Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Феноменологическая теория, рассматривающая роль ионного баланса в делении клетки 16
1.2. Регуляция калиевого баланса клетки в митозе 21
1.3. Регуляция натриевого баланса клетки в митозе 29
1.4. Энергетический статус клетки раннего эмбриона млекопитающих 36
1.5. Принципы электронно-зондового микроанализа (ЕРМА) 46
1.5.1. Криофиксация элементного состава клетки . 46
1.5.2. Метод freeze-drying 53
1.5.3. Физико-технические основы ЕРМА 55
1.5.4. Расчет концентрации элементов на срезе клетки по данным ЕРМА 58
1.5.5. ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов в одиночной клетке культуры и суспензии 60
ГЛАВА 2. Методы и объекты исследования 74
2.1. Получение ооцитов и ранних эмбрионов мыши 74
2 Л. 1. Суперовуляция мыши 74
2.1.2. Выделение яйцеводов мыши 75
2.1.3. Вымывание ранних эмбрионов мыши 76
2.1.4. Получение ооцитов мыши в метафазе II мейоза 77
2.1.5. Получение зигот мыши в фазах первого клеточного цикла 78
2.1.6. Получение двухклеточных эмбрионов мыши 80
2.2. Методы клеточных биотехнологий 81
2.2.1. Эквилибрация и отмывка эмбриона от криопротектора 81
2.2.2. Энуклеация зиготы мыши 83
2.2.3. Получение культуры нейральных стволовых клеток человека (нейросфер) 84
2.2.4. Обработка одноклеточного эмбриона мыши цитохалазином D 85
2.2.5. Подготовка одноклеточного эмбриона мыши для конфокальной микроскопии F-актина 87
2.3. Технология ЕРМА для раннего эмбриона мыши 89
2.3.1. Получение полутонких срезов раннего эмбриона мыши 89
2.3.2. ЕРМА внутриклеточной концентрации элементов 95
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 98
3.1. Особенности технологии ЕРМА применительно к раннему эмбриону мыши 98
3.1.1. Подготовка 2 мкм срезов раннего эмбриона мыши для ЕРМА 99
3.1.2. Эмпирический метод определения поправочного коэффициента в уравнении расчета концентрации элементов 104
3.2. Измерение концентрации элементов в клетках раннего эмбриона мыши 108
3.2.1. Сравнение групп ооцитов в метафазе II мейоза и зигот мыши по цитоплазматической концентрации калия и фосфора 108
3.2.1.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) по группам ооцитов и зигот мыши 109
3.2.1.2. Обсуждение баланса калия и фосфора в цитоплазме ооцитамыши 112
3.2.1.3. Обсуждение баланса калия и фосфора в цитоплазме зиготы мыши 113
3.2.2. Определение цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в течение первого клеточного цикла мыши 116
3.2.2.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) на разных стадиях развития зиготы мыши 116
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в Gi-фазе зиготы мыши 117
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р)в Gi/S-фазе зиготы мыши 121
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элемент.ов (К,.Е):в.8-фазе зиготы мыши 128
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К,Р)в Ог-фазе зиготы мыши 132
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в профазе митоза зиготы мыши 138
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в телофазе митоза зиготы мыши 143
3.2.2.2. Обсуждение результатов ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в течение первого клеточного цикла мыши 146
Изменения концентрации цитоплазматического калия в течение первого клеточного цикла мыши 146
Пространственное распределение цитоплазматического калия в разных фазах первого клеточного цикла 153
Оценка эффективного коэффициента диффузии калия в Gi/S-фазе зиготы мыши 156
Модель калийобусловленной полимеризации актина и механизма аккумуляции калия в цитоплазме зиготы мышы 159
Гипотеза о механизме участия актина в сближении пронуклеусов в зиготе мыши 165
3.2.3. Определение концентрации элементов (К, Р, Na) в цитоплазме бластомера двухклеточного эмбриона мыши 178
3.2.3.1. Результаты ЕРМА цитоплазматическои концентрации элементов (К, Р) в двухклеточном эмбрионе мыши. 178
3.2.3.2. Обсуждение результатов ЕРМА цитоплазматическои концентрации элементов (К, Р, Na) в двухклеточном эмбрионе мыши 183
3.3. Применение ЕРМА для контроля клеточных биотехнологий...185
3.3.1. Анализ двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации при криоконсервировании 185
3.3.1.1. Принципы криоконсервирования ранних эмбрионов млекопитающих 186
3.3.1.2. Результаты ЕРМА цитоплазматическои концентрации элементов (К, Na) в двухклеточном эмбрионе мыши после эквилибрации/отмывки 193
3.3.1.3. Обсуждение результатов ЕРМА в эксперименте эквилибрации/отмывки этиленгликоля в двухклеточном эмбрионе мыши 194
3.3.2. Анализ одноклеточного эмбриона мыши после энуклеации... 196
3.3.3. Анализ клоногенной нейросферы человека 198
Заключение .207
Выводы 211
Литература 213
- Энергетический статус клетки раннего эмбриона млекопитающих
- Подготовка одноклеточного эмбриона мыши для конфокальной микроскопии F-актина
- Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) по группам ооцитов и зигот мыши
- Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в телофазе митоза зиготы мыши
Введение к работе
Актуальность проблемы. Накоплены многочисленные данные, подтверждающие непосредственную связь между активностью ионных каналов и стадиями клеточного цикла. Установлено, что в клетках HeLa ток калия увеличивается в М- и Gi-фазе (Takahashi et al., 1993). Такой же эффект показан для эмбрионов рыбы гольца (Bregestovski et al., 1992). В М-фазе возрастает активность кальциевого канала у зародышей морского ежа (Yazaki et al., 1995) и хлорного - у асцидий (Block, Moody, 1990; Villaz et al., 1995).
В регуляции указанных каналов принимают участие разные механизмы: отмечают роль цитоскелета (Medina, Bregestovski, 1988; Yazaki et al., 1995), изменение уровня фосфорилирования (Medina, Bregestovski, 199І; Villaz et al, 1995) и изменение в комплексообразовании белков в цитоплазматической мембране, обусловленное фазами клеточного цикла (Takahashi et al., 1993). Так,
активность R eag (ether-go-go) К+-канала крысы, экспрессированного в ооците лягушки Xenopus, усиливалась в фазе G2/M за счет активации циклинзависимой киназы 1 (Brugemarm et al., 1997).
Для раннего зародыша мыши обнаружен калиевый канал с высокой проводимостью (240 pS), активность которого синхронизирована с первым клеточным циклом (Day et al., 1993,1998, 2001). Показано, что активность 240 pS К+-канала не зависит от синтеза белков, а его цикличность сохраняется и в энуклеированной зиготе. Канал функционирует независимо от ядерного цикла, но опосредованно взаимодействует с ним. Например, для работы 240 pS К+-канала требуется присутствие циклинзависимой киназы (cdkl -циклин В), а посредником является митогенактвируемая протеинкиназа (MAP-kinase), которая активна в метафазе второго мейотического деления ооцита и М-фазе первого клеточного цикла (Moos et al., 1995). Снижение активности 240 pS К+-калиевого канала в 8Л32-фазе, по-видимому, обусловлено активацией тирозинкиназы.
Для эмбриона мыши высокий уровень NaVK. -АТФазы регистрируется только на стадии бластоцисты (Powers, Tupper, 1977; Watson, Kidder, 1988; Manjewala et al., 1989; VanWikle, Campione, 1991). При низком активном транспорте калия 240 pS К+-канал может играть ключевую роль в регуляции внутриклеточного ионного баланса раннего эмбриона, определяя циклический характер его
изменений. На фоне редуцированных митохондрий в доимплантационный период зародыш развивается в гипоксической среде (Harvey et al., 2002). Энергетическое обеспечение клетки через анаэробный гликолиз индуцирует образование протонов и лактат-анионов (Allen, Orchard, 1987). В мембране клетки активизируется комплекс ионтранспортирующих систем, направленных на компенсацию цитоплазматического ацидоза и лактоза (Погорелов и др., 2000, 2002, 2004; Pierce, Czubryt, 1995).
Для специализированной клетки известна система специфичных механизмов регуляции баланса ионов при гипоксии, когда ситуация рассматривается как экстремальная. На ранней стадии развития эмбриона млекопитающих условия гипоксии, по-видимому, являются физиологической нормой, то есть на стадии зиготы должен проявляться устойчивый эффект интегративной активности эволюционно-обусловленных систем ионного транспорта, формирующих специфический внутриклеточный калиевый баланс. Изменения цитоплазматической концентрации иона К+ обусловливают молекулярно-генетические преобразования в клетке: рекомбинацию и деградацию ДНК (Parkinson et al., 2002), экспрессию генов (Taurin et al., 2002), полимеризацию/деполимеризацию актина -структурного элемента цитоскелета (Goldmann, 2003).
Таким образом, для понимания особенностей физиологии
эмбриона млекопитающих на ранних стадиях доимплантационного развития актуальным является изучение соотношения уровня цитоплазматического калия и фаз первого клеточного цикла. Однако не было установлено, регистрируется ли в ооците в метафазе II мейоза низкая концентрация калия, в какой степени цикличность кариокинеза в процессе делений дробления связана с изменением концентрации калия в цитоплазме, возможно ли депонирование калия в клеточных компартментах и какова роль этого явления в регуляции функции эмбриона. Развитие электронно-зондового микроанализа (Burovina et al., 1985; Przelecka et al., 1988; Pogorelov et al., 1991; 1994) позволяет разработать адекватный подход к решению данных проблем. Этому посвящена настоящая работа.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании динамики внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши, в разработке технологии электронно-зондового микроанализа цитоплазматическои концентрации элементов применительно к клеткам раннего эмбриона млекопитающих.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи: 1) разработать методику получения полутонких срезов раннего
эмбриона мыши для электронно-зондового микроанализа;
разработать метод расчета концентрации элементов в срезах раннего зародыша мыши по данным электронно-зондового микроанализа;
определить концентрацию калия в ооцитах мыши в метафазе II мейоза;
изучить изменение во времени цитоплазматического калия в фазах развития зиготы мыши;
5) определить концентрацию калия и натрия в бластомере
двухклеточного эмбриона мыши;
6) оценить влияние микрохирургических манипуляций, производимых
при пересадке ядра специализированной клетки в зиготу мыши, на
содержание цитоплазматического калия в клетках эмбриона;
7) оценить изменение концентрации калия в бластомере
двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации в протоколе
криоконсервирования;
8) изучить распределение калия в клеточном клоне, формируемом при
культивировании нейральной стволовой клетки.
Научная новизна. Впервые при использовании технологии электронно;Зондового микроанализа определена цитоплазматическая концентрация элементов (К, Na, Р) в эмбрионе мыши на начальных
стадиях доимплантационного развития. Прямым измерением показано, что в цитоплазме ооцита мыши на стадии метафазы II мейоза регистрируется низкая концентрация калия (-60 мМ). Впервые выявлено, что содержание калия в одноклеточном эмбрионе мыши меняется циклически со временем. Изменение цитоплазматической концентрации калия синхронизировано с фазами первого клеточного цикла мыши. В Gi-фазе наблюдается относительно низкий уровень (~70 мМ) элемента, концентрация которого в S-фазе увеличивается (-160 мМ) и вновь падает (~110 мМ) в С2-фазе. Уменьшение в цитоплазме зиготы содержания калия до ~45 мМ продолжается в митозе и только на его заключительной стадии концентрация данного элемента восстанавливается до —80 мМ. Причиной этого может быть цикличность в работе 240 pS К+-канала, которая не зависит от ядерного цикла.
Впервые показано, что калий в одноклеточном эмбрионе распределен неоднородно и характер его гетерогенного распределения меняется в течение первого клеточного цикла. Дефицит калия, который образуется в примембранной области при активации 240 pS К+-канала, индуцирует деполимеризацию актина в периферической цитоплазме.
Впервые оценена величина эффективного коэффициента диффузии калия в зиготе мыши в Gi/S-фазе, которая находится в
интервале от 10"13 до 10"14 м2/с.
Впервые показано, что для двухклеточного эмбриона мыши характерна высокая цитоплазматическая концентрация натрия.
Теоретическая значимость. Представлены новые данные о динамике изменения концентрации калия в зиготе мыши, на фоне которого реализуются основные молекулярно-генетические события раннего эмбриогенеза.
Сформулирована и обоснована феноменологическая модель калийобусловленной полимеризации актина в зиготе млекопитающих, с помощью которой можно рассматривать образование в клетке гель-актиновой структуры, депонирующей ион К+, что объясняет пространственно-временную гетерогенность распределения калия в эмбрионе.
Предложен оригинальный механизм сближения пронуклеусов в зиготе мыши, согласно которому причиной направленной миграции органелл является перемещение к центру зиготы фронта гель-актиновой структуры, формируемой при ингибировании 240 pS К+-канала на стадии Gi/S-фазы.
Практическая значимость. Разработана технология электронно-зондового микроанализа содержания калия в эмбриональной клетке
мыши на ранних стадиях доимплантационного периода, которая последовательно включает получение интактного зародыша, подготовку полутонких срезов эмбриона, измерение внутриклеточной концентрации калия. Предложенные методические приемы могут быть применены и к другим одиночным биологическим объектам, малые размеры которых затрудняют использование традиционных в цитологии подходов.
Предложен метод контроля за состоянием зиготы млекопитающих после пересадки в нее ядерного материала по критерию цитоплазматической концентрации калия.
Предложен метод тестирования влияния эквилибрации/отмывки криопротектора в протоколе криоконсервирования зародышей млекопитающих по критерию концентрации калия в бластомере.
Предложен метод изучения структурно-функциональной гетерогенности клеточного клона, полученного при культивировании нейральной стволовой клетки, по критерию внутриклеточной концентрации калия.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В течение первого клеточного цикла, в результате интегративной активности ионтранспортирующих систем катиона К+, внутриклеточная концентрация калия в зиготе мыши возрастает на
стадии Gi/S-фазы от 60 мМ до 148 мМ и уменьшается до 44 мМ в профазе митоза.
Изучено пространственно-временное распределение цитоплазматического калия в разных фазах развития одноклеточного эмбриона мыши, которое характеризуется градиентом концентрации калия между кортикальной и центральной зонами цитоплазмы.
Разработана феноменологическая модель калийобусловленной полимеризации актина в зиготе мыши, которая позволяет объяснить сближение пронуклеусов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях «Сохранение генетических ресурсов» (Санкт-Петербург, 2004), «Biological Motility» (Пушино, 2004); «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), II International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» (Москва, 2004), XIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), на межлабораторной научной конференции НИИ Морфологии человека (Москва, 2005) и ИТЭБ
РАН (Пушино, 2005), на межлабораторном семинаре Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2005).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав (обзор литературы, методы и объекты исследования, результаты исследований и их обсуждение), заключения и основных выводов. Список литературы содержит 360 источников. Работа изложена на 262 страницах машинописного текста, содержит 49 рисунков и 21 таблицу.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 13 статей в реферируемых журналах и 2 патента.
Энергетический статус клетки раннего эмбриона млекопитающих
Одновременно с работами, подтверждающими основные положения феноменологической теории, появились публикации, в которых на основе экспериментальных данных обосновывалась роль калия в регуляции клеточного объема (Shank et al., 1973). Намного раньше методом пламенной фотометрии показали, что в интенсивно пролиферирующей асцитной опухоли Эрлиха концентрация калия претерпевает такие же изменения, как и концентрация натрия (Hempling, 1958). Следует отметить, что для дифференцированной клетки, в отличие от делящейся, характерно высокое содержание в цитоплазме калия и низкое натрия (Hodgkin, Huxley, 1952). Асимметричный градиент ионов на мембране поддерживает Na+/K+-АТФаза. Насос обеспечивает компенсацию разнонаправленных потоков пассивного транспорта катионов К и Na+ по их электрохимическому градиенту, то есть внутриклеточная концентрация калия и натрия является результатом интегративнои работы активного и пассивного транспорта. Данные, представленные в предыдущем разделе, во многом носят феноменологический характер. Развитие аналитических подходов для изучения механизмов контроля ионного баланса позволило открыть комплекс каналов, сложным образом регулирующих пассивный транспорт калия через цитоплазматическую мембрану. Наличие высокоспециализированных калиевых каналов - АТФ-зависимого (Noma, 1983), Na-зависимого (Kameyama et al., 1984), лактатного симпорта (Kleber, 1984; Lindinger et al., 1996), кислород-зависимого (Conforti et al., 2000) -указывает на значимость катиона К+ в обеспечении поли функциональности клетки.
Накоплен значительный материал, свидетельствующий о важной роли ионных каналов и в развитии митогенеза специализированной клетки (Dubois, Rouzaire- Dubois, 1993; Strobl et al., 1995; Wonderlin, Strobl, 1996). В лимфоцитах, например, при фиброзах в Go/Gi-фазе усиливается активность К+-канала (Chandy et al., 1984; Brent et al., 1990; Krauss et al., 1992). Другой пример - клетки HeLa, в которых ток калия увеличивается в фазах М и Gi (Takahashi et al., 1993). В результате регуляции уровня калия изменяется мембранный потенциал, что индуцирует начало митоза через открытие потенциалзависимого Са2+ канала и увеличение уровня кальция в цитоплазме (Nilius, Wohlrab, 1992). Роль калиевых каналов в пролиферации разных типов специализированных клеток была показана в экспериментах, когда применение соответствующих блокаторов канала предотвращало начало митоза (Leonard et al., 1992; Woodfork et al., 1995; Lepple-Wienhues et al., 1996). У некоторых линий ингибирование пассивного транспорта калия останавливало развитие клеточного цикла в Gi-фазе (Amigorena et al., 1990; Xu et al., 1996).
В качестве характеристики канала используют пропускную способность мембраны для ионов. Классификация ионных каналов основана на их проводимости и ионной селективности. Выделяют четыре основные группы каналов. К первой относят ионселективные каналы, которые не только разделяют ионы по знаку, но и проявляют высокую степень избирательности. В 0,1 М растворах проводимость таких каналов сравнительно мала (около 10pS), что соответствует б переносу через канал около 10 ионов в секунду при напряжении на мембране 100 мВ. Вторую группу составляют валентно-селективные каналы, избирательные в отношении знака, но слабо дискриминирующие ионы данной валентности. Проводимость таких каналов имеет более высокие значения, обеспечивающие скорость 10 ионов в секунду при напряжении на мембране 100 мВ. К третьей группе относятся неселективные каналы, обладающие высокой проводимостью и слабой селективностью. Проводимость каналов этой группы составляет 10-10 ионов в секунду при напряжении на мембране 100 мВ. Последнюю, четвертую группу составляют "макси" каналы, которые отличаются от других способностью совмещать высокую ионную избирательность и высокую проводимость (100 300pS для 0,1 М растворов). Проводимость таких каналов составляет s около 10 ионов в секунду при 100 мВ напряжении на мембране, что на несколько порядков выше скорости транспорта калия через каналы, например, первой группы. Термин "ионный канал" обозначает комплекс белков и/или гликопротеинов, встроенных в мембрану. Как правило, канал структурно связан с другими мембранными белками и цитоскелетом. Его белковая молекула может состоять из нескольких тысяч аминокислот, организованных в одну или несколько полипептидных цепей с несколькими сотнями ковалентно-связанных полисахаридных цепей на наружной поверхности. Гидрофильные аминокислоты "выстилают" внутренность поры, а гидрофобные - контактируют с липидами бислоя. Для канала отмечают три основные функции: формирование поры, через которую ионы перемещаются по их электрохимическому градиенту, селективный отбор ионов, проходящих через пору и контроль потока ионов (Hilte, 1991).
Подготовка одноклеточного эмбриона мыши для конфокальной микроскопии F-актина
Один из основателей биологического электронно-зондового микроанализа B.L.Gupta (1993) отмечал, что для полного понимания роли ионов в регуляции клеточных функций необходимо получить следующие количественные данные, характеризующие состояние клетки: 1) концентрацию анализируемого элемента в клетке и в отдельных ее органеллах; 2) распределение элемента в клетке; 3) элементный состав пространства, которое прилегает непосредственно к цитоплазматической мембране извне и формирует микроокружение клетки; 4) содержание воды и массы сухого остатка в исследуемом компартменте клетки; 5) концентрацию свободных ионов (их активность). Электрон но-зондовый микроанализ (ЕРМА) обеспечивает получение информации по четырем чунктам из указанного перечня для всех элементов периодической таблицы, начиная с бериллия (Z=4) и выше (Goldshtein et al., 1992). Данный метод электронной микроскопии, учитывающий технические особенности электронного микроскопа, предполагает исследование клетки in situ с применением адекватных методик подготовки препарата, которые фиксируют состояние клетки во времени. Другими словами, методом ЕРМА невозможно регистрировать изменение концентрации элемента в режиме «on line». Это ограничение требует подготовки серии образцов, каждый из которых характеризует клетку в определенном физиологическом состоянии.
Достоинствами метода являются его локальность и универсальность, что позволяет проводить анализ широкого ряда элементов на одном визуализированном участке среза с субклеточным разрешением. Сравнивая ЕРМА с другими методами, следует отметить, что активность ионов может быть определена непосредственно в клетке, например, ионселективными электродами. Однако при этом теряется локальность измерения на уровне клетки. Еще один пример- применение иончувствительных красителей, таких как Fura-2 для Са . В этом случае метод применим только к одному элементу и возникает традиционный вопрос о специфичности используемого красителя и о влиянии протокола окрашивания на функцию клетки. Измерение ионов в органеллах и/или фрагментах клетки, изолированных биохимическим способом, стратегически не оправдано. Это обусловлено тем, что объект исследования (ядра, митохондрии, пигментные гранулы, пузырьки с секретом и др.), независимо от метода выделения, неконтролируемо меняет свой элементный состав.
Технические особенности электронно-зондового микроанализа (ЕРМА) ограничивают применение метода в области биологических исследований. Таким сдерживающим условием является устойчивость образца к воздействию ускоренных электронов в условиях вакуума. По этой причине изначально электронно-зондовый микроанализ был разработан как метод исследования элементного состава объектов физики твердого тела (Birks, 1963; Heinrich, 1982). С начала 1970-х годов развивается теоретическая и экспериментальная база ЕРМА применительно к задачам биологии (Glick, 1969; Oster, 1971; Hall et al., 1974; Hayat, 1974; Glauert, 1977; Gupta et al., 1977; Hren et al., 1979; Lechene, Warner, 1979). В это же время "биологический" микроанализ интенсивно осваивается отечественными учеными (Govardovskij et al., 1976; Burovina.et al., 1978; Allakhverdov et al., 1980). Особенности развития электронно-зондового микроанализа в нашей стране изложены в кратком обзоре (Pogorelov, 1993). Прямое изучение клетки в вакуумных приборах невозможно из-за высокого содержания в цитоплазме воды (в среднем до 80%). Наличие воды в биологических тканях требует разработки специальных препаративных подходов. К сожалению, традиционные методики просвечивающей электронной микроскопии ультратонких срезов приводят к неконтролируемому перераспределению (вымыванию) легко диффундирующей компоненты клеточного состава (Stumpf, Roth, 1966). Некоторые элементы локализуются посредством их осаждения в виде нерастворимого осадка (Komnick, 1962; Iren, van Spiegel, 1975). Однако специфичность цитохимической реакции исключает возможность осаждения в клетке одновременно всех химических элементов. По этой причине потребовались новые подходы, благодаря которым распределение внутриклеточного элементного состава сохраняется на уровне, близком к интактному состоянию.
В настоящее время существует несколько способов подготовки срезов ткани для ЕРМА и все они основаны на криофиксации как начальном этапе подготовки образца (Echlin, 1992). Разработан метод низкотемпературной фиксации посредством нанесения образца на поверхность металла, охлажденную до температуры жидкого азота (Eranko, 1954; Dempsey, Bullivant, 1976). Такой способ обеспечивает высокую скорость криофиксации только в местах контакта с металлом. Более широкое распространение получила практика замораживания путем погружения всего образца в жидкий криоагент. С этой целью предложено использовать ряд крио фиксаторов (Costello, Corless, 1978).
Выбор среды для замораживания осуществляется по критерию минимизации размеров кристаллов льда, которые образуются при низкотемпературной фиксации клетки. Процесс кристаллизации/рекристаллизации приводит к перераспределению элементов в рамках кристаллических структур льда (Burovina et al., 1978). В силу этого важной характеристикой является не только конечная температура криофиксации, но и скорость охлаждения, от которой зависит размер кристаллов (Dowell, Rinfret, 1960; Laget, 1960; Rasmussen, 1982). Наибольшая скорость замораживания достигается в жидком пропане (85К), переохлажденном жидким азотом. При этом пропан не затвердевает долгое время, что значительно упрощает манипуляции с ним.
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) по группам ооцитов и зигот мыши
Используя экспериментальные подходы, принятые при подготовке изолированной клетки целиком (рис 1.7), была предложена методика для исследования раннего зародыша мыши (Baltz et al., 1997). При этом присутствовали все основные недостатки анализа whole cell: неконтролируемое отмывание препарата от физиологической среды и анализ клетки on mass без субклеточного разрешения. Дальнейшее развитие ЕРМА эмбриона млекопитающих было надолго остановлено отсутствием технологии подготовки полутонких срезов. Только в последние годы данная проблема была успешно решена (Гольдштейн и др., 2005; Погорелов и др., 20056).
В указанных работах, используя разработанную методику подготовки полутонких срезов эмбриона мыши, были получены уникальные результаты для таких перспективных клеточных технологий, как криоконсервирование раннего эмбриона (Гольдштейн и др., 2004а; Погорелов и др., 2004в), терапевтическое клонирование (Гольдштейн и др., 20046; Погорелов и др., 2004г). Подходы ЕРМА, наработанные для раннего эмбриона мыши, могут быть использованы в других областях клеточных технологий, в которых размеры объекта исследования сопоставимы с размером одиночного эмбриона. Примером такого удачного применения является анализ клоногенных нейросфер человека, полученных при культивировании нейральных стволовых клеток (Гольдштейн и др., 2005а). Основной цитоплазматический ион К наиболее быстро и выражено реагирует на изменение ситуации. По этой причине внутриклеточная концентрация калия представляется важным критерием для оценки травматичности манипуляций, используемых в клеточных технологиях. Такой подход позволяет целленаправленно разрабатывать процедуры, например, терапевтического клонирования, при которых необходимо выполнить условие сохранности внутриклеточного баланса элементов.
На наш взгляд, существует несколько направлений клеточных технологий, в которых успешно реализуются преимущества ЕРМА. Среди фундаментальных и методических проблем, требующих решения, можно назвать анализ элементного баланса в клетках синхронизированной культуры в разных фазах митоза, скорость восстановления Na/K-баланса в раннем эмбрионе млекопитающих после манипуляций при энуклеации или криоконсервировании, Необусловленную полимеризацию актина как составную часть механизма сближения пронуклеусов в зиготе млекопитающих, роль перивителлинового пространства в качестве буферного объема при регуляции Na/K-отношения цитоплазмы эмбриона.
В связи с этим необходимо решить, в какой степени состояние клетки in vitro соответствует ситуации in vivo, то есть как в условиях культивирования внеклеточное окружение влияет на клеточный гомеостаз и, следовательно, на функцию клетки. Данная проблема обусловлена тем, что для гепатоцита (Warley et al., 1986), кардиомиоцита (Warley, 1988; Погорелов и др., 1997) и нейрона (Pogorelov et al., 1994) выявлено различие в состоянии клетки in vivo и in vitro. В этом аспекте представляется важными экспериментальный сравнительный анализ баланса элементов в тотипотентной эмбриональной клетке млекопитающих на стадии морулы или бластоцисты (аналога клеточного клона) и клоногенной структуры, выращенной из стволовой клетки. К условиям среды обитания, оказывающим модифицирующее влияние на развитие клетки в культуре, кроме основных показателей, можно отнести и экспериментальные микродобавки (витальные красители, зонды, антитела, физиологические заменители субстратов и химических элементов, изотопы и др.). Таким образом, электронно-зондовый микроанализ является перспективным методом изучения состояния одиночной клетки в культуре.
Завершая обзор данных литературы, следует отметить, что цитоплазматический калиевый баланс, изменяющийся во времени, не только описывает состояние клетки, но и индуцирует молекулярно-генетические _ изменения. По этой причине для понимания механизмов, лежащих в основе специфических свойств физиологии зиготы млекопитающих, актуальным является анализ цитоплазматической концентрации калия на разных стадиях развития зародыша. На данной научной проблеме был сделан основной акцент нашего исследования. Для решения экспериментальных задач был применен метод электронно-зондового микроанализа, который был дополнен разработанной нами технологией подготовки эмбриона млекопитающих с целью получения полутонких срезов зародыша.
Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в телофазе митоза зиготы мыши
Внутриклеточный состав элементов в изолированном ооците, зиготе и двухбластомерном эмбрионе мыши анализировали на срезах, толщиной 2 мкм. Основной проблемой при получении среза для ЕРМА из одиночного эмбриона млекопитающих является небольшой размер (-100 мкм) объекта. Для этого была разработана специальная технология подготовки срезов раннего эмбриона мыши (Гольдштейн и др., 2005а; Погорелов и др., 20056), основанная на криофиксации и низкотемпературной дегидратации мягких биологических тканей.
Ранний эмбрион мыши, выделенный в соответствии с описанной выше методикой, в капле среды Дульбекко переносили на поверхность медной подложки, которая имела вид круглой сеточки диаметром 3 мм, толщиной -0,05 мм с размером ячеек —40 мкм. Геометрия подложки обеспечивает по всей поверхности образца контакт с криоагентом. Каплю (-5 мкл) замораживали погружением в жидкий пропан, переохлажденный жидким азотом до температуры 85К. При этом время криофиксации определяли термическими свойствами медной подложки, масса которой намного больше таковой эмбриона, и не превышало 0,1 с.
Замороженный образец переносили в медный контейнер с жидким азотом, где с его поверхности фильтровальной бумагой удаляли излишек криоагента. При азотной температуре (77К) каплю переносили в камеру лиофилизатора (Allachverdov, Kuzminykh, 1981; Pogorelov et al., 1991). Низкотемпературную дегидратацию проводили при температуре (170К) и высоком вакууме (10 Па) в камере установки Balzers ВА 3 (Balzers, Лихтенштейн). По завершении лиофилизации высушенные образцы, не вынимая из вакуумной камеры, нагревали до 300К.
Перед тем как достать препарат из камеры лиофилизатора ее заполняли сухим аргоном и в среде инертного газа образцы переносили в 100% заливочную среду, подготовленную на основе эпоксидной смолы Ероп 812 (Luft, 1961). Описанная последовательность манипуляций позволяет избежать конденсации атмосферных паров воды на поверхность высушенной и очень гигроскопичной клетки. Пропитывание образца смолой проводили по схеме: 300К - 24 часа, 310К - 24 часа, 330К - 24 ч. На заключительном этапе заливочная среда полимеризовалась, образуя консистенцию, напоминающую по цвету и твердости янтарь.
Из лиофилизированных залитых в смолу клеток (эмбрионов), используя микротом "Reichert" (Австрия), сухим стеклянным ножом получали срезы толщиной 2 мкм, которые монтировали на бленды, вырезанные в медной сеточке для электронного микроскопа. Затем на поверхность срезов термическим распылением в вакууме наносили слой углерода толщиной до 20 нм. Для напыления использовали установку "JEE 4С" ("JEOL", Япония). Дополнительный морфологический контроль качества среза осуществляли под световым микроскопом "Peraval Interphako" ("Zeiss", Германия), оснащенном цифровой камерой "WAT-505ex" ("Watec", Япония). Посредством программы "Videoln" изображение регистрировали на мониторе компьютера IBM PC ("Pentium IV"). Возможность использования указанного режима наблюдения описана нами раннее (Гольдштейн и др., 2004в).
Манипуляции при подготовке полутонких (толщиной 2 мкм) срезов раннего эмбриона мыши для ЕРМА проводили в следующей последовательности. Подложку для криофиксации образца, которая имеет вид медной сетки диаметром 3 мм и толщиной -0.05 мм, зажимали в пинцет и располагали в центре поля зрения бинокулярной лупы МБС-2. Подготовленные эмбрионы по одному или группой в капле физиологического раствора переносили на медную подложку для криофиксации. Затем подложку вместе с образцом быстро опускали в емкость с жидким пропаном (85К), переохлажденным жидким азотом (для криофиксации объекта таких малых размеров, как эмбрион млекопитающих, можно использовать в качестве криоагента и жидкий азот). Замороженные на подложке образцы в парах жидкого азота переносили в охлажденный до температуры жидкого азота (77К) медный контейнер, который помещали на держатель лиофилизатора, находящийся в жидком азоте. Всю конструкцию переносили в камеру лиофилизатора, изготовленного на основе высоковакуумной установки "МВАЗ" ("Balzers", Лихтенштейн), где образцы подвергались низкотемпературной дегидратации в течение 24 ч.
Подготовку заливочной среды и эпоксидных блоков проводили в следующей последовательности: в сухую обезжиренную емкость заливали исходные составляющие смолы (Ероп 812, DDSA, MNA) и после тщательного перемешивания добавляли катализатор DMP-30. Готовую смесь повторно перемешивали.
Готовую среду разливали по формам, которые помещали в термостат на 57С для полимеризации смолы в течение 24 ч. Получали твердые блоки, на поверхности которых затачивали усеченную пирамидку с площадкой на ее вершине размером 1x1 мм.
В пирамидке кончиком лезвия вручную высверливали конусом лунку, глубина и диаметр которой не превышали 0,3 мм, и е нее вносили свежую порцию заливочной среды так, чтобы образовался вогнутый мениск.
