Введение к работе
Актуальность темы исследования. Доимплантационный период эмбриогенеза млекопитающих характеризуется наличием нескольких критических этапов развития, в течение которых происходят принципиальные изменения морфофункционалыгого состояния зародышей. В частности, к ним относят активацию эмбрионального генома, а также начальные формообразовательные процессы (компакти-зацию и кавитацию) [1,2].
Известно, что у различных видов млекопитающих активация эмбрионального генома осуществляется на разных стадиях доимплан-тационного развития [3]. В эмбриогенезе мыши основные события активации эмбрионального генома происходят на протяжении второго клеточного цикла, что дает основание рассматривать двукле-точную стадию развития как одну из критических.
Последовательность молекулярно-генетических преобразований, связанных с активацией эмбрионального генома, и принципы действия контролирующих ее механизмов, подробно изучены [4,5,6], в то время как структурная организация и физиологическое состояние эмбрионоп на двуклеточпой стадии охарактеризованы неполно. Вместе с тем, анализ морфофункционалыюго состояния двуклеточ-ных зародышей позволил бы изучить начальные этапы становления ядерно-цитоплазматических взаимоотношений и дефинитивных морфологических черт организации ряда клеточных структур. В частности, такой подход дает возможность выявить связь между последовательным изменением организации цитоплазмы эмбрионов и их способностью успешно развиваться in vitro. Подобные исследования могут проводится как на интактных зародышах, так и на модельных системах - соматических гибридах бластомеров двуклеточных зародышей. Метод соматической гибридизации позволяет комбинировать в составе гибридной клетки цитоплазму и ядра партнеров, находящихся в различном морфофункционалыгом состоянии. Подобный подход дает возможность проводить цитологический анализ процесса интеграции этих клеточных компонентов и становления ядерно-цитоплазматических отношений при формировании и развитии соматических гибридов.
Известно, что качественные изменения транскрипционной и синтетической активности, связанные с активацией эмбрионального генома, приводят к повышению чувствительности двуклеточных зародышей к действию внешних факторов [7]. Анализ развития заро-
дышей в культуре показал, что эмбрионы мышей определенных генотипов не способны проходить полное доимплантационное развитие вне материнского организма. Культивируемые в стандартных синтетических средах эмбрионы, полученные путем внутрили-нейного скрещивания, в отличие от зародышей гибридных генотипов, останавливаются в развитии на границе фаз G2/M второго клеточного цикла. Этот феномен, получивший название «двуклеточ-ного блока in vitro» [8], проявляется при культивировании эмбрионов, извлеченных из материнского организма до завершения активации эмбрионального генома [9]. Показано, что предрасположенность к двуклеточному блоку in vitro определяется генотипом яйцеклетки и отражает действие на ранние этапы развития материнских цитоплазматических контролирующих механизмов [10,11]. В связи с этим даже успешно дробящиеся в культуре эмбрионы мышей разных генотипов в конце двуклеточной стадии обладают неодинаковыми потенциями к дальнейшему развитию: они оказываются либо компетентными к нему, либо предрасположенными к «двуклеточному блоку in vitro». Подобная ситуация позволяет провести сравнительный анализ морфофункционального состояния эмбрионов, обладающих различными потенциями к развитию in vitro.
Особый интерес здесь представляет изучение событий, происходящих в цитоплазме и оказывающих пря мое влияние на способность зародышей развиваться in vitro. Реорганизация цитоплазмы в этом случае создает необходимые условия для нарастания синтетической активности эмбрионов, и, в конечном счете, отражает процесс переключения контроля развития с материнской программы на эмбриональную. С этой точки зрения, актуальным представляется изучение функциональной роли митохондрий на начальных этапах эмбриогенеза.
Анализ поведения митохондрий на широком круге объектов [12,13,14] с одной стороны, и накапливающиеся данные об ассоциации митохондрий с компонентами цитоскелета [15,16] и закономерностях их перемещения в ходе клеточного деления и цитодифферен-цировки [17,18] с другой, позволили допустить существование механизмов активного регулирования внутриклеточной локализации митохондрий при изменении морфофункционального состояния клеток [19]. Однако, в рамках изучения раннего эмбриогенеза млекопитающих, все эти вопросы исследованы недостаточно подробно. Работы, выполненные еще в семидесятых годах сформировали пред-4
ставление о двуклеточной стадии развития млекопитающих как о стадии, для которой характерны отсутствие митохондрий обладающих ортодоксальной структурой и низкая метаболическая активность этих органелл [20], в то время как все энергетические потребности эмбриона покрываются за счет расходования запаса АТФ, накопленного в процессе оогенеза [21]. Вместе с тем, данные, полученные в течение последних лет свидетельствуют о функциональной активности таких, еще не имеющих дефинитивной организации, митохондрий и наличии их специфического перераспределения на одно-четы-рехклеточной стадиях развития [22,23]. Сведения такого рода представляют несомненный интерес, поскольку становится все более очевидным [9,22], что существует связь между способностью зародышей осуществлять организованное и специфическое изменение внутриклеточной локализации митохондрий и способностью успешно проходить первые деления дробления [22,23).
Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, основная цель работы состояла в прижизненном изучении структурно-функциональной организации эмбрионов мыши различных генотипов на двуклеточной стадии развития, соответствующей периоду активации эмбрионального генома. Конкретные задачи исследования сводились к следующему:
-
Провести анализ влияния эксплантации эмбрионов разных генотипов, находящихся на различных этапах активации эмбрионального генома, на потенции к их дальнейшему развитию in vitro.
-
Исследовать динамику локализации митохондрий на протяжении двуклеточной стадии развития у эмбрионов мышей разных генотипов, обладающих неодинаковыми потенциями к развитию in vitro.
-
Изучить перераспределение митохондрий в бластомерах зародышей, разное время находящихся в состоянии «двуклеточного блока in vitro».
-
Сопоставить динамику внутриклеточной локализации митохондрий, наблюдаемую у эмбрионов в состоянии генетически предопределенного «двуклеточного блока in vitro» и в ходе остановки их развития на стадиях G, и G2 второго клеточного цикла, вызванной действием ингибиторов клеточной пролиферации.
-
Исследовать взаимосвязь между процессом интеграции цитоплазмы и ядер при соматической гибридизации бластомеров двукле-точных эмбрионов разных генотипов и способностью таких реконструированных зародышей к дальнейшему развитию in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту:
характерной особенностью локализации митохондрий двуклеточных зародышей мышей, компетентных к полному доимпланта-ционному развитию, является их повышенная концентрация вокруг ядер (в виде тонкого кольца) и в зоне прилегания бластомеров. Вне указанных зон митохондрий распределены диффузно.
локализация митохондрий в перинуклеарной зоне обусловлена особым морфофункциональным состоянием ядра, связанным с активацией эмбрионального генома и начальными этапами формирования ядрышек, а также спецификой ядерно-цитоплазматическо-го транспорта у двуклеточных зародышей, у которых транспорт веществ в цитоплазму осуществляется не только через поровые комплексы, но и путем блеббинга ядерной мембраны.
эмбрионы, предрасположенные к блоку и прекратившие при культивировании развитие в конце G2 фазы второго клеточного цикла, обладают иной, чем эмбрионы, компетентные к развитию, топографией митохондрий в клетках: у них отсутствует перинуклеар-ная локализация митохондрий и наблюдаются многочисленные ми-тохондриальные кластеры, распределенные по всему объему бластомеров.
развитие состояния «двуклеточного блока in vitro» сопровождается перераспределением митохондрий в бластомерах, пространственные и временные параметры которого специфичны для эмбрионов разных генотипов.
- формирование продукта слияния бластомеров не сопровожда
ется интенсивным перемешиванием цитоплазмы и слиянием ядер. В
отличие от процесса миграции пронуклеусов во время формирова
ния зиготы, перемещение ядер к центру дикариона не вызывает уве
личения концентрации митохондрий в перинуклеарных зонах. Пол
ное объединение партнеров слияния и образование соматического
гибрида осуществляется на стадии метафазы первого деления дроб
ления.
Научная новизна и практическое значение работы. Методами прижизненной люминесцентной и фазово-контрастной микроскопии, соматической гибридизации бластомеров двуклеточных эмбрионов и цитогенетаческого анализа, проведено сравнительное исследование локализации митохондрий в бластомерах у зародышей мышей разных генотипов, различающихся по способности к развитию in vitro.
Впервые показано, что локализация и функциональное состоя-6
ниє митохондрий в бластомерах двуклеточных эмбрионов отражают процесс морфофункционалыюй реорганизации ядра, сопровождающей активацию эмбрионального генома. Установлено, что характер распределения митохондрий на средней и поздней двуклеточ-ной стадии развития эмбрионов позволяет прогнозировать успешность прохождения ими второго деления дробления. Найдено, что митоз способны осуществить эмбрионы с диффузным распределением в цитоплазме функционально активных митохондрий и небольшой их концентрацией в перинуклеарой и кортикальной зонах бластомеров. В то же время формирование в цитоплазме эмбрионов многочисленных митохопдриальных кластеров сопровождает остановку их развития на двуклеточной стадии. Обнаружено, что при блокировании дробления с помощью генистеина и мимозина, зародыши сохраняют перинуклеарную концентрацию митохондрий, отсутствующую у эмбрионов в состоянии «двуклеточного блока in vitro». Последние характеризуются наличием в цитоплазме бластомеров периферически расположенных, разнообразных по размеру митохопдриальных кластеров.
Методами прижизненной люминесцентной микроскопии, поэтапно прослежены события, происходящие при формировании продукта слияния бластомеров и последующем делении тетраплондно-го соматического гибрида.
Впервые показано, что формирование продукта слияния двуклеточных бластомеров мыши не сопровождается интенсивным перемешиванием цитоплазмы и слиянием интерфазных ядер. Полная интеграция партнеров слияния осуществляется на стадии мстафазы, во время которой хромосомы обоих партнеров располагаются на общем веретене деления. Цитогенетический анализ подтвердил возможность асинхронного прохождения первого деления дробления бластомерами тетраплоидных соматических гибридов - аналогично тому, что наблюдается у интактных диплоидных зародышей. Показано, что способность бластомеров к слиянию зависит от стадии клеточного цикла, на которой они находятся, и синхронности его прохождения обоими партнерами.
На основе комбинации методов фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии предложена тест-система, обеспечивающая быстрый прижизненный анализ морфофункционального состояния ранних зародышей млекопитающих.
Полученные в работе данные могут быть включены в курсы лекций для студентов высших учебных заведений, специализирующих-
ся в области клеточной биологии и биологии развития.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международных симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С-Петербург 1993,1994 г.). Международном симпозиуме «Механизмы развития:
онтогенетические и эволюционные аспекты», (Москва 1994 г.). Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», (С.-Петербург, 1997 г.), Европейских симпозиумах по клеточной биологии Ренне,Франция,1993 г., Прага,Чехия 1994 г., Брайтон, Великобритания 1997 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на /03 страницах и состоит из введения, Ц глав и выводов.
Диссертация иллюстрирована /у рисунками и включает -/ таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает источников, в том числе - на русском языке.
Автор посвящает работу памяти своего первого научного руководителя Галины Григорьевны Секириной, безвременно ушедшей из жизни.
Автор выражает искреннюю признательность за плодотворное сотрудничество И.О.Боголюбовой, И.Э. Негановой, Н.В. Антоновой.
