Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Оценка генетического действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы (обзор литературы) 10
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 31
2.2. Исследованные факторы 32
2.3. Методы исследования 45
2.3.1. Микроядерный тест на эпителиальных клетках мочевого пузыря экспериментальных животных
2.3.1.1. Приготовление суспензионных препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря после их фиксации в формалине 45
2.3.1.2. Приготовление суспензионных препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря ex tempore 47
2.3.2. Микроядерный тест на клетках коркового вещества почки экспериментальных животных 47
2.3.3. Микроядерный тест на клетках костного мозга экспериментальных животных 48
2.3.4. Микроядерный тест на эксфолиативных уротелиальных клетках человека 50
2.3.5. Характеристика анализируемых цитогенетических и кариологических показателей в клетках органов животных и человека 53
2.3.6. Протоколы учета результатов анализа 57
2.3.7. Статистический анализ исследования 58
Собственные исследования
Глава 3. Сравнительная оценка цитогенетических и других кариологических показателей в клетках органов выделительной системы контрольных животных 59
Глава 4. Оценка временных и дозовых параметров цитогенетического и цитотоксического эффектов циклофосфамида в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей 63
4.1. Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия и дозы мутагена 64
4.2. Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от времени после окончания воздействия 73
Глава 5. Оценка цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ на клетки выделительной системы экспериментальных животных микроядерным методом
5.1. Оценка цитогенетического и цитотоксического действия метиленового голубого на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс 77
5.2.Оценка цитогенетического и цитотоксического действия профлавин ацетата в уротелиальных клетках мочевого пузыря крыс 79
5.3. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов диоксидина в клетках коркового вещества почки мышей 81
5.4.0ценка цитогенетического действия диоксазида на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс 83
5.5. Оценка цитогенетической активности диоксида азота в эпителиальных клетках мочевого пузыря крыс 86
5.6. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов изолированного и сочетанного действия солей цезия, стронция и у-излучения при различных сроках воздействия в эпителиальных клетках мочевого пузыря и почек мышей 90
Глава 6. Оценка цитогенетического и цитотоксического действия смесей химических соединений на клетки выделительной системы экспериментальных животных
6.1. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ1 (продуктов химической нейтрализации люизита) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей 95
6.2. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ2 (продуктов химической нейтрализации иприта) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей 99
6.3. Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси продуктов химической нейтрализации совтола (ПХДС-Т)
в эпителиальных клетках мочевого пузыря крыс 104
Глава 7. Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей в эксфолиативных уротелиальных клетках человека 106
Глава 8. Обсуждение 109
Выводы 121
Список используемой литературы
- Микроядерный тест на эпителиальных клетках мочевого пузыря экспериментальных животных
- Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия и дозы мутагена
- Оценка цитогенетического и цитотоксического действия метиленового голубого на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс
- Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ1 (продуктов химической нейтрализации люизита) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей
Введение к работе
Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования - одна из основных задач гигиены окружающей среды [Сычева Л.П., Рахманин Ю.А. и соавт., 2005; Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989; Ревазова Ю.А., Журков B.C., 2001]. Это важно и для прогноза канцерогенной активности факторов, поскольку положительные результаты краткосрочных тестов анализа мутагенной активности химических соединений рассматривают в качестве прогностических показателей наличия у них канцерогенных свойств. Некоторые авторы считают, что генотоксические исследования могут стать альтернативой классическим методам оценки канцерогенной активности [Douglas G.K et al, 1988; Ashby J. et all, 1996]. Исследование канцерогенности одного химического соединения общепринятым методом требует проведения двухлетних дорогостоящих экспериментов, поэтому трудно представить, чтобы такие исследования приобрели массовый, опережающий характер. Подобное положение обязывает признать, что краткосрочные тесты для выявления мутагенных химических веществ играют роль своеобразной «просеивающей» программы для выявления потенциальных канцерогенов.
В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН разработана система оценки мутагенного эффекта факторов окружающей среды с учетом органной специфичности, основой которой является полиорганный микроядерный тест [Сычева Л.П., 2002]. Он позволяет с большей долей вероятности, по сравнению с другими краткосрочными тестами, прогнозировать канцерогенные свойства исследуемого фактора и определять органы-мишени. Однако в этой системе оценка мутагенного эффекта в органах выделительной системы разработана недостаточно. Подобного рода исследования мутагенного действия химических соединений на клетки мочевого пузыря и почек единичны. В то же время установлено, что многие вещества, в том числе ароматические амины, соли тяжелых металлов, хлорорганические соединения индуцируют рак в этих органах. По данным ВОЗ
рак мочевого пузыря по частоте встречаемости среди всех злокачественных новообразований, уступает только опухолям желудка, пищевода, легких и гортани. В мире ежегодно регистрируется около 170 000 - 200000 новых случаев рака мочевого пузыря и среднегодовой темп прироста составляет 3,34% [Чиссов В.И., Старинский В.В., 2002; Borden L.S. et all, 2003].
Установлено, что химические соединения, образующиеся в производственных процессах кожевенной, анилинокрасочной, резиновой, электрокабельной, каучуковой промышленности, а также некоторые лекарственные препараты, обладают генотоксической и канцерогенной активностью в клетках мочевого пузыря человека и лабораторных животных [IARC, 1981; Двойрин В.В. с соавт., 1996; Maltoni С. et all, 1996; Плисе Г.Б., 1996].
Открытие возможности определять генотоксические повреждения в эксфолиативных клетках, полученных неинвазивным способом, позволило использовать микроядра в качестве маркера для выявления ранних канцерогенных изменений в эпителиальных тканях [Stich H.F., Rosin М.Р., 1983; 1984; Rosin MP., 1992; Majer B.J. et all, 2001]. Однако для эксфолиативных уротелиальных клеток человека соответствующие методические основы разработаны недостаточно.
В связи с этим целью исследования являлась оценка микроядерным методом мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы. Для ее достижения сформулированы следующие задачи:
1. Усовершенствовать методы оценки цитогенетического эффекта факторов среды в клетках органов выделительной системы экспериментальных животных и человека.
2. Определить контрольные уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов выделительной системы животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека.
3. Оценить временные и дозовые закономерности действия модельного мутагена на цитогенетические и цитотоксические показатели в клетках мочевого пузыря млекопитающих.
4. Изучить мутагенное действие химических соединений и у-излучения на эпителиальные клетки мочевого пузыря млекопитающих.
Научная новизна. Впервые:
- В оценку цитогенетического эффекта в уротелиальных клетках мочевого пузыря включен новый показатель - доля клеток с ядерными протрузиями. Установлена высокая значимая корреляция этого показателя с микроядрами (0,52 - 0,72; р 0,001).
- В анализ уротелиальных клеток мочевого пузыря включены дополнительные кариологические показатели (частота двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой; клеток с атипичной формой ядра), изменение которых может указывать на цитотоксическое действие исследуемого фактора.
- Разработан и апробирован неинвазивный метод комплексной оценки эксфолиативных уротелиальных клеток человека по цитогенетическим и кариологическим показателям.
- Проведена количественная оценка и определены дозовые параметры цитогенетического и цитотоксического действия на эпителиальные клетки мочевого пузыря мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, метиленового голубого, профлавин ацетата, стронция, цезия, циклофосфамида, продуктов дезактивации химических отходов (люизита, иприта, совтола).
- Определены дозо - временные зависимости цитогенетического эффекта циклофосфамида в клетках мочевого пузыря от длительности воздействия и времени после окончания воздействия.
- Установлены ориентировочные фоновые частоты кариологических показателей в эпителиальных клетках мочевого пузыря у контрольных животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека. Практическая значимость. Применение разрабатываемой методологии
позволяет значительно увеличить объем получаемой информации о цитогенетическом и цитотоксическом действии фактора, повысить надежность качественной и количественной оценки мутагенных свойств химических соединений в экспериментах на млекопитающих и при обследовании людей.
Материалы исследований по корреляции частоты клеток с микроядрами и протрузиями, оценке других кариологических показателей в органах выделительной системы использованы при разработке:
- изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» [заявка № 2005108225, приоритет от 24.03.05];
- методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным [Москва, 2005. - 37с]. Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной
активности использованы при обосновании гигиенических нормативов:
- диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированию МЗиСР РФ РФ [протокол от 28.12.04 г.] [Справка о внедрении №2 от 25.01.05 г.].
- смеси триэтаноламинных солей сульфированных полихлорированных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при пероральном поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ этих соединений в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ [ГН 2.1.5.1316-03].
Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки [Справка о внедрении от 02.02.05г.].
Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН «Разработка методологии оценки мутагенного эффекта в клетках органов дыхательной и выделительной системы», 2003-2005 гг., № госрегистрации 01200303902; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007г., № госрегистрации 01200502722; "Разработка системы методов обоснования и верификации эколого-гигиенических нормативов химических веществ в окружающей среде на основе компьютерного моделирования и экспериментальных исследований", 2003-2005 гг., № госрегистрации 01200303903.
Исследования проведены совместно с лабораториями ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН: комплексного эколого гигиенического нормирования (зав. - д.м.н. О.О.Синицина); гигиены почвы (зав. - к.м.н. И.А.Крятов), питьевого водоснабжения (зав. - д.м.н. Р.И.Михайлова); гигиены атмосферного воздуха (зав. - д.м.н., проф., М.А.Пинигин); цитогистологии (зав. - д.б.н. Н.Н.Беляева); и другими институтами: ГУП МосНПО Радон (рук. группы - д.б.н. А.Н.Осипов); ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ (рук. лаборатории - д.м.н. СМ. Шарова); ГУ НИИ фармакологии (рук. лаборатории - д.м.н., проф., А.Д.Дурнев).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи -объект постоянного внимания В.А.Рязанова» [Москва, 2003]; 2-м съезде токсикологов России [Москва, 2003]; 3-м съезде Вавиловского общества
генетиков и селекционеров [Москва, 2004]; 5-м съезде Российского общества медицинских генетиков [Уфа, 2005]; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" [Суздаль, 2005].
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 156 страницах машинописи, иллюстрирован 43 таблицами и 11 рисунками. Указатель литературы содержит 150 источника, из них 52 отечественных и 98 иностранных авторов. Основные положения, выносимые на защиту
1. Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы (почки, мочевой пузырь) экспериментальных животных и человека.
2. Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта модельного мутагена и канцерогена - циклофосфамида в клетках мочевого пузыря мышей от длительности воздействия, дозы и времени после окончания воздействия.
3. Качественные и количественные параметры цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ (метиленового голубого, профлавин ацетата, диоксида азота, диоксидина, диоксазида), смесей (продуктов нейтрализации люизита, иприта, совтола) при ингаляционном и пероральном воздействии, низких доз у-излучения на клетки органов выделительной системы.
Микроядерный тест на эпителиальных клетках мочевого пузыря экспериментальных животных
Фиксация материала. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, вскрывали, выделяли мочевой пузырь и фиксировали его целиком в 10% растворе формалина с рН 7,0. Длительность фиксации не менее 1 месяца. 10% раствор формалина (4% по формальдегиду) готовили из нейтрального формалина, используя 0,1М фосфатный буфер с рН 7,0. Для приготовления фосфатного буфера использовали следующие растворы: А: 1/10 М КН2Р04, Б: 1/10 М Na2HP04X 12НгО. Фосфатный буфер готовили перед употреблением, смешивая 390 мл раствора А и 610 мл раствора Б.
Приготовление препаратов. Фиксированный в формалине мочевой пузырь промывали в двух сменах водопроводной воды в течение 6 часов. Отмытый от формалина мочевой пузырь помещали в центрифужную пробирку, заливали 1 мл 50% раствора КОН из холодильника. Выдерживали 16 часов при 20С. Щелочь сливали. Мочевой пузырь фиксировали иголками на пенопластовом столике, аккуратно разрезали вдоль и осторожно соскабливали скальпелем клетки слизистой. Полученную кашицу переносили в микропробирку с дистиллированной водой и выдерживали 10-15 мин. Пипетировали, используя пипетку с пластиковым наконечником, до образования мутной суспензии. Центрифугировали 7 мин. при 1500 об/мин. Удаляли надосадочную жидкость, осадок заливали дистиллированной водой (процедуру повторяли 3 раза). Каплю густой суспензии с помощью пипетки наносили на край сухого, тщательно обезжиренного стекла. Мазок делали шлифованным стеклом под углом 45. Густоту расположения клеток контролировали на пробном препарате под микроскопом.
Окрашивание препаратов. Хорошо просушенный препарат погружали на 10 минут в свежеприготовленный фиксатор: смесь этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Высушивали на воздухе. Окрашивали отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина в термостате при 37С в течение 1 часа. Промывали в двух сменах дистиллированной воды. Просушивали на воздухе. Цитоплазму клеток докрашивали 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 1 мин. Промывали в двух сменах дистиллированной воды.
Микроскопический анализ проводили с помощью микроскопа Olympus под иммерсионным объективом при увеличении хЮОО. Анализ проводили на зашифрованных препаратах. Подсчитывали не менее 1000 эпителиальных клеток мочевого пузыря на каждое животное, определяли количество клеток с микроядрами. Эпителий мочевого пузыря является переходным и имеет покровный, промежуточный и базальный слои. На суспензионных препаратах эпителиальные клетки отличаются по размеру в 2 и более раз. Среди них выделяются крупные покровные, более мелкие промежуточные и базальные клетки. Долю клеток с микроядрами определяли при подсчете всех эпителиоцитов суммарно.
Показателем качества препаратов является отсутствие или небольшое количество разрушенных клеток. Большинство клеток лежит отдельно, хорошо расправлены. Ядра бордового цвета, цитоплазма прозрачная зеленовато-голубая.
Результаты исследований заносили в таблицу 2.3.1.1.
Наряду с методикой фиксации клеток мочевого пузыря в формалине нами разработана методика приготовления суспензионных препаратов эпителиальных клеток ex tempore. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации. Выделяли мочевой пузырь, разрезали вдоль, соскабливали эпителиальные клетки слизистой оболочки скальпелем и наносили на предметное стекло в каплю эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки аккуратно распределяли по стеклу.
Окраску препаратов, микроскопический анализ, протокол анализа проводили в соответствии со схемой описанной в главе 2.3.1.1.
Частоту клеток с микроядрами определяли на суспензионных препаратах, приготовленных методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации, вскрывали брюшную полость, выделяли правую почку. Орган помещали в 10% раствор формалина с рН 7,0. Длительность фиксации не менее 2 недель.
Приготовление препаратов. Фиксированное формалином корковое вещество почки механически отделяли от мозгового. Промывали фрагменты коркового вещества в двух сменах водопроводной воды в течение 6 часов. Отмытые от формалина кусочки помещали в центрифужную пробирку, заливали 1 мл 50% раствора КОН из холодильника. Выдерживали 16 часов при 20С. Далее щелочь сливали, а оставшиеся кусочки переносили в микропробирку с дистиллированной водой на 10 - 15 мин. Используя пипетку с пластиковым наконечником пипетировали до образования мутной суспензии, которую затем центрифугировали 7 мин. при при 1500 об/мин. Удаляли надосадочную жидкость, осадок заливали дистиллированной водой (процедуру повторяли 3 раза). Каплю густой суспензии с помощью пипетки наносили на край сухого, тщательно обезжиренного стекла. Мазок делали шлифованным стеклом под углом 45.
Окраску препаратов, микроскопический анализ, протокол анализа проводили в соответствии со схемой,описанной в главе 2.3.1.1.
Приготовление препаратов осуществлялось в соответствии с методическими рекомендациями "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (2001).
Методика приготовления препаратов. Препараты клеток костного мозга готовили в соответствии с Schmid W. (1976) с небольшой модификацией. Мышь умерщвляли методом цервикальной дислокации. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку. Сыворотку набирали в шприц (приблизительно 1 мл), вымывали костный мозг из обеих бедренных костей в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин. в течение 5 минут, супернатант удаляли пипеткой с пластиковым наконечником, осадок осторожно ресуспендировали. Маленькую каплю суспензии помещали на край предметного стекла и делали мазок под углом 45. Высушивали на воздухе. Препараты фиксировали метиловым спиртом в течение 3 минут.
Окрашивание препаратов. Готовили забуференную воду с рН 7,0, добавляя к 1л дистиллированной воды 2,85 мл раствора А (1/15 М КН2Р04) и 2,15 мл раствора Б (1/15 М Na2HP04X 12НгО). Готовый краситель Романовского-Гимзы разводили забуференной водой (рН 7,0) в отношении 1:6. Окрашивали препараты в течение 10 минут. Препараты промывали в двух сменах забуференной воды. Высушивали на воздухе.
Анализ препаратов. Препараты анализировали под микроскопом в проходящем свете с помощью объектива с масляной иммерсией при увеличении хЮОО. Показателем качества мазка является отсутствие поврежденных ядерных клеток. Эритроциты лежат отдельно, хорошо расправлены. Зрелые эритроциты оранжево-красные, полихроматофильные эритроциты (ПХЭ) - серовато-голубые. Микроядра в ПХЭ представляют собой округлой формы гомогенно окрашенные в красновато-фиолетовый цвет хроматиновые тельца. Они не преломляют свет, по размеру не превышают 1/4 диаметра эритроцита. В редких случаях микроядра могут иметь удлиненную или подковообразную форму. Анализ проводили на зашифрованных препаратах. Подсчитывали 1000 ПХЭ на каждое животное, определяли количество ПХЭ с микроядрами. В качестве дополнительного показателя при подсчете 200 эритроцитов определяли долю ПХЭ от общего числа эритроцитов. У контрольных мышей доля ПХЭ составляет приблизительно 50%. Изменение доли ПХЭ при действии вещества свидетельствует о его влиянии на эритропоэз.
Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия и дозы мутагена
Циклофосфамид в дозе 20 мг/кг также приводит к повышению доли клеток с микроядрами, протрузиями, микроядрами и протрузиями суммарно на 7 день введения. Уровни показателей значимо превышали таковые при 3- и 7-кратном введении циклофосфамида в дозе 10 мг/кг (рис.4.1.1).
При увеличении длительности воздействия циклофосфамида в дозе 20 мг/кг указанные показатели резко снижаются. Введение циклофосфамида в этой дозе в течение 14 суток приводило к снижению доли клеток с микроядрами до контрольного уровня, а доли клеток с протрузиями или с микроядрами и протрузиями суммарно были на уровне таковых при дозе циклофосфамида 10 мг/кг. При 21- и 30-кратном воздействиях величина показателей возрастала, достоверно превышая контрольный уровень. Однако на этом сроке воздействия не отмечено статистически достоверных различий между долями клеток с микроядрами при дозах циклофосфамда 10 и 20 мг/кг, но выявлено значимое возрастание доли клеток с протрузиями.
Представляет интерес оценка связи доли клеток с микроядрами и доли клеток с протрузиями у мышей. Поскольку при дозе циклофосфамида 10 мг/кг при анализе всех сроков затравки отмечено слабое возрастание уровней показателей с увеличением длительности воздействия, а после 7-суточного воздействия уровни показателей стабилизировались, проведен отдельно корреляционный анализ для всех групп мышей (5 групп, 30 животных для каждой дозы циклофосфамида и для групп «7-кратное - 30-кратное воздействие» (4 группы, 24 животных для каждой дозы циклофосфамида). Результаты корреляционного анализа приведены в таблице 4.1.4. Отмечается статистически значимая прямая корреляционная связь данных цитогенетических показателей при действии циклофосфамида в дозах 10 и 20 мг/кг, что, вероятно, обусловлено их сходной динамикой при разной длительности затравки мутагеном. Корреляция показателей «частота двуядерных клеток» и «частота клеток с центральной ядерной перетяжкой» рассчитанная в этом эксперименте, составила 0,24 (Р 0,05; N=90).
Корреляционный анализ показал значимую положительную связь доли клеток мочевого пузыря с микроядрами, протрузиями, микроядрами и протрузиями суммарно от дозы циклофосфамида, за исключением доли клеток с микроядрами, микроядрами и протрузиями при 14-кратном и доли клеток с микроядрами при 21-кратном введении мутагена (табл. 4.1.5). Для оценки зависимости «доза мутагена-эффект» проведен регрессионный анализ. Оценена линейная модель: у = а+ Ьх , где х - доза циклофосфамида в мг/кг; у - доля клеток с микроярами в %о; а и b - коэффициенты уравнения.
Линейное уравнение удовлетворительно описывает зависимость изученных показателей от дозы циклофосфамида на всех сроках введения, за исключением тех вариантов, где не выявлена связь эффекта с дозой (доли клеток с микроядрами, с микроядрами и протрузиями при 14-кратном и доли клеток с микроядрами при 21-кратном введении мутагена). Ожидаемый уровень показателей у мышей без введения циклофосфамида при всех сроках воздействия (коэффициент а уравнений) находится в пределах 95% доверительного интервала показателя в контрольной группе мышей.
В параллельном исследовании данного вещества микроядерным методом, проведенном в лаборатории генетического мониторинга Л.П. Сычевой, установлено, что в костном мозге изученные дозы циклофосфамида индуцировали значимое повышение доли ПХЭ с микроядрами по сравнению с контролем во всех группах (табл. 4.1.7). При затравке дозой циклофосфамида 20 мг/кг отмечено значимое превышение доли клеток костного мозга с микроядрами по сравнению с дозой 10 мг/кг. Выявлено возрастание доли клеток костного мозга с микроядрами к 7 дню действия циклофосфамида в дозе 10 мг/кг и к 14 дню действия в дозе 20 мг/кг при последующем снижении эффекта с увеличением длительности действия вещества (рис. 4.1.3), однако эффект сохраняется повышенным на всех изученных сроках воздействия.
Для анализа снижения цитогенетического и цитотоксического эффекта от времени после окончания введения мутагена проведен второй эксперимент с циклофосфамидом. Препарат в дозе 10 мг/кг вводили зондом внутрижелудочно ежедневно в течение 4 дней. Забой животных и фиксацию клеток мочевого пузыря проводили через 24 и 72 часа, 7 и 21 сутки после введения мутагена. Схема эксперимента приведена в таблице 4.2.1. В опыте было 2 контрольных группы: контроль 1 - в начале эксперимента; контроль 2 - в конце эксперимента.
В эксперименте не выявлено статистических различий между контрольными группами по доле клеток с микроядрами, протрузиями и другими кариологическими показателями. Поэтому результаты по каждому показателю объединены в одну контрольную группу, включающую 12 мышей.
Оценка цитогенетического и цитотоксического действия метиленового голубого на эпителиальные клетки мочевого пузыря крыс
Проведены совместные сследования с лабораторией комплексного эколого-гигиенического нормирования (рук.- д.м.н., профессор З.И.Жолдакова). Затравка животных проводилась сотрудниками этой лаборатории. Эксперимент проведен на 36 самцах белых неинбредных крыс, полученных из питомника Крюково, массой 350г. Животные содержались при 12-часовом светом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Было выделено 6 групп по 6 животных, первая группа крыс без воздействия служила контролем. Крысы второй, третьей и четвертой группы получали с водой 0,01, 0,05 и 0,25 мг/кг метиленового голубого соответственно. Растворы вводили внутрижелудочно в течение 4 месяцев ежедневно, кроме двух выходных в неделю. Для разведения метиленового голубого использовали бутылированную воду. Забой животных проводили путем декапитации через 24 часа после последнего введения раствора.
Полученные результаты анализа эпителиальных клеток мочевого пузыря крыс представлены в таблице 5.1.1 ив таблице 2 приложения.
Частота эпителиальных клеток мочевого пузыря с микроядрами в контрольной группе составила 2,17%о и незначительно увеличивалась с дозой препарата до 3,5%о. Доля клеток с протрузиями статистически значимо (%2; Р 0,05) увеличивалась от 7,67%о в контроле до 11,83%о при действии дозы 0,05 мг/кг.
Так же статистически достоверно увеличилась доля клеток с атипичной формой ядра в группах под действием доз 0,05 мг/кг; 0,25 мг/кг. Метиленовый голубой статистически достоверно снижал частоту клеток с ядерными перетяжками при воздействии всех исследуемых доз и долю двуядерных клеток, под действием доз 0,05 мг/кг; 0,25 мг/кг. Увеличение частоты клеток костного мозга с микроядрами в 1,7 раза по сравнению с контролем отмечено при максимальной испытанной дозе метиленового голубого 0,25 мг/кг (таблица 5.1.1).
Таким образом, метиленовый голубой в дозе 0,05 мг/кг, при внутрижелудочном четырехмесячном введении повышал частоту клеток с протрузиями, что указывает на цитогенетический эффект. Повышение доли клеток с атипичной формой ядра в дозах 0,05 и 0,25 мг/кг свидетельствует о цитотоксическом действии препарата. Минимально-действующая доза, вызывающая индукцию ядерных протрузий в клетках мочевого пузыря крыс, соответствовала 0,05 мг/кг метиленового голубого; максимально-недействующая доза - 0,01 мг/кг.
Эксперимент проведен совместно с лабораторией комплексного эколого-гигиенического нормирования (рук. - д.м.н., профессор З.И.Жолдакова) на 36 крысах-самцах массой 250-300г. Силами сотрудников этой лаборатории в течение 1 месяца крыс ежедневно запаивали водой с содержанием профлавин ацетата. Было выделено 6 групп по 6 животных. Первая группа крыс без воздействия служила контролем. Крысы второй, третьей и четвертой группы получали с водой 0,01, 0,05 и 0,25 мг/кг профлавин ацетата соответственно. Для разведения профлавин ацетата использовали бутылированную воду. Растворы вводили внутрижелудочно в течение месяца ежедневно. Забой животных проводили путем декапитации через 24 часа после последнего введения раствора.
Препараты клеток мочевого пузыря готовили по оригинальной методике (глава 2.3.1.2).
Результаты анализа клеток мочевого пузыря крыс представлены в таблице 5.2.1 и в таблице 3 приложения. Средняя частота клеток мочевого пузыря с микроядрами в контрольной группе животных составила 0,33%о. Частота клеток с микроядрами через месяц воздействия профлавина в дозах 0,01; 0,05 и 0,25 мг/кг варьировала от 0 до 0,5%о. Доля клеток с протрузиями в опытных группах варьировала в пределах от 0,67 до 2,17%о и не отличалась достоверно от контроля (2,50%о). В целом можно отметить, что профлавин ацетат не повышал частоту клеток с генетическими повреждениями в мочевом пузыре крыс.
Оценка цитогенетического и цитотоксического эффектов смеси РМ1 (продуктов химической нейтрализации люизита) в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей
Исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории гигиены почвы (рук. к.м.н. Крятов И.А.). Эксперимент поставлен в нашей лаборатории на 48 мышах-самцах (CBAxC57Bl/6)Fl весом 18-20 г, полученных из питомника Столбовая РАМН. Животных содержали в пластиковых клетках, давали стандартный корм и воду. Путем случайной выборки мышей разделили на контрольную и опытные группы.
Смесь РМ1 является продуктом дезактивации люизита ((3-хлорвинилдихлорарсина). ЛД5о РМ1 при внутрижелудочном введении мышам соответствует 390 мг/кг [Русаков Н.В. с соавт., 2003]. В опытных группах животным вводили растворы смеси в таких концентрациях, которые приблизительно соответствовали 1/250; 1/50 и 1/10 ЛД5о- Для РМ1 они составили 1,56; 7,8 и 39 мг/кг. Для разведения использовали дистиллированную воду. Растворы вводили внутрижелудочно зондом из расчета 0,1 мл на 10 г веса мыши ежедневно в течение 7 дней. Забой животных проводили через 24 часа после последнего введения раствора. Приготовление суспензионных препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря (ex tempore) и оценку мутагенного действия смесей осуществляли в соответствии с главой 2.3.1.2. Оценку цитогенетических и цитотоксических показателей проводили при подсчете 1000 эпителиальных клеток мочевого пузыря. Результаты исследования по отдельным животным и в среднем по группам представлены в таблицах 6.1.1 и 9 в приложении. При проведении эксперимента отмечена высокая токсичность смеси РМ1, которая вызвали гибель 11,1% мышей. - Значимое различие с контролем по критерию %2 (Р 0,05)
При тестировании продуктов нейтрализации люизита (РМ1) микроядерным методом на эпителиальных клетках мочевого пузыря установлено, что частота клеток с микроядрами в контроле составляет 0,17%о-Уже при введении 1/250 ЛД5о этого вещества уровень клеток с микроядрами увеличился в 2,3 раза (0,4/00), при введении 1/50 ЛД50 уровень клеток с микроядрами вернулся к контрольному и составил 0,170/00; введение 1/10 ЛД50 вызвало достоверное увеличение спонтанного уровня мутаций в 4,4 раза (0,75/оо).
Установлено, что количество протрузий достоверно отличалось от контроля в группе РМ1, получавшей максимальную дозу смеси соответствующей 1/10 ЛД.50 (критерий х2) Сравнивая такой показатель, как частота двуядерных клеток, можно отметить, что достоверное отличие от контроля имеют две группы (1/250 и 1/50 ЛД5о РМ1), отличающиеся от контроля в 1,7 и 1,9 раз соответственно.
При сравнении количества клеток, имеющих перетяжку ядра, установлено достоверное отличие от контроля только при дозах 1/250 и 1/10 лд
Минимально-действующая доза в мочевом пузыре соответствовала 1/10 ЛД5о (по оценке частоты клеток с протрузиями), максимально-недействующая доза - 1/50 ЛД.50. Повышение частоты двуядерных клеток отмечено при действии минимальной дозы 1/250 ЛД5о и дозы 1/50 ЛД5о РМ1, что косвенно свидетельствует об увеличении пролиферативной активности в мочевом пузыре.
Таким образом, выявлен дозо-зависимый цитогенетический эффект продуктов нейтрализации люизита РМ1.
Частота ПХЭ с микроядрами в контрольной группе составила 1,83%о. Частота ПХЭ с микроядрами в опытных группах животных после 7-кратного введения РМ1 в дозах 1/250; 1/50 ЛД50 и 1/10 ЛД50 была 4,0; 3,5 и 2,75%о, соответственно. Отмечено достоверное приблизительно двукратное увеличение доли клеток с микроядрами при действии 1/250 и 1/50 ЛД50 РМ1 по сравнению с контролем. Не выявлено различий по показателю соотношения нормохромных и полихроматофильных эритроцитов между исследуемыми группами.
В параллельном исследовании на клетках легких, проведенной М.А. Коваленко, статистически достоверное отличие частоты клеток с микроядрами опытных от контрольной групп не выявлено. О цитогенетическом действии данного вещества на клетки легкого свидетельствует значимое повышение клеток с протрузиями.
В составе смеси РМ1 содержится мышьяк, который, как известно, индуцирует хромосомные аберрации и микроядра в клетках костного мозга мышей и крыс, мочевого пузыря человека, разрывы ДНК в клетках легких мышей in vivo [GAP2000; Toxicological profile, 1998].
По данным химического анализа в составе смеси РМ1 до 15,5% составляет ЫагАБОз - соединение, в молекуле которого содержится мышьяк. Наличие мышьяка, по-видимому, и обусловило ее мутагенную активность. Для объяснения механизма мутагенного действия мышьяка существуют две гипотезы. Считают, что он не оказывает повреждающее действие на ДНК прямым способом, однако, как показали некоторые исследования, ингибирует один или несколько ферментов, вовлеченных в репликацию или репарацию ДНК. Согласно другой гипотезе мышьяк замещает фосфат в структуре ДНК. Это подтверждается наблюдениями, что эффект мышьяка проявляется только в том случае, когда он присутствует в клетке в период синтеза ДНК. Эта гипотеза позволяет объяснить значительный цитогенетический эффект препарата и в то же время отсутствие индукции генных мутаций [Toxicological profile, 1998].
