Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Введение 7
1.1. Актуальность проблемы 7
1.2. Цель и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна 9
1.4. Теоретическая и практическая значимость 9
1.5. Положения, выносимые на защиту 10
1.6. Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации 10
1.7. Апробация работы 11
1.8. Публикации 11
1.9. Структура и объем диссертации 12
Глава 2. Обзор литературы 13
2.1.ТрансфекцияМСК 13
2.2. Анализ функции трансфицированных генов 20
2.3. Влияние трансфекции на состояние стволовых клеток (морфология, пролиферация)
2.4. Механизмы регуляции экспрессии трансфицированных генов... 25
2.5. Способы регуляции экспрессии трансфицированных генов 29
2.6. Заключение 32
Глава 3. Материалы и методы исследования 34
3.1. Материалы исследования 34
3.2. Методы исследования 36
Глава 4. Результаты 46
4.1. Мультипотентность и фенотип МСК 46
4.2. Результативность трансфекции 48
4.3. Межкультуральные различия при трансфекции плазмиды с геном VEGF
4.4. Динамика элиминации плазмиды из МСК при липофекции и электропорации 54
4.5. Динамика экспрессии гена VEGF 57
4.6. Анализ метилирования промотора плазмиды 66
Глава 5. Обсуждение 71
Глава 6. Выводы 78
Глава 7. Список литературы 79
- Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации
- Влияние трансфекции на состояние стволовых клеток (морфология, пролиферация)
- Способы регуляции экспрессии трансфицированных генов
- Динамика элиминации плазмиды из МСК при липофекции и электропорации
Введение к работе
Актуальность проблемы
Клеточная терапия с использованием мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека (МСК) считается одним из наиболее перспективных направлений медицины. МСК сейчас используют практически во всех областях медицины: от пластической хирургии до возмещения больших дефектов тканей и органов (Riordan N.H., 2009; Psaltis P.J., 2008; Yoshimura К., 2008; Schaffler А., 2007; Пальцев М.А., 2009).
Использование МСК в регенеративной медицине неслучайно. Эти клетки есть у каждого человека, и их достаточно просто выделить и культивировать. МСК содержатся в костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови и почти во всех органах. При аллотрансплантации МСК относительно неиммуногенны и даже отмечено, что они могут незначительно подавлять иммунный ответ реципиента, что позволяет им длительно выживать после введения для оказания терапевтического эффекта (Le Blanc К., 2004).
Помимо всех выше перечисленных достоинств, МСК экспрессируют широкий спектр цитокинов и факторов роста, которые оказывают паракринные эффекты: осуществляют иммуномодуляцию и трофику (Sadan О., 2009), стимулируют гемопоэз in vitro (Pittenger M.F., 1999; Majumdar M.K., 1998; Парфенова E.B., 2000). Также есть данные, что МСК оказывают проангиогенный эффект, причем у МСК, выделенных из жировой ткани, он выше, чем у МСК из костного мозга (Kim Y., 2007). Кроме того, МСК усиливают неоангиогенез за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки и выделения множества ангиогенных факторов, таких как VEGF, bFGF и ангиопоэтин-1 (Al-Khaldi А., 2003; Lee J.B., 2006; Kaigler D., 2003; Бокерия Л.А., 2006). Все вышеперечисленное позволяет применять МСК для лечения ишемических состояний нижних конечностей и сердца.
Кроме того, есть данные о том, что введение в очаг ишемии генно-инженерных конструкций с факторами ангиогенеза, также может приводить к усиленному росту сосудов, что с успехом используется в комплексной терапии ишемических состояний (Константинов Б.А., 2005; Бочков Н.П., 2006; Бочков Н.П., 2010).
С целью большей стимуляции роста новых сосудов целесообразно совместить оба метода, т.е. трансплантировать МСК, трансфицированные генами ангиогенеза, в частности VEGF. В литературе описаны положительные примеры такого подхода. Наиболее безопасными методами трансфекции являются невирусные методы -липофекция и электропорация, так как лишены многих побочных эффектов вирусных методов (инсерционный мутагенез, иммунологические осложнения). В отношении трансфекции МСК имеются противоречивые сведения об эффективности невирусных
методов и о степени повышения уровня экспрессии трансгена. С целью разработки оптимальных протоколов трансфекции необходимо проведение серии экспериментов с использованием плазмиды с геном VEGF.
Цель и задачи исследования
Цель работы - оценка результативности трансфекции, динамики элиминации плазмиды с геном VEGF и экспрессии введенного гена в МСК человека двумя невирусными методами - липофекцией и электропорацией.
Задачи исследования:
Оценить результативность трансфекции и динамику элиминации плазмид в различных культурах МСК, трансфицированных липофекцией и электропорацией.
Охарактеризовать липофекцию и электропорацию по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.
Оценить уровни экспрессии гена VEGF в нетрансфицированных и трансфицированных обоими методами клетках.
Оценить уровень метилирования CMV-промотора введенной генетической конструкции.
Научная новизна
В настоящем исследовании проведена трансфекция плазмиды с геном VEGF. В работе показано, что результативность невирусных методов при трансфекции этой плазмиды в МСК не различается.
В работе выявлены культуральные различия в результативности трансфекции, динамике элиминации плазмид из клеток и в уровнях экспрессии гена VEGF как в трансфицированных, так и в нетрансфицированных клетках.
Впервые исследовано метилирование при транзиентной трансфекции МСК. Показано, что метилирование не вносит существенный вклад в снижение уровня экспрессии гена вводимой плазмиды.
Учитывая малоэффективные попытки лечения ишемических состояний с помощью МСК и генной терапии с использованием генно-инженерных конструкций с факторами ангиогенеза, проведена попытка разработки оптимальных условий трансфекции и дальнейшей трансплантации трансфицированных культур в ишемизированные ткани, необходимой для лучшей реваскуляризации ткани при клеточной терапии. В ходе работы определены наиболее эффективные подходы в трансфекции МСК плазмидой с геном VEGF.
Практическая значимость
Работа представляется базисной, направленной на оценку результативности невирусных методов трансфекции МСК. Результаты работы указывают на необходимость разработки подходов к уменьшению вариабельности результативности трансфекции МСК. Результаты работы необходимы для дальнейшего применения трансфицированных клеток в клеточной терапии, включая лечение ишемических состояний нижних конечностей.
Положения, выносимые на защиту
Между культурами МСК обнаружены индивидуальные различия в результативности трансфекции и динамике элиминации плазмид из клеток.
Определена динамика элиминации плазмид после липофекпии и электропорации. Оба метода не отличаются друг от друга по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.
После трансфекции уровень экспрессии гена VEGF повышается в половине культур к 9-му дню.
Метилирование промотора плазмиды не оказывает существенного влияния на уровень экспрессии VEGF.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых при МГНЦ РАМН (Москва, 2009 г.), на конференции Stem Cells Europe (Эдинбург, 2009 г.), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010 г.), лабораторных и межлабораторных семинарах. Апробация проведена на базе МГНЦ РАМН 16 февраля 2011 года.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации
Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН. Автор проводил дифференцировку МСК в адипогенном и остеогенном направлении, трансфекцию, выделение образцов ДНК и РНК, анализ с помощью ПЦР в реальном времени, подготовку образцов к секвенированию, все расчеты и статистическую обработку полученных результатов. Автор участвовал в оптимизации всех методов трансфекции МСК, подборе праймеров для ПЦР, иммунофенотипировании МСК. Автор сформулировала выводы и опубликовала статьи, отражающие основные результаты диссертационной работы.
Публикации
Работа отражена в 6-ти печатных работах - 4 статьи и 2 тезисов в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.
Внедрение результатов работы в клиническую практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН. Полученные результаты используются при разработке протоколов транзиентной трансфекции мультипотентных стромальных клеток человека с целью получения ткане-инженерных конструкций.
Структура и объем диссертации
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации
Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН. Автор проводил дифференцировку МСК в адипогенном и остеогенном направлении, трансфекцию, выделение образцов ДНК и РНК, анализ с помощью ПЦР в реальном времени, подготовку образцов к секвенированию, все расчеты и статистическую обработку полученных результатов. Автор участвовал в оптимизации всех методов трансфекции МСК, подборе праймеров для ПЦР, иммунофенотипировании МСК. Смирнихина С.А. сформулировала выводы и опубликовала статьи, отражающие основные результаты диссертационной работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых при МГНЦ РАМН (Москва, 2009 г.), на конференции Stem Cells Europe (Эдинбург, 2009 г.), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010 г.). Апробация была проведена на базе МГНЦ РАМН 16 февраля 2011 года. Работа отражена в 6-ти печатных работах - 4 статьи и 2 тезисов в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России соискателям ученой степени кандидата медицинских наук. 1. Смирнихина С. А., Лавров А. В. Методы оценки метилирования остатков цитозина в ДНК // Молекулярная биология. - 2009. - Т. 43, №3. -С. 387-391. 2. Смирнихина С. А., Лавров А. В. Оценка метилирования трансфицированной в мезенхимные стволовые клетки человека плазмиды с геном VEGF121 II Медицинская генетика (тезисы докладов молодых ученых). - 2009. - Т. 8, № 12. - С. 31. 3.
Смирнихина С. А., Лавров А. В. Эффективность электропорации и динамика элиминации плазмиды после трансфекции МСК человека // Медицинская генетика (материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков). - 2010. - С. 167. 4. Лавров А. В., Смирнихина С. А. Гетерогенность ядер и пролиферативный потенциал МСК-подобных клеток в культуре стромально-васкулярной фракции жировой ткани // Цитология. — 2010. — Т. 52, №8. -С. 616-620. 5. Смирнихина С. А. Экспрессия генов, трансфицированных в мезенхимные стволовые клетки человека // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2010. - Т.5, № 4. - С. 16-23. 6. Смирнихина С. А., Лавров А. В., Бочков Н. П. Динамика элиминации плазмид и экспрессии гена VEGF121, трансфицированного в МСК человека разными методами // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2011.- №1. — С. 17-21. Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, выводов, обсуждения и списка литературы (141 источник, в том числе 12 в отечественных изданиях). Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 15 рисунками. Несмотря на положительный терапевтический эффект МСК, введенных в организм, всегда желательно его усилить. Одним из методов для этого является трансфекция, то есть введение в клетку генетического материала, способного экспрессироваться, то есть трансфекция необходима как элемент генной и клеточной терапии. Трансфекция известна еще с середины 60-х годов; тогда ее начали применять для трансформации бактериальных клеток [Spizizen J., Reilly В. Е., Evans А. Н., 1966; Tichy P., Rytir V., Kohoutova М., 1968]. В это же время стали изучать мультипотентные клетки из костного мозга [Cudkowicz G. et al, 1964]. Тогда их рассматривали как прогениторные гемопоэтические клетки, поэтому в литературе можно встретить публикации по трансфекции этих клеток. Трансфекция же мезенхимных стволовых клеток началась лишь в конце 90-х [Allay J. A. et al, 1997; Riew K.D. etal, 1998]. Существуют три основные задачи, которые можно достичь путем трансфекции МСК: добиться дифференцировки МСК в определенные клетки; получить культуру с гиперэкспрессией какого-либо полезного для лечения заболевания гена (фактора роста, ангиогенеза, цитокина и т.п.); обеспечить экспрессию генов, повышающих выживаемость МСК, трансплантируемых зачастую в поврежденные, затронутые воспалением ткани, находящиеся в состоянии гипоксии. Наиболее применимым является трансфекция МСК с целью дальнейшей дифференцировки их в определенную линию. Дифференцировки можно добиться и путем простого культивирования с определенными факторами, однако при трансфекции МСК дифференцируются быстрее и более эффективно. Кроме того, генетическая модификация позволяет дифференцировать клетки в такие узкоспециализированные линии клеток, которые невозможно получить путем культивирования с различными химическими соединениями. Описано много примеров дифференцировки МСК in vitro, при которой получают культуру клеток с заданными свойствами, пригодных для трансплантации в поврежденный орган [Dong S. W. et al, 2009; Kang Y. et al, 2007; Sheyn D. et al, 2008]. В то же время, есть данные и о дифференцировке МСК in vivo. Например, после трансфекции МСК геном Osx (остерикса), их трансплантируют лабораторным животным. Дифференцировка происходит уже in vivo. Указывается 85%-ная эффективность такого подхода для лечения повреждений свода черепа у мышей [Tu Q. et al, 2007].
Влияние трансфекции на состояние стволовых клеток (морфология, пролиферация)
Существует 2 вида трансфекции: стабильная (длительная) и транзиторная (транзиентная, временная). Основное их отличие состоит в том, что при стабильной трансфекции длительность гиперэкспрессии измеряется месяцами (до полугода), а при транзиторной трансфекции гиперэкспрессия трансгена существует недолго - от 7-ми до 21 дней (в зависимости от типа клеток, генетической конструкции и метода трансфекции).
Meyerrose et al. показали, что при трансфекции МСК ретровирусным носителем экспрессия целевого гена длится до 75 дней [Meyerrose Т. Е. et al, 2007]. При использовании лентивирусного вектора с eGFP количество экспрессирующих клеток не уменьшилось даже через 5,5 месяцев после трансфекции (на 3-ий день было 76% позитивных клеток, через 5,5 месяцев - 87,9%). Экспрессия, определенная измерением флюоресценции, за это время лишь незначительно снизилась [Zhang X. Y. et al, 2002]. Данные примеры отражают стабильную трансфекцию МСК.
Как уже было отмечено ранее, аденовирусный вектор обеспечивает временную трансфекцию. При введении вектора с геном VEGF165 в МСК пик экспрессии пришелся на 7-ой день (35%), длительность же составила 14 дней [Gao F. et al, 2007]. При использовании вектора с геном eGFP пик флюоресцентных клеток пришелся на 4-ый день после трансфекции (65%). Начиная с 16 и до 24 дня уровень GFP-позитивных клеток сильно упал (до 2%), к 32-му дню только в 0,5%) клеток экспрессировался ген GFP [Stender S. et al, 2007]. Palmer с коллегами наблюдал 80%-ную эффективность и длительность экспрессии 21 день с использованием аденовирусного вектора с геном TGF-/31 (хондрогенного фактора) [Palmer G. D. et al, 2005]. При трансфекции гена HSVlk (тимидинкиназы) в МСК пик трансфекции пришелся на 24 часа после нее, после чего начал медленно снижаться. Через месяц экспрессия трансгена не отличалась от контрольной нетрансфицированной группы МСК [Roelants V. et al, 2008].
Липофекция, как и аденовирусный вектор, позволяет лишь временно трансфицировать клетки. Длительность экспрессии при этом методе примерно такая же. В исследовании Yang et al МСК трансфицировали eGFP геном HlF-la (фактором индуцируемом гипоксией). Слабую флюоресценцию увидели через 12 часов, через 24 часа появилась интенсивная флюоресценция, пик ее пришелся на 72 часа, длилась интенсивная флюоресценция 1 неделю, после чего стала снижаться [Yang J. et al, 2009]. При использовании аналогичной плазмиды другие исследователи наблюдали флюоресценцию 14 дней [Bosch P. et al, 2006]. При липофекции МСК плазмиды, содержащей кДНК фактора роста соединительной ткани, получено увеличение экспрессии этого гена в 7,5 раз, по сравнению с контролем [Wang J. J. et al, 2009].
В отдельных работах продемонстрирована возможность получения с помощью липофекции стабильно трансфицированных МСК. В стабильно трансфицированных МСК (линия HFCL) конструкцией с колониестимулирующим фактором (pIRESlneo/hGM-CSF) оценили интеграцию, транскрипцию и экспрессию трансгена, подтвердив не только успешную стабильную трансфекцию, но и продукцию биологически активного белка в клеточном супернатанте [Ma L. et al., 2000].
При использовании нуклеофектора отмечено, что пик экспрессии DsRed приходится на 4-ый день после трансфекции, далее наблюдается медленное снижение, а после 14 дня резкое снижение экспрессии до 21 дня [Baksh D. et al, 2007]. В другом исследовании с геном GFP показано, что даже после сортировки трансфицированных клеток через 2 недели только 25% экспрессируют ген-репортер, а через 3 недели - 10% [Haleem-Smith Н. etal, 2005].
Тип трансфекции помимо генетической конструкции определяется еще и наличием селекции или сортировки. Сортировку проводят с использованием специальных приборов - сортеров. При этом отбираются только трансфицированные клетки, далее такую линию культивируют. Селекцию же проводят при помощи антибиотика (например, G418), к которому невосприимчивы плазмиды, несущие ген устойчивости. При этом клетки без генетической конструкции погибают. Эти методы позволяют добиваться стабильной трансфекции даже при использовании плазмид [Ronsyn М. W. et al, 2007].
У каждого вида трансфекции есть свои плюсы и минусы. Так, для стабильной трансфекции плюсом является то, что можно создать клеточную культуру, стабильно экспрессирующую какой-либо фактор.
После трансплантации клеток это позволит в течение длительного времени рассчитывать на терапевтический эффект.
Способы регуляции экспрессии трансфицированных генов
Доказано, что эпигенетические процессы потенциально обратимы с помощью фармакологических препаратов — деметилирующих агентов и ингибиторов гистоновых деацетилаз.
Наиболее известным препаратом первой группы является 5 азацитидин (5-аза-С), первоначально разработанный как нуклеозидный антиметаболит для острой миелоидной лейкемии [Krishnan М. et al, 2005].
Позднее его использовали в лечении рака и талассемии [Bartoli A. et al, 2003]. Сейчас азацитидин (видаза) рекомендован FDA для лечения миелодиспластического синдрома (http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/050794s011 lbl.pdf). Биохимически 5-аза-С — аналог цитозина, который встраивается во вновь синтезированную ДНК на место деоксицитидина и формирует ковалентные связи с ДНК-метилтрансферазой [Jones P. A., Taylor S. М., 1980]. Это взаимодействие ведет к прогрессивному истощению функции ДНК-метилтрансферазы в клетке из-за глубокого гиперметилирования после нескольких туров репликации ДНК. При этом геном может оказаться гипометилирован. Данный препарат очень токсичен и обладает потенциальным канцерогенным действием.
Во многих исследованиях доказана положительная роль 5-аза-С на экспрессию трансфицированных генов. Так как метилирование ДНК больше характерно для стабильной трансфекции, то большинство исследований проведено с использованием ленти- и ретровирусных векторов. Так, Krishnan М. et. al. проводили оценку эффективности 5-аза-С в отношении экспрессии гена Flue на крысиных кардиомиобластах. Результаты показали, что экспрессия постепенно снижалась в течение 8 месяцев. С помощью 5-аза-С экспрессию гена удалось значительно увеличить [Krishnan М. et al, 2005]. При стабильной трансфекции мышиных эмбриональных клеток карциномы также доказано, что 5-аза-С ведет к увеличению экспрессии «молчащих» клеточных линий. Показана положительная корреляция дозы препарата и уровня экспрессии [Не J. et al, 2005].
Кроме того, были проведены исследования и in vivo. При введении стабильно трансфицированных клеток U937 мышам ученые наблюдали снижение экспрессии трансгенов — бета-галактозидазы и тимидинкиназы. После применения 5-аза-С уровень экспрессии существенно вырос [Di larmi М. et al, 1999]. Также было проведено похожее исследование с использованием такого же вектора, но введенного в фибробласты мыши [Hoeben R. С. et al, 1991]. Результаты обоих исследований похожи, что говорит об одних и тех же механизмах молчания ретровирусов в разных типах клеток.
Как уже отмечалось выше, не только метилирование ДНК играет важную роль в молчании гена-репортера, деацетилирование также оказывает большое влияние. Трихостатин А (ТСА) - это антибиотик, ингибирующий ферменты деацетилирования гистонов, что приводит к ослаблению компактной суперспирали хроматина, открывая доступ белкам регуляторам транскрипции к промоторному региону для построения ДНК [FinninM. S. etal, 1999].
Существует множество примеров эффективности данных препаратов в увеличении уровня экспрессии трансгенов. Одно из таких исследований было проведено Bartoli A. et al. на основе ретровирусного вектора с генами-репортерами тимидинкиназы вируса простого герпеса и бета-галактозидазы E.coli, вводимых в линию клеток U937. Они достоверно доказали восстановление экспрессии гена бета-галактозидазы в течение 48 часов после применения ТСА in vitro. Реактивация экспрессии носила дозозависимый характер [Bartoli A. et al, 2003]. В другом исследовании также показано, что применение ТСА существенно повышает экспрессию трансфицированного гена [Gaetano С. et al, 2000].
Выше было описано, как взаимосвязаны метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. По этой причине часто проводят комбинированное воздействие деметилирующим агентом и ингибитором гистоновых деацетилаз для увеличения экспрессии трансфицированного гена. Так, применение ТСА в комбинации с 5-азаС поддерживает экспрессию стабильно трансфицированного гена более чем на 90 дней в клонах клеток U937 [Bartoli A. et al, 2003]. Это еще раз показывает, что все эпигенетические процессы в клетке взаимодействуют.
Несмотря на всю эффективность данных препаратов, их польза нивелируется нестабильностью и токсичностью при пероральном введении, а также, как выше было отмечено, возможным канцерогенным действие 5-аза-С. Поэтому эти вещества используют в основном для исследовательских целей. Однако для увеличения экспрессии трансгенов до сих пор продолжаются поиски веществ, обладающих меньшей токсичностью. Так, был предложен аналог цитозина — зебуларин [Cheng J. С. et al, 2003]. Но его использование также ограничено, как и его предшественников.
Помимо прямого токсического действия на клетки, показано, что 5-аза-С приводит к дифференцировке стромальных клеток костного мозга в кардиомиоциты [Makino S. et al, 1999; Цыб А. Ф. с соавт., 2009], гепатоциты [Yamazaki S. et al, 2003] и нейрональные клетки [Kohyama J. et al, 2001].
Суммируя известные сведения о способах регуляции экспрессии, можно отметить, что есть эффективные меры борьбы с сайленсингом трансгенов, которые приводят к повышению экспрессии целевых генов in vitro и in vivo. Однако токсичность, канцерогенное действие и потенциальное изменение морфологии МСК ограничивает их применение в клинических целях.
Динамика элиминации плазмиды из МСК при липофекции и электропорации
С течением времени плазмида элиминируется из клеток в соответствии с предположением о существования быстро и медленно элиминирующих культур МСК. Однако даже на 9-ый день после липофекции плазмида обнаруживается во всех культурах, в некоторых даже на сопоставимом уровне с 1-ым днем.
При электропорации отмечены большие колебания в результативности трансфекции от 0,39 до 5,14 о.е. По этому показателю культура МСК-5 достоверно отличается от культур МСК-2 и МСК-6 (рис. 11).
В динамике элиминации прослеживаются культуры быстро и медленно элиминирующие плазмиды, однако элиминация происходит более быстрыми темпами, по сравнению с элиминацией при липофекции. К 9-му дню в двух культурах из пяти (МСК-2 и МСК-5) плазмида не обнаруживается.
Все культуры, кроме МСК-5, ведут себя примерно одинаково при липофекции и электропорации, то есть трансфицируются с похожей результативностью и элиминируют плазмиду схожими темпами. Лишь культура МСК-5 продемонстрировала различную элиминацию: при липофекции содержание плазмид на 9-ый день составило 1,25 о.е., при электропорации плазмида в клетках к этому сроку не обнаруживалась.
Таким образом, несмотря на явные различия культур между собой, при трансфекции каждая культура практически не демонстрирует различий в результативности и элиминации плазмиды при трансфекции разными методами.
Все культуры по каждому виду трансфекции представляли собой однородные группы, что позволило нам их объединять. Обобщенные данные отражены на рис. 12. Количество плазмид в трансфицированных клетках достоверно снижается к 3-му дню как при электропорации, так и при липофекции, далее содержание плазмид не различается.
Содержание плазмид в трансфицированных клетках во все сроки достоверно (р 0,05) выше контрольных значений и не зависит от метода трансфекции.
Как видно на гистограмме, по совокупным данным липофекция и электропорация не отличаются друг от друга ни в один из сроков после трансфекции. То есть результативность и динамика элиминации плазмид при использовании обоих методов сопоставима. Однако если принимать во внимание только средние показатели содержания плазмид в клетках по каждому дню, то можно отметить, что показатель результативности при электропорации чуть выше, а элиминация происходит более быстрыми темпами. Но это не подтверждается статистически. Для подтверждения этого заключения необходимо проводить дополнительные исследования по трансфекции МСК.
Полученные данные свидетельствуют о том, что липофекция и электропорация не отличаются друг от друга по результативности и динамике элиминации плазмид ни в каждой культуре отдельно, ни по совокупным данным. Темпы элиминации плазмиды после электропорации немного выше, чем при липофекции. Каждая культура МСК при липофекции и электропорации «ведет» себя схожим образом.
Ген эндотелиального фактора роста сосудов в норме присутствует в геноме человека и экспрессируется. Такая экспрессия является базовой или контрольной. Генетическая конструкция с этим же геном должна была создать трансфицированные клетки с гиперэкспрессией VEGF, поэтому в этом исследовании мы проводили сравнение уровней экспрессии трансфицированных и нетрансфицированных культур. Данные по экспрессии VEGF в культуре МСК-1 представлены в табл. 4.
