Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Генетическая регуляция клеточного цикла (обзор научной литературы)
1.1. Роль гена BRCA1 в обеспечении целостности генома и контроле клеточного цикла
1.2. Роль гена ТР53 в регуляции клеточного цикла и инициации клеточной смерти
1.3. Роль генов II фазы системы биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, GSTP1, CAT, NQOl) в регуляции клеточного цикла
ГЛАВА 2. Материалы, методы и объем исследования 54
2.1. Объект исследования 54
2.2. Материалы исследования 55
2.3. Методы исследования
2.3.1. Генетические методы. Семейный анализ 57
2.3.2. Методы исследования ДНК
5 2.3.2.1. Выделение геномной ДНК 5 8
2.3.2.2. Амплификация полиморфных участков ДНК 60
2.3.2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле 66
2.3.3. Определение содержания цитокинов 67
2.3.3.1. Определение концентраций IE-1р, ПЬфЧЫО и aNF 67
2.3.3.2 Определение концентрации IL1RA 70
2.3.3.3 Определение концентрации IL2, IL4 71
2.3.4. Статистический анализ результатов 72
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 74
3.1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов исследуемых генов с риском развития онкопатологии
3.1.1. Исследование распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) у здоровых индивидов и в группе онкопатологией
3.1.2. Исследование распределения! частот: аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, GSTP1, CAT, NQOl) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией
3.2. Анализ сочетаний генотипов пяти полиморфных локусов изученных генов и исследование роли межгенных взаимодействий у здоровых индивидов и больных онкопатологией
3.3. Анализ наследования аллелей генов ТР53 и BRCA1 115
3.4. Типирование полиморфных локусов генов ТР53 и BRCA1 в ДЬЖ периферической крови и опухолевой ткани у больных раком молочной железы
3.5. Иммуноферментный анализ концентрации цитокинов в 125
сыворотке крови у больных РМЖ
3.6. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов со средними 126
значениями количественных показателей цитокинов (ANOVA) у больных РМЖ
Заключение 129
Выводы 131
Список цитированной литературы
- Роль гена ТР53 в регуляции клеточного цикла и инициации клеточной смерти
- Генетические методы. Семейный анализ
- Исследование распределения! частот: аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, GSTP1, CAT, NQOl) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией
- Типирование полиморфных локусов генов ТР53 и BRCA1 в ДЬЖ периферической крови и опухолевой ткани у больных раком молочной железы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Основой канцерогенеза, независимо от локализации опухоли, является злокачественная трансформация клетки в результате нарушения клеточного цикла и угнетения апоптоза (Татосян, 2004; Logan et al., 2004). Молекулярный патогенез онкологических заболеваний включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии (Ляхович и др., 2004; Payne, Kemp, 2005; Croce, 2008; Залетаев, 2008; Лихтенштейн, 2009). Одними из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста являются гены ТР53 и BRCA1, белковые продукты которых осуществляют реализацию широкого спектра клеточных процессов, регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза, постоянный надзор за состоянием генома и злокачественной трансформацией клеток (Phillips, 1999; Vousden, Lane, 2007; Копнин, 2008; Желтухин, Чумаков, 2010). Нарушение функциональной активности этих белков может провоцировать генетическую нестабильность, нарушение их транскрипционной, сигнальной и митохондриальной функций (Чумаков, 2007).
В то же время, модифицирующее влияние на функционирование генов онкосупрессоров могут оказывать такие системы, как гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков, ответственные за метаболизм и инактивацию широкого класса эндо- и экзобиотиков, в том числе канцерогенов (Копнин, 2006; Имянитов, Хансон, 2007).
С другой стороны, реализация онкогенеза является результатом совместного действия многих систем организма. В работе R.E. Ellis с соавторами (2002) показано, что при некоторых новообразованиях цитокины способны влиять на рост опухолевых клеток, изменяя экспрессию белков про- и антиапоптотического действия, различных онкогенов и маркеров пролиферативной активности клеток. В частности, нарушение баланса про- и противовоспалительных сывороточных цитокинов способствует развитию патологических процессов, в том числе, злокачественных новообразований (Oppenheim, 1996; Тугуз, 2008; Бережная, 2009).
В связи с этим, комплексный подход, включающий: проведение молекулярно-генетического анализа генов клеточного цикла и генов инактивации ксенобиотиков, а также оценку цитокинового статуса при выявлении
предрасположенности к онкозаболеваниям, является наиболее перспективным и актуальным направлением изучения механизмов злокачественной трансформации клетки.
Цель настоящего исследования заключается в анализе взаимодействия различных аллельных состояний генов, регулирующих онкосупрессию, биотрансформацию ксенобиотиков и функционирование цитокиновой системы при онкопатологии.
Задачи исследования:
Оценить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов систем онкосупрессии {rsl042522 (G/C), rsl625895 (G/A), DUP16BP гена ТР53; rs80357629 (G/A) и rs 1799966 (A/G) гена BRCAl) и биотрансформации ксенобиотиков {large deletion в генах GSTM1 и GSTT1; г si 69 5 (A/G) гена GSTP1; rs 1001179 (С/Т) гена CAT; rsl800566 (С/Т) и rsl 131341 (C/T) гена NQOl) у здоровых, а также больных раком молочной железы и индивидов, страдающих злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта.
Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов генов онкосупрессии (ТР53, BRCA1) с показателями спонтанной продукции цитокинов в сыворотке крови у больных раком молочной железы.
Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов (rs80357629 (G/A) и rsl799966 (A/G) гена BRCAl; large deletion в генах GSTM1 и GSTT1; rsl695 (A/G) гена GSTP1; rs 1001179 (С/Т) гена CAT; rs!800566 (С/Т) и rsl 131341 (С/Т) гена NQOl) у здоровых индивидов, носителей нормальных аллелей гена ТР53 и больных онкологичекими заболеваниями.
Оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов онкосупрессии и биотрансформации ксенобиотиков в развитии онкопатологии.
Провести типирование генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани больных раком молочной железы.
Провести генетический анализ наследования аллелей генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1), локализованных на 17 хромосоме.
Научная новизна исследования: впервые обнаружены нуклеотидные замены в генах ТР53 (rsl625895 G/A, DUP16BP) и BRCAl (rs80357629, G/A; rsl 799966, A/G), произошедшие в опухолевой ткани у больных раком молочной
железы, причем при реверсии аллеля в опухоли наблюдается мозаицизм в ткани с большим количеством очагов нормальных клеток, что подтверждается гистологическими исследованиями. Установлена взаимосвязь полиморфных локусов генов системы онкосупрессии с показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлен дисбаланс сывороточных цитокинов крови про- и противовоспалительного ряда у больных раком молочной железы. Определены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах BRCA1 (rs80357629, G/A; rsl799966, A/G), GSTP1 (rsl695, A/G), NQOl (rsl800566, C/T; rsl131341, С/Г), являющихся рисковыми в отношении онкопатологии: у больных со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта - это сочетание генотипов GA/AG/AG/CC/CT, а у больных раком молочной железы -GA/AG/AG/CC/CT и GA/AA/AG/CC/CT по полиморфным локусам rs80357629 (G/A), BRCA1 / rsl799966 (A/G), BRCA1 / rsl695 (A/G), GSTP1 / rsl800566 (C/T), NQOl / rsll31341 (C/T), NQOl, соответственно. При генеалогическом анализе выявлена соматическая мутация в гене ТР53 (rs!042522, G/C) у пробанда, которая не идентифицирована ни у ее матери, ни у детей. Установлено, что сочетание генотипов CC/CT/AG (rs!800566 (C/T), NQOl / rsll31341 (C/T), NQOl I rsl695 (C/T), GSTP1) является рисковым в отношении возможного развития онкопатологии, даже у носителей протективных гаплотипов аллелей генов ТР53 и BRCA1, расположенных на 17 хромосоме.
Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание роли мутаций в генах, определяющих онкогенез и онкосупрессию, мутагенами для которых могут являться продукты неполной эвакуации из организма ксенобиотиков. Это относится к генетическому профилю, приводящему к неэффективной детоксикации ксенобиотиков и цитокинового статуса, включающего в себя более трех-четырех рисковых аллелей. Результаты этой части работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России при исследовании генетической предрасположенности к развитию возможной онкопатологии. Основные положения работы включены в лекционные курсы дисциплин биологического цикла: общая генетика, биохимия, иммунология, генетика человека, экологическая генетика, генетический контроль клеточного цикла, составляющих учебную программу подготовки специалистов-генетиков и
магистрантов по направлению «Биология», программа «Генетика» на базе ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы». Материалы диссертации могут быть использованы при проведении лекций для студентов биологических факультетов университетов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на ежегодной международной конференции Европейского общества генетиков человека (Ґетеборг, 2010), II Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), на республиканской молодежной научно-практической конференции «Инновационный потенциал молодежной науки» (Уфа, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС, Москва, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), на международном Конгрессе нанотехнологий круглый стол «Нанотехнологии в медицине» (Уфа, 2011), I Международной Школе-конференции молодых учёных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2011), на Всероссийских молодежных инновационных форумах «Селигер - 2010» и «Селигер - 2011».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе, 3 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 листах машинописного текста, включает обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 29 рисунками. Список цитируемой литературы включает 215 источников.
Связь работы с научными программами. Работа поддержана грантами: РФФИ «Исследование мобильного генома на примере человека и дрозофилы» на 2008-2010 гг.; РГНФ «Молекулярно-генетические и средовые факторы в развитии когнитивных способностей человека» на 2010-2011 гг.; Грантом Министерства образования РФ: Тематический план на 2009/2010, 2010/2011 и 2012/2014 гг.
«Молекулярно-генетическое исследование здоровья и адаптационных
возможностей человека»; Грантами БГПУ им. М.Акмуллы: по направлению 10.04
«Фундаментальные и прикладные исследования и инновационные
образовательные проекты молодых ученых (до 35 лет)» «Изучение нормы реакции организма в зависимости от молекулярно-генетических особенностей и экологических условий среды обитания» на 2010 г.; по направлению 12.01 Фундаментальные и прикладные исследования в области физико-математических, технических и естественных наук для молодых ученых (до 35 лет) «Молекулярно-генетическое исследование адаптационных механизмов регуляции клеточного цикла при онкопатологии» на 2012 г.; Грантом Республики Башкортостан для государственной поддержки молодых ученых и молодежных научных коллективов «Технология комплексной оценки состояния здоровья: молекулярно-генетические и физиолого-биохимические аспекты» на 2011 г.
Роль гена ТР53 в регуляции клеточного цикла и инициации клеточной смерти
Точки контроля являются критическими точками клеточного цикла, так как именно в этот момент проверяется целостность генетического материала клетки и принимается решение о возможности перехода в следующую фазу цикла. Это необходимо для того, чтобы исключить возможность деления мутантных клеток и сохранить генетическую информацию в ряду поколений. При обнаружении мутаций в геноме, происходит блокирование клеточного цикла для исправления повреждений (Новик, 2004).
Существует специальная точка контроля, осуществляющая надзор над репликацией в S-фазе клеточного цикла. Образование участков с неправильной структурой (локальные одноцепочечные участки, двунитевые разрывы) приводит к активации транскрипции генов протеинкиназ ATR и ATM, которые являются медиаторами точек контроля. Киназа ATM, как правило, непосредственно связывается с ДНК на концах двунитевых разрывов, a ATR киназа преимущественно взаимодействует с УФ-индуцированными дефектами ДНК. Связывание с поврежденными участками ДНК приводит к увеличению активности обеих киназ и к дальнейшему распространению сигнала. Наряду с ATM и ATR киназами в узнавании нарушений структуры ДНК независимо участвуют белки Radl7, Rad9, Radl, Husl (Bartek, Lukas, 2001).
Медиаторы точек контроля необходимы для поврежденных участков ДНК, передачи сигнала генам, регулирующим репарацию ДНК. Одним из основных сигнальных белков является одноименный продукт гена BRCA1.
Белок BRCA1 фосфорилируется киназой ATM по Ser в 1387 положении, что необходимо приводит к активации точки контроля внутри S-фазы (Xu et al., 2002). Белок BRCA1 принимает непосредственное участие в репарации двуцепочечных разрывов. Через регуляцию транскрипции гена WAF1 (кодирует белок р21), белок BRCA1 может влиять на развитие фазы S, так как белок р21 препятствует репликативному синтезу ДНК (Огрызко с соавт., 1997).
Контрольная точка между G1 и S фазами клеточного цикла необходима для проверки целостности генома перед процессом воспроизведения генетического материала. Исправление ошибок перед репликацией необходимо, чтобы исключить возможность передачи поврежденной ДНК дочерним клеткам и, тем самым, предотвратить закрепление мутации в геноме.
Одним из путей блокировки G1-периода является активация, в ответ на повреждения ДНК, генов, являющихся ингибиторами циклин-зависимых киназ (рис. 2). После активации ATM или ATR киназ происходит активация транскрипции гена ТР53 и последующее фосфорилирование продукта этого гена - белка р53. Фосфорилирование р53 предотвращает деградацию и способствует его накоплению в ядре клетки. Так как белок р53 является транскрипционным фактором многих генов, его накопление способствует усиленной экспрессии генов-мишеней белка р53, таких как р21. Белок р21 является ингибитором Cdk-циклинового комплекса, поэтому накопление этого белка обеспечивает блок фазы Gl (Fei, El-Deiry, 2003).
Белок BRCA1 также участвует в активации белка р21 (Somasundaram, 1997). Активация транскрипции гена WAF1 коррелирует с ATM/ATR-опосредованным фосфорилированием BRCA1 (Li et al, 1999). Белок BRCA1 лишь косвенным образом воздействует на регуляцию трансактивации гена WAF1 через белок р53. Так, BRCA1 в ассоциации с белком BARD1 необходимы для фосфорилирования р53 по Ser в 15 положении, что обеспечивает накопление р53 и дальнейшее связывание с р21 (Fabbro et al., 2004).
Другой путь блокировки G1 фазы заключается в ингибировании G1 CDK-циклинового комплекса путем фосфорилирования и активации эффекторных киназ Chk2 и/или Chkl, которые в свою очередь фосфорилируют фосфатазу Cdc25A, приводя к выходу ее из ядра и к деградации по убиквитин-независимому пути. Фосфатаза Cdc25A в свою очередь принимает участие в активации комплекса Cdk2-4HKrmH Е путем дефосфорилирования тирозинового остатка. А выход Cdc25A из ядра и деградация в протеосомах исключает возможность активации комплекса Сёк2-циклин Е, тем самым блокируя Gl-фазу клеточного цикла (Donzelli, Draetta, 2003).
Пути блокирования перехода клетки через границу G1/S (Льюин, 2011) Непосредственно блокировка фазы G1 осуществляется путем фосфорилирования комплексами Cdk-циклин различных белков, таких как Rb (retinoblastoma susceptibility). Гипофосфорилированный (функционально активный) белок Rb связывается с фактором транскрипции E2F1 и препятствует формированию транскрипционно активного комплекса E2F1 с онкогеном с-Мус. Гиперфосфорилированный белок Rb является неактивным, поэтому происходит его вытеснение из комплекса с транскрипционным фактором E2F1, так что последний может активировать онкоген с-Мус, продукт которого способствует переходу клетки в S-фазу. Регуляцию фосфорилирования белка Rb осуществляют ингибиторные белки (р16, р21 и др.), которые связываются с циклинзависимыми киназами, входящими в состав комплексов CDK-циклин и подавляют фосфорилирование онкосупрессора Rb (Новик с соавт., 2004).
Контрольная точка между G2 и М периодами клеточного цикла необходима для проверки готовности клетки к делению. Непосредственное участие в этом процессе принимает белок BRCA1, который подавляет транскрипцию гена CyclinB, ответственного за активацию киназы Cdk2 и вход в митоз (MacLachlan et al., 2002). BRCA1 также стимулирует транскрипцию гена киназы PLK1, ведущей к ингибированию фосфорилирования Cdk2 и к последующему ингибированию комплекса сёк2-циклин В (Yarden et al, 2001).
Существуют сведения о существовании еще одного механизма BRCA1-зависимого пути остановки клеточного цикла в фазе G2. Уровень транскрипции гена BRCA1 влияет на активность белка GADD45, который связывается с комплексом Сгік2-циклинВ, что ведет к торможению его активности и остановке клеточного цикла (Wang et al., 1999). Пути регуляции клеточного цикла при участии белка BRCA1 показаны на рисунке 3 (Mullan, 2006).
Генетические методы. Семейный анализ
Принцип метода: использовали наборы реагентов фирмы «Вектор-БЕСТ» (г. Новосибирск) для измерения количественного содержания ILIRA в сыворотке крови человека. Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе с применением двух типов моноклональных антител с различной эпитопной специфичностью к IL1RA.
На первой стадии анализа, исследуемые образцы инкубируют в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах IL1RA связываются с иммобилизованными антителами. Несвязавшийся материал удаляется. Связавшийся IL1RA взаимодействует при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к IL1RA человека с пероксидазой хрена). Несвязавшийся конъюгат удаляется отмывкой. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце IL1RA.
Порядок работы. Во все лунки вносили по 100 мкл РРО. В первые ячейки планшета вносили по 100 мкл калибровочных и контрольного образца, в остальные - по 100 мкл исследуемых проб. Инкубировали в шейкере 120 мин при температуре 37С при 700 об/мин. Удаляли жидкость из ячеек и промывали лунки планшета 5 раз раствором ФСБ-Т (фосфатно-солевой буферный раствор с твином), при этом в каждую лунку вносили по 350 мкл жидкости в процессе одного промывания. За 10 мин до окончания инкубации приготовили раствор конъюгата. В каждую лунку внесли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата и инкубировали в шейкере 60 мин при температуре 37С при 700 об/мин. За 10 мин до окончания инкубации приготовили рабочий раствор ТМБ. (тетраметилбензидин). По окончании инкубации стрипы промыли 5 раз раствором ФСБ-Т. Внесли по 100 мкл раствора ТМБ и инкубировали в темноте в течение 25 мин при температуре 18-25С. Реакцию остановили добавлением в по 100 мкл стоп-реагента. Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме. Строили калибровочную кривую "оптическая плотность/концентрация", пользуясь данными по концентрациям, указанным для растворов стандартов. Определяли графически концентрацию IL1RA в образцах.
Принцип метода: аналогичен предыдущим, различие заключается в том, что специфическими реагентами являются моноклональные антитела к IL2 и IL4, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета. Далее анализ проводили согласно инструкции по применению изготовителя. ....;..,.,... 2.3.4. Статистический анализ результатов Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ "Statistica for Windows 6.0" (StatSoft), программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft) и компьютерных программ "GENEPOP" и "RxC" (Rows x Columns) (Roff, Bentzen, 1989). Соответственно с учетом числа аллелей частоты генотипов и аллелей определяли по формулам (Животовский, 1991): 1 m P.-N./N.p.-p + jgP,! где р; - частоты генотипов AjAj, m - количество аллелей, N -численность особей генотипа A;Aj в выборке объемом N(N=Z Ny). Статистическую ошибку частот аллелей вычисляли по формуле (Животовский, 1991): VPO-P )/2N
Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали модифицированный критерий Х2(Р)э определяемый с помощью программы RxC по алгоритму, описанному D.Roff и P. Bentzen (Roff, Bentzen, 1989). Доверительные интервалы частот аллелей и генотипов рассчитывали на основе точной формулы с использованием F-pacnpeделения (Животовский, 1991). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в двух различных группах использовался двусторонний критерий Фишера р (F2). Достоверными считали различия частот аллелей и генотипов при значении Р 0.05. При необходимости значение Р умножали на число рассматриваемых аллелей/генотипов или число сравниваемых групп (т.е. проводили коррекцию на число сравнений). Также вводили поправку на число сравниваемых групп для всех изученных локусов (значение Р умножали на число сравниваемых групп). Соотношение шансов (odds ratio - OR) рассчитывали по формуле: OR= (а х d) / (b х с), где а - частота аллеля (генотипа) в исследуемой выборке, b - частота аллеля (генотипа) в контрольной выборке; с - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в исследуемой выборке; d - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной выборке. В случае если один из показателей равен 0, принимается поправка на непрерывность - 0.5.
Доверительный интервал для соотношения шансов рассчитывали по следующей формуле (Blana, Altaian, 2000): OR"= cW{lnOR + l.96 /a + yb+yc + /d) В случае если OR=l, говорят об отсутствии ассоциаций изучаемого локуса с анализируемым признаком. Значения 0R 1 показывают достоверность различий при вероятности 99%; 0R 1 - различия достоверны при вероятности 95%. Анализ сцепления проводили с использованием программы 2 LD (Zapata С, 2001). 2LD - это программа расчета неравновесия по сцеплению (LD) между двумя полиморфными маркерами, локализованными на одной хромосоме. Гаплотипическии анализ проводили с помощью программы ЕН (Xiex, 1993).
Для оценки ассоциаций полиморфных локусов изученных генов со средними концентрациями цитокинов использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием статистического пакета SPSS (версия 13.0) (Юнкеров, 2002).
При анализе межгенных взаимодействий применяли метод моделирования ген-генных и ген-средовых взаимодействий с помощью непараметрической программы MDR - Multifactor-Dimensionality Reduction (Lou, 2007).
Исследование распределения! частот: аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, GSTP1, CAT, NQOl) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rsl695 (A/G) в гене GSTP1 между здоровыми и онкобольными с различной локализацией опухоли (табл. 11) выявил достоверно высокие частоты гомозиготного генотипа GG (р=0,009, Х2=6,96) и гетерозиготного генотипа AG (р=0,02, %2=5,14), а также аллеля G (р=0,0005, х2=18,36) в группе больных РМЖ. В группе здоровых индивидов гомозиготный генотип АЛ встречался с частотой 39%, а аллель А с частотой 65%, что достоверно выше, чем в группе больных РМЖ (р=0,0005, х2 19,96; р=0,0005, х2=18,36 соответственно). Полученные результаты согласуются с литературными данными, где показано, что у носителей аллеля G наблюдается трехкратное снижение активности кодируемого белка по отношению к эпоксидпроизводным ПАУ и пестицидам (Watson et al, 1998; Hatagima, 2000; Райе, Гуляева, 2003). Поэтому, низкая функциональность этого фермента способствует накоплению активных метаболитов, обладающих канцерогенным действием. Исходя из вышесказанного, фермент играет важную роль в этиологии злокачественных новообразований.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу гена NQOl (rsl 131341, С/Т) показал достоверное повышение гомозиготного генотипа СС (р ООЗ, %2=9,62) и аллеля С (р=0,006, х2-7,86) в группе здоровых индивидов (табл. 11). У больных РМЖ выявлена достоверно высокая частота генотипов СТ и ТТ (р=0,009, х2=6,90; р=0,005, х2=8,37 соответственно), а также аллеля Г (р=0,0008, х2=14,37). У больных раком ЖКТ достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу гена NQOl (rsl 131341) не обнаружено (табл. 11). Некоторые авторы отмечают, что аллель Т приводит к снижению активности фермента NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы-1 (NQOl) (Майорова, 2002), что ведет к накоплению активных метаболитов широкого ряда ксенобиотиков.
К тому же, низкая активность белка NQ01 оказывает непосредственное влияние на регуляцию клеточного цикла, так как принимает участие в протеосомной деградации белка онкосупрессора р53 (Чумаков, 2007). Снижение активности NQ01 приводит к ослаблению взаимодействия с белком р53, вследствие чего р53 беспрепятственно расщепляется 20-S протеасомами. Поэтому не происходит накопления р53 в клетке и активации р53-зависимых путей репарации и регуляции клеточного цикла.
Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs 1800566 (С/Т) гена NQOl (табл. 10) показал повышение частоты генотипа СС (р=0,01, х2??6,30) и аллеля С (р=0,03, х2=4,96) в группе онкобольных. В группе здоровых индивидов достоверно чаще идентифицировался генотип СТ (р=0,01, у?=6,\4) и аллель Т (р=0,03, %2-4,96). Согласно Moran et al. (1999), у носителей гетерозиготного генотипа СТ (rs!800566, С/Т) зарегистрировано трехкратное снижение активности фермента. В исследованиях Sunaga et.al (2002) обнаружена ассоциация генотипа СС (гs 1800566, С/Т) гена NQOl с аденокарценомой легких.
Анализ распределения изученных полиморфных локусов в генах GSTM1 (large deletion), GSTT1 (large deletion), CAT (rs 1001179) существенных различий между выборкой онкологических больных и группой здоровых индивидов не выявил (табл. 12). Таблица 11 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта гена GSTP1 (rsl695) у здоровых индивидов и в группах больных раком ЖКТ и РМЖ Группы сравнения Статистические показатели GSTP1 (га 1695)
Сравнительный анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов гена BRCA1 (rs80357629, гs 1799966) выявил наличие существенных различий между изученными группами. В группе здоровых индивидов достоверно чаще встречалось сочетание генотипов, имеющих три и более нормальных аллеля по изученным локусам (табл. 13). Так, частота сочетания гомозиготных генотипов GG/AA в группе здоровых людей составила 9% (р=0,004, % =8,69), сочетание генотипов GG/AG обнаружено с частотой 19% у здоровых индивидов и 1% у онкобольных (р= 0,0005, %2=26,74). Наиболее значимым, оказалось сочетание генотипов GA/AA, частота которого в группах равна 32% у здоровых и 7% у больных (р= 0,0005, х2=33,27).
В группе онкобольных достоверно чаще встречались сочетания генотипов гена BRCA1, имеющих в своем составе хотя бы три рисковых аллеля. Оказалось, что частота сочетания генотипов GA/GG составила 34% у больных и 3% у здоровых (р= 0,0005, %2-51,61). А сочетания генотипов AA/AG и AAJGG обнаружены только у больных с частотой 12 % каждое (р= 0,0005, Х2=21,13).
Таким образом, носительство трех и более рисковых аллелей гена BRCA1 является фактором повышенного риска в отношении предрасположенности к развитию онкопатологий, а наличие нормального гомозиготного генотипа можно рассматривать фактором низкого риска. Таблица 13 Распределение частот сочетаний генотипов гена BRCА1 у здоровых индивидов и больных онкопатологиеи
Анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов системы биотрансформации ксенобиотиков (GSTPl, NQOl) выявил наличие существенных различий между изученными группами. Выявлено 19 сочетаний генотипов из 27 возможных. В группе здоровых индивидов достоверно чаще встречалось сочетание генотипов, имеющих нуклеотидные замены только в одном из изученных генов (табл.14). Так, частота сочетания CC/CC/GG (rsl800566, rsll31341, rsl695 соответственно), имеющего рисковый генотип по гену GSTP1 достоверно чаще встречался в группе здоровых людей (р=0,03, х2=4,71). А сочетание генотипов СТ/СС/АА и СТ/СТ/АА, имеющих рисковых аллели гена NQOl (rs!800566, rsl 131341), выявлены с частотой 12% и 9% в группе здоровых людей (р=0,001, х2=12,56; р=0,009, х2=6,89).
В свою очередь в группе онкобольных достоверно чаще выявлены сочетания генотипов, имеющие в своем составе рисковые аллели сразу в двух изученных генах. Сочетание генотипов CC/CT/AG выявлено с частотой 32% у больных и различия с группой здоровых были достоверны (р-0,001, х2= 12,61). Сочетания генотипов CT/CT/GG, TT/CT/AG, имеющих нуклеотидные замены во всех трех изученных локусах, встречаются в группе онкобольных с частотой 5% и 6%, тогда как у здоровых индивидов эти сочетания генотипов не выявлены (р=0,009, %2=6,97; р=0,03, %2=9,25 соответственно).
Типирование полиморфных локусов генов ТР53 и BRCA1 в ДЬЖ периферической крови и опухолевой ткани у больных раком молочной железы
Инфильтрирующая протоковая карцинома. Окраска гематоксилин-эозином, х100 (Ганцев, Горбунова и др., 2012).
Примечание: в плотной фиброзной строме опухолевые клетки образуют солидно-сиррозные структуры. Опухолевые клетки различной величины и формы, ядра гиперхромные, единичные митозы.
У пациентки №3 идентифицируются пять рисковых аллелей по генам ТР53 и BRCAI, способных запустить пролиферацию клеток. Персонифицированный анализ цитокинового профиля показал, что концентрация противовоспалительного цитокина IL-10 была значительно повышена, что свидетельствует о напряженной работе иммунной системы (табл. 20). В пользу такого заключения говорят следующие факты: метастазы не выявлены; два аллеля в гене ТР53 восстановились до «нормального» (табл. 19). Следует учесть, что эти пациентки не подвергались дооперационной химио- и радиотерапии. Таблица 20 Показатели цитокинового статуса у женщин, имеющих нуклеотидные замены в опухолевой ткани № образца Концентрации цитокинов, пг/мл BL-lp (0-15) II IRA (до 1500) IL2 (0-10) IL4(до 4) IL6 (до 10) пло(до 20) aNF (0-6) CRP(до 5) 2 1 271,8 0 0,93 2 2 0 1,44 уJ 1,6 314,2 1,87 0,2 6,5 38,5 4,8 1,14 Примечание: в скобках указаны значения клинической нормы продукции цитокинов Иммуноферментный анализ концентраций цитокинов в сыворотке крови Анализ содержания основных про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ показывает достоверное изменение их уровня по сравнению со здоровыми индивидами (табл. 21).
Примечание: в скобках приведены значения клинической нормы, п-количество индивидов Выявлено достоверное понижение провоспалительного цитокина IL-2 у больных раком молочной железы. Известно, что IL-2 является индуктором апоптоза (Кадагидзе, 2003).
У больных РМЖ обнаружено повышение продукции провоспалительного цитокина IL-6. Установлено, что IL-6 обладает большим влиянием на регуляцию иммунного ответа: он стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток, усиливает образование антител, участвует в продукции мультипотентных колониеобразующих факторов и мегакариоцитов, может подавлять апоптоз нейтрофилов (Кадагидзе, 2003). Помимо этого, IL-6 выступает в качестве триггера канцерогенеза, включающего самоподдерживающуюся цепь, обуславливающую инициацию и поддержание злокачественного состояния в клетках молочной железы (Rokavec et al., 2012). Некоторые авторы относят IL-6 к цитокинам, ингибирующим апоптоз, что способствует росту и ангиогенезу опухоли (Yamamoto et al, 1995; Carpi, 2009; Sangaletti et al, 2010).
Концентрации других провоспалительных цитокинов находились на уровне минимальных значений физиологической нормы (табл. 21), что может объясняться слабой иммунореактивностью. Иммуноферментный анализ содержания цитокинов в сыворотке крови больных РМЖ, проведенный в послеоперационный период не выявил изменений - концентраций цитокинов про- и противовоспалительного ряда.
У здоровых индивидов концентрации про- и противовоспалительных цитокинов находились в физиологичном соотношении согласно их функциональным взаимосвязям.
Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов со средними значениями количественных показателей цитокинов (ANOVA) у больных РМЖ Однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) у больных раком молочной железы выявлена ассоциация пониженной концентрации IL-2 с аллелем т (rsl625895) гена ТР53 (р 0,001, табл. 22; рис. 28). Патогенез онкологических заболеваний включает в себя процессы злокачественной трансформации клетки, возникающее вследствие нарушения функционирования гена онкосупрессора ТР53, и механизмы угнетения иммунного контроля, обусловленного низкой иммунореактивностью. Описание результатов однофакторного дисперсионного анализа ассоциации аллеля т гена ТР53 (rs1625895) с концентрациями IL- Сумма квадратов Степень свободы Средний квадрат F Р Между группами 40,155 1 40,155 570,617 0,01 Внутри групп 1,970 28 0,070 Итого 42,125 29 Однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) у больных раком молочной железы выявлена ассоциация низких значений IL-10 с аллелем BRCA1 A (rs80357629, р=0,038; табл. 23; рис. 29). Изменение функции белка BRCA1 в результате нуклеотидной замены в полиморфном локусе rs80357629 гена BRCA1 приводит к снижению эффективности репарации ДНК и как следствие, к генетической нестабильности. В сочетании со снижением уровня индукторов апоптоза (IL-10, IL-2, IL-4) эти два процесса способствуют прогрессии трансформированных клеток и развитию онкологических заболеваний.
Клеточный цикл сложно регулируемая система, сбои в которой неминуемо ведут к злокачественной трансформации клетки и развитию опухоли. Существуют механизмы генетической регуляции клеточного цикла, свойственные любым клеткам, независимо от локализации. В исследовании изучена роль генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, GSTP1, CAT, NQOl), как внутренних факторов риска злокачественной трансформации и значение баланса концентраций цитокинов, как внешнего фактора клеточной прогрессии.
Полученные результаты позволяют говорить о ключевой роли аллельного состояния генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков (GSTP1 VLNQOI) В формировании риска злокачественной трансформации клетки. Так, сочетание генотипов CC/CT/AG [rs 1800566 (С/Т) /rsl131341 (С/Г) rem NQOl I rsl695 (A/G) гена GSTP1] является рисковым в отношении развития онкопатологии, даже у носителей протективных аллелей в гаплотипах генов-онкосупрессоров TP53nBRCAl.
