигментации шерстного покрова, не превышало 2%, небольшие пигментированные участки имелись только на дорсальной стороне тела на уровне передних и задних конечностей. На спинной стороне средней части туловища, голове, передних и задних конечностях, а также на всей вентральной поверхности тела пигментированные участки волосяного покрова отсутствовали. Химеры Х7, X8 и X9 имели также пигментированные участки на ушах (Х7, Х8 - левое ухо, Х9 - правое). Пигментированные участки часто располагались асимметрично и имели вид отдельных пятен.
Вторая группа была представлена двумя животными Х2 и ХЗ (самцы), у которых пигментированные участки не превышали 3 - 4% площади шерстного покрова. Так же, как и в предыдущей группе, пигментация отсутствовала на вентральной поверхности тела, в средней части спины, а также ростральной области головы и на конечностях. У химеры ХЗ передняя половина туловища была полностью непигментирована, а пигментированные участки в виде узких полос были только в пояснично-крестцовой области спины. Расположение пигментированных участков было асимметричным (у Х2 правая половина тела полностью была непигментирована), пигментированные участки имели вид полос, распространяющихся от 124 средней линии спины в дорсо-латеральном направлении, не достигая, однако, вентральной стороны тела.
Самец Х5 и самка XI2, у которых пигментированная часть волосяного покрова занимала площадь, не превышающую 10%, не имели пигментированных участков в средней области туловища, на дистальных частях конечностей и ростральной части головы. Пигментированные участки имели вид узких полос и отдельных пятен, расположенных, главным образом, в каудальной части туловища, на проксимальных частях задних конечностей и, в меньшей степени, в передней области тела, где эти участки были представлены в виде отдельных небольших пятен. У обоих животных пигментированные участки были также на вентральной стороне задней левой половины туловища, где они достигали средней линии живота (табл. 11). Пигментированные участки отмечены также на ушах - у Х5 на обоих, а у Х12 на левом ухе. Расположение пигментированных участков, как правило, было асимметричным, причем больше их присутствовало на левой половине тела. Кроме того, у Х5 левый глаз был сильнее пигментирован по сравнению с правым.
Самка XI, у которой пигментированный волосяной покров занимал площадь равную 17%, имела сходный с двумя предыдущими химерами паттерн пигментированных участков, но в этом случае билатеральная асимметрия была выражена сильнее. Пигментированный участок в левой задней дорсальной области тела распространялся в виде полосы" на вентральную поверхность до средней линии брюшка (табл. 11). В двух местах такого пигментированного участка имелись небольшие пятна непигментированной шерсти. Пигментация также отмечена на левой задней стопе и обоих ушах.
Самец XII, у которого пигментированная площадь волосяного покрова составляла 13%, также имел сходный с Х5 и Х12 паттерн пигментированных участков. Пигментация отсутствовала в средней области спины, дистальных частях конечностей и ушах. Пигментированные зоны в виде относительно широких полос присутствовали в каудальной (пояс задних конечностей) и посткраниальной (пояс передних конечностей) областях, а также в правой подмышечной области, заходя на вентральную поверхность, но не достигая средней линии брюшка. Пигментированные участки имелись также на левой затылочной части головы и между левым глазом и ухом.
Самки Х10 и Х4, судя по пигментации шерстного покрова, имели наибольший процент партеногенетического компонента (25% и 35% соответственно). Пигментированные участки в виде широких, местами прерывистых полос, начинались от средней линии спины и заходили на вентральную поверхность, достигая иногда средней линии брюшка. Отмечено наличие пигментации на ушах, проксимальных частях кистей и стоп, а также на голове в виде небольших пятен в области затылка, темени и около глаз. У Х4 был сильнее пигментирован левый, а у XI0 - правый глаз. У XI0 билатеральная асимметрия в распределении пигментированных участков шерстного покрова выражена в меньшей степени, чем у других химер (рис. 14). Следует отметить, что ни у одной из исследованных химер не наблюдали каких-либо признаков пигментации хвоста.
Анализ влияния TGFa на экспрессию импринтированного reHa/gf-2
Улучшение развития производных трофобласта и эмбриональных тканей у обработанных TGFa партеногенетических зародышей, может быть, в частности, обусловлено активацией некоторых импринтированных генов, в частности материнского аллеля гена Igf2, контролирующего синтез ростового фактора IGF2, который является мощным стимулятором роста эмбриональных тканей. Поэтому было решено исследовать способность TGFa участвовать в реактивации импринтированных генов, контролирующих формирование внезародышевых оболочек и трофобласта. С этой целью использовали метод in situ гибридизации, при помощи которого анализировали экспрессию гена инсулиноподобного ростового фактора 2 (Igf2), подверженного импринтингу на хромосоме материнского происхождения у партеногенетических эмбрионов. У нормальных (оплодотворенных) эмбрионов экспрессируется аллель только отцовского генома, поэтому у партеногенетических эмбрионов, имеющих два аллеля материнского происхождения, экспрессия Igf-2 заблокирована. Инактивация гена Igf-2 у них происходит на постимплантационных стадиях развития.
Гибридизацию in situ проводили на эмбрионах 11 и 12 суток развития в модификациях на тотальных препаратах {whole mount) и на гистологических срезах. Для выполнения in situ гибридизации получали нормальных (оплодотворенных) эмбрионов мышей на стадиях 23-25 и 30-42 сомитов. Контрольных партеногенетических эмбрионов (без обработки TGFa) на стадии 30-42 сомитов и партеногенетических эмбрионов, обработанных TGFa (10 нг/мл) на стадиях 30-42 сомитов. Было показано, что у обеих групп нормальных (оплодотворенных) эмбрионов мышей на стадиях 23-25 и 30-42 сомитов выявлялась экспрессия гена Igf-2, наиболее ярко выраженная в туловищной части зародыша. В частности, в осевых структурах, во внутренних органах, почках передних и задних конечностей (рис. 21). У контрольных партеногенетических эмбрионов, развившихся до стадии 23-25 сомитов, экспрессия гена Igf-2 не выявлялась. На тотальных препаратах и гистологических срезах, наиболее продвинутых в развитии партеногенетических эмбрионов (37-42 сомита), обработанных fc
164a in vitro TGFa, в ряде случаев была обнаружена экспрессия гена Igf-2. В отличие от картины экспрессии, которая наблюдалась у нормальных (оплодотворенных) эмбрионов, на препаратах партеногенетических зародышей, обработанных TGFa, наблюдалась эктопическая экспрессия гена Igf2 в головной части зародыша (рис. 21).
Таким образом, впервые установлено, что основное моделирующее влияние TGF-a на эффекты геномного импринтинга начинается на стадии бластулы в двух исходных линиях клеток: внутренней клеточной массе и трофэктодерме. Затем, на более поздних этапах эмбриогенеза, TGF-a, участвуя в процессах формирования клеточных клонов различных тканей и органов, и оказывая влияние на экспрессию некоторых импринтированных генов, в частности гена Igf2, может модулировать эффекты геномного импринтинга у партеногенетических эмбрионов, в результате чего происходит пролонгирование их развития
Несмотря на то, что после открытия геномного импринтинга у плацентарных млекопитающих прошло не более 20 лет, в результате усилий многих исследователей удалось раскрыть не только эффекты этого удивительного эпигенетического феномена, но и его механизмы, регулирующие развитие различных клеточных клонов в эмбриогенезе через репрессию и дерепрессию аллелей импринтированных локусов. Оказалось, что для нормального развития млекопитающих требуются оба набора хромосом - материнский и отцовский, вследствие чего в природе у млекопитающих не наблюдается партеногенеза (гиногенеза) и андрогенеза. В результате дифференциальной экспрессии генов разных импринтированных локусов возникает соответствующий баланс генной активности, необходимый для нормального эмбриогенеза. Гибель диплоидных партеногенетических или андрогенетических зародышей млекопитающих обусловлена отсутствием экспрессии генов импринтированных локусов отцовского или материнского геномов, что приводит к возникновению дисбаланса генной активности и нарушению развития тканей и органов. Использование в качестве модельной системы партеногенетического развития эмбрионов мышей представляет собой важный инструмент для изучения возможности модуляции геномного импринтинга в эмбриогенезе млекопитающих. Такая модельная система, позволяет осуществлять многообразные экспериментальные воздействия на партеногенетические эмбрионы, поддерживая их рост in vivo или in vitro как на пре-, так и на постимплантационных стадиях развития. Важно, что данная модельная система дает возможность также проследить судьбу партеногенетических клеточных клонов в составе химерных организмов мышей как в эмбриональном, так и в постнатальном развитии.
Активированные к партеногенезу и диплоидизированные яйцеклетки мышей эффективно развиваются в стандартных условиях культивирования in vitro, разработанных для нормальных (оплодотворенных) доимплантационных эмбрионов. При изучении искусственного партеногенеза у мышей основным источником получения партеногенетических эмбрионов обычно являются гибриды от скрещивания наиболее распространенных линий мышей СВА и C57BL/6. Чаще всего используют гибриды первого поколения (СВА х C57BL/6)F1 или (C57BL/6 х CBA)F1, поскольку диплоидные партеногенетические эмбрионы таких гибридов достаточно стабильно развиваются in vitro в доимплантационном периоде и достигают сомитных стадий после трансплантации в матку ложнобеременных самок (Kaufman et al., 1977). Причем, различные авторы (Cuthbertson, 1983; Kaufman, 1983; Surani, Barton, 1983; Mann, LovelHBadge, 1988) приводят противоречивые данные относительно частоты образования диплоидных партеногенетических эмбрионов у мышей некоторых инбредных линий и их гибридов.
Использование в наших исследованиях партеногенетических эмбрионов мышей инбредных линий СВА и C57BL/6 для изучения эффектов геномного импринтинга, подавляющих партеногенетическое развитие, представлялось предпочтительным, поскольку потенции развития партеногенетических эмбрионов, а также партеногенетических клеточных клонов в составе химерного организма у этих двух инбредных линий мышей существенно различаются.
