Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Спонтанный уровень СХО в клетках человека 7
1.2. Сестринские хроматидные обмены при изучении проблем химического мутагенеза 16
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 22
2.1. Методика культивирования лимфоцитов и приготовление препаратов хромосом 22
2.2. Метод дифференциальной окраски сестринских хрома-тид 23
2.3. Анализ метафаз, учет сестринских хроматидных обменов. 24
2.4. Характеристика мутагена, метод обработки культур 26
2.5. Методы статистического анализа 29
3. ДИНАМИКА СПОНТАННОГО УРОВНЯ СЕСТРИНСКИХ ХРОМАТИДНЫХ ОБМЕНОВ
31
3.1. Введение 31
3.2. Общая характеристика спонтанного уровня СХО . .. 32
3.3. Влияние разных сроков экспозиции БДУ при постоянном времени фиксации на спонтанный уровень СХО 43
3.4. Уровень СХО при постоянной экспозиции БДУ и разных сроках культивирования 44
4. ДИНАМИКА ХИМИЧЕСКИ ИНДУЦИРОВАННЫХ СЕСТРИНСКИХ ХРОМАТИДНЫХ ОБМЕНОВ
52
4.1. Зависимость частоты СХО от срока экспозиции БДУ при разных концентрациях тиофосфамида 52
4.2. Зависимость индуцированных тиофосфамидом СХО от времени фиксации культуры 60
4.3. Зависимость частоты СХО от времени введения БДУ и сроков фиксации культуры 67
5. ОБСУЖДЕНИЕ 76
ВЫВОДЫ 87
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 88
- Спонтанный уровень СХО в клетках человека
- Методика культивирования лимфоцитов и приготовление препаратов хромосом
- Общая характеристика спонтанного уровня СХО .
- Зависимость частоты СХО от срока экспозиции БДУ при разных концентрациях тиофосфамида
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интенсивное использование химических веществ (в производстве, медицине, сельском хозяйстве, быту и других сферах жизни человека) может представлять потенциальную генетическую опасность для человечества. В связи с этим одной из важных задач медицинской генетики является изучение подходов к предупреждению возможных генетических последствий применения различных продуктов химии, а также влияния других факторов внешней среды. Главное при этом - выбор адекватного метода, позволяющего выявлять с большой вероятностью влияние мутагенов на генетический аппарат человека.
Метод учёта сестринских хроматидных обменов (СХО) относится к чувствительным методам, разрешающая способность которого значительно выше, чем у метода учёта хромосомных аберраций. "Спонтанные" СХО возникают почти в каждой клетке. Число их выше числа хромосомных аберраций, и это даёт предпосылки для более точной оценки слабых мутагенных эффектов.
Анализ опубликованных данных по спонтанному уровню СХО в культуре лимфоцитов человека не позволяет выявить факторы, влияющие на его колебания. Они могут быть обусловлены индивидуальными различиями, условиями культивирования, в том числе концентрацией 5-бромдезоксиуридина(БДУ) и другими факторами. Вместе с тем, даже при использовании одних и тех же концентраций БДУ, спонтанный уровень СХО в работах разных авторов колеблется от 5,29 до 10,88 на клетку (Sandberg А., 1982). Более того, даже у одних и тех же авторов, специально изучавших спонтанный уровень СХО, оценки его различаются в разных _4 -работах ( Morgan W.E., Orossen Р.Е., 1977, 1981).
Как показали специальные исследования колебаний спонтанного уровня СХО у разных индивидов, эта величина довольно сильно варьирует (GebhartE., 1981; Morgan W.F., Crossen F.E., 1977, 1981). Неясно, что определяет этот размах? Либо уровень СХО полностью обусловлен внутренними для каждого индивида факторами, либо на его величину влияют неучтенные воздействия среды. Если определенная доля СХО обусловливается средовыми факторами, то неясно, каков вклад её в общий "спонтанный" уровень СХО.
Было показано (Чеботарёв А.Н., Селезнева Т.Г., 1982), что для изучения динамики частот индуцированных СХО адекватной системой являются эксперименты in vitro. Продемонстрировано, что в такой системе можно моделировать условия не только однократной, но и хронической обработки, что в определенной мере отражает процессы внешнесредового мутагенного воздействия.
Для выявления индуцированного уровня СХО необходимо прохождение одного "S" -периода ( Wolf et el.,. 1975). Это положение свидетельствует о том, что проявление индуцированного уровня СХО связано с фазой клеточного цикла, в период которой действуют мутагенные факторы. Можно предположить, что наблюдаемый спонтанный уровень является, по существу, суммой истинного спонтанного уровня индивида и уровня СХО, индуцируемого различными факторами внешней среды, как бытового так и производственного характера. Не исключена возможность, что воздействие сильными химическими мутагенами на лимфоциты периферической крови человека in vitro имитирует вторую компоненту спонтанного уровня, но с более высокими количественными проявлениями эффекта. Эти факторы необходимо учитывать в анализе причин, влияющих на динамику спонтанных и индуцированных СХО, для чего целесообразно параллельное их - 5 -рассмотрение в делящихся лимфоцитах человека.
Целью настоящей работы являлось: изучение количественных закономерностей динамики спонтанных и индуцированных СХО в ряду клеточных поколений лимфоцитов периферической крови человека.
Конкретные задачи исследования были следующими.
Выяснить зависимость числа спонтанных и индуцированных тиофосфамидом СХО от сроков введения БДУ в культуру.
Изучить влияние экспозиции 5-бромдезоксиуридина на уровень спонтанных и индуцированных СХО в культуре.
Определить зависимость числа спонтанных и индуцированных СХО от времени культивирования.
Исследовать межиндивидуальные вариации спонтанного уровня СХО и среднего числа клеточных делений.
Научная новизна и практическая ценность. Получены новые данные о закономерностях динамики сестринских хроматидных обменов в ряду клеточных поколений лимфоцитов периферической крови человека. Показано, что основным фактором, влияющим на спонтанный уровень СХО, является интервал времени между началом культивирования и временем добавления БДУ; с увеличением продолжительности этого интервала уровень СХО снижается. Доказано, что при условии раннего введения БДУ (до 24 часа от начала культивирования) длительность его присутствия в культуре не влияет на исходный спонтанный уровень, т.е. уровень СХО на одну клетку постоянен для быстро и медленно делящихся клеток.
Обосновано положение о том, что при позднем введении БДУ (60 - 72 часа) выявляется истинно спонтанный уровень СХО, присущий данному индивиду. Доказана необходимость раннего введения БДУ для регистрации максимального уровня химически индуцированных СХО.
Прослежена динамика уровня СХО, индуцированного тиофосфами-дом в зависимости от концентрации, а также от времени введения БДУ и экспозиции его в культуре. При этом показано, что с увеличением срока от начала стимуляции лимфоцитов ФГА и введением БДУ" (спустя одно клеточное деление), индуцированный мутагеном уровень СХО снижается, приближаясь к контрольному уровню.
Получены доказательства о нормальном распределении здоровых индивидов по истинно спонтанному уровню СХО на клетку.
Полученные результаты и сделанные на их основе выводы позволяют повысить уровень исследований в токсикологической практике с применением методов цитологического анализа.
Спонтанный уровень СХО в клетках человека
Обмены участками между двумя сестринскими хроматидами одной хромосомы получили название сестринских хроматидных обменов (СХО). Первое чёткое цитологическое обнаружение сестринских хроматидных обменов принадлежит Тейлору ( Taylor J.H. et ai.,I957; Taylor J.H. , 1958). При изучении радиоавтографов хромосом Vicia f aba после культивирования клеток в присутствии Н -тимидина только в течение первого цикла репликации в метафазе второго клеточного деления метка выявлялась в одной из хроматид каждой хромосомы. Одновременно Тейлор обратил внимание на то, что между сестринскими хроматидами возможны полные обмены хромосомным материалом, названные сестринскими хроматидными обменами.
Вслед за Тейлором СХО были описаны на большом количестве различных растительных и животных объектов (Захаров А.Ф., 1976; Landberg,1982), и этот феномен стал рассматриваться как типичное явление для хромосом эукариот.
В 1967 г. Huang ( Huang, 1967), изучая повреждающее действие 5-бромдезоксиуридина на клетки Rattus nataiensis обратил внимание на необычный вид отдельных хромосом в некоторых клетках. После инкубации клеток в культуральной среде с БДУ в течение 26 часов одна из хроматид хромосомы могла выглядеть светлее другой. Однако объяснение это явление тогда не получило.
Современный период изучения сестринских хроматидных обменов начался с открытия А.Ф.Захаровым и Н. Еголиной возможности различать сестринские хроматиды, используя для маркирования реп - 8 -лицирующейся ДНК немеченный 5-броидезоксиуридин ( Zakharov А.Р., Egoiina, 1972). Основываясь на данных о том, что включение БДУ в хромосому проявляется в задержке её конденсации, в работе на клетках китайского хомячка авторы предположили, что в присутствие БДУ в двух последовнтельных циклах репликации эффект задержки конденсации должен быть выражен сильнее в одной из хроматид. Это предположение было экспериментально подтверждено. Между неодинаково, окрашенными хроматидами авторы обнаружили чёткие обмены.
В дальнейшем были предложены различные модификации метода, направленные на улучшение цитологических способов обнаружения бромированной ДНК в хромосомах (Latt, 1973; Dutriilaux et ai., 1974; Чеботарев с соавт., 1978). Так, Латт ( Latt,I973) предложил дифференциально окрашивать сестринские хроматиды, применяя новый флюорохром - производное дибензимидазола Hoedns 1-33258. Независимо от исследования Латта, для различения включивших бром сестринских хроматид был предложен другой флюорохром - акридиновый оранжевый (Dutriilaux, 1974). Чеботаревым, Селезневой и Платоновой (1978) предложена методика с применением акридина оранжевого и красителя Гимза, которая позволяет различать не только слабую и интенсивную, но и промежуточную интенсивность окраски хроматид. Таким образом, цитогенетики имеют достаточно чёткие методы для выявления межхроматидных обменов.
Методика культивирования лимфоцитов и приготовление препаратов хромосом
Бее эксперименты проводили с использованием культуры лимфоцитов периферической крови человека. Лимфоциты культивировали по общепринятой методике Хангерфорда (Hungerford, 1965) с некоторыми модификациями (Н.П. Бочков, Н.П. Кулешов, 1971).
Кровь брали из локтевой вены шприцем с гепарином "Рихтер" (из расчета 20 ед. на 10 мл крови) непосредственно перед началом эксперимента.
Культуральная смесь состояла из следующих компонентов: одна часть цельной крови, три части сыворотки крупного рогатого скота, двенадцать частей среды Игла. Фитогемагглютинин "Р" фирмы Difco (ФГА) вводили из расчета 0,02 мл на 10 мл культураль-ной смеси. Культивировали во флаконах или в пробирках объемом 20 мл в термостате при температуре 37С.
За 2 часа до фиксации в каждую пробирку или флакон вводили колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Перед центрифугированием суспензию клеток взбалтывали и переливали в центрифужные пробирки. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин на центрифуге ЦЖ-І, затем удаляли надосадочную жидкость, оставляя в пробирке I мл с осадком. Клетки в осадке ресуспенди-ровали, приливали 6 мл 0,55-процентного гипотонического раствора KCI, нагретого до 37С. Клетки гипотонизировали в течение 7 минут, затем вновь осаждали при тех же параметрах центрифугирования, удаляли надосадочную жидкость. Клеточную суспензию ресус-пендировали и приливали фиксатор, представляющий смесь метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Фиксатор меняли не менее трех раз. Клетки в фиксаторе могли храниться в течение нескольких дней. Непосредственно перед приготовлением препаратов производили ещё одну смену фиксатора. После центрифугирования супернатант удаляли, оставляя 0,5 - 0,7 мл фиксатора с клетками. Клетки ресуспендировали и 6 - 8 капель суспензии наносили на влажное обезжиренное охлажденное предметное стекло, которое высушивали на воздухе. Препараты перед окраской выдерживали в термостате в течение 24 часов.
Общая характеристика спонтанного уровня СХО
Обследовали группу практически здоровых индивидов (27 женщин и 23 мужчины) в возрасте от 2 до 54 лет. Средний возраст обследованных был 28,3 года (табл. 2).
Лимфоциты крови культивировали в течение 96 часов; за 28 часов до фиксации в культуральную смесь вводили БДУ.
У каждого индивида в зависимости от количества метафаз на стекле анализировали от 87 до 199 клеток 1-го, 2-го и 3-го митозов для определения скорости клеточного деления, из них 50 клеток 2-го митоза учитывалось для расчета среднего числа СХО на клетку.
Для определения закона распределения клеток по числу в них СХО у одного из индивидов проанализировано дополнительно 750 клеток.
В табл. 3 представлены данные по оценке частоты СХО у 50 индивидов, а также данные по среднему числу клеточных делений, отражающие пролиферативную активность культур клеток.
Как видно из таблицы, значения среднего числа СХО для разных индивидов находятся в пределах от 4,58 до 8,94на клетку (при средней 6,525+0,135). Учитывая, что асимметрия и эксцесс незначимы, а коэффициент вариации не превышает 33% (он составляет 14,7%), можно полагать, что распределение индивидов по среднему числу СХО на клетку подчиняется нормальному закону. Это предположение подтвердилось при анализе, результаты которого представлены в табл.4 и на рис. 4, в ходе которого проведено сравнение наблюдаемых и ожидаемых частот согласно нормальному распределению. Как видно из таблицы, получено достаточно хорошее соответствие (V=2, X =1,55; Р = 0,46).
Относительно показателей пролиферативной активности клеточных культур группа обследованных оказалась также гетерогенной.
Это четко видно по размаху колебаний среднего числа клеточных делений: от 1,27 до 1,91 (табл. 2).
При анализе распределения индивидов по среднему числу клеточных делений наблюдается такая же закономерность, что и по числу СХО с ещё меньшей вариабельностью этого показателя (коэффициент - 9,1$). В таблице 5 и на рис. 5 представлены данные по сравнению наблюдаемых и ожидаемых частот, согласно нормальному распределению.
Зависимость частоты СХО от срока экспозиции БДУ при разных концентрациях тиофосфамида
На первом этапе работы оценивали влияние срока экспозиции БДУ на выход СХО в культуре лимфоцитов человека. Одновременно изменяли концентрацию тиофосфамида.
Схема опыта следующая: лимфоциты периферической крови человека обрабатывали на стадии G0 клеточного цикла тиофосфамидом в течение I часа. Концентрация препарата изменяли от 0 до 25 мкг/мл. После двухкратного отмыва культуры от клеток тио-фосфамида, лимфоциты стимулировали введением ФГА и на 24, 36, 48, 60 и 72 часу от начала культивирования в различные варианты добавляли БДУ. Все анализируемые культуры фиксировали на 96 часу. При такой постановке опыта можно оценить влияние времени нахождения БДУ в культуре клеток в процессе культивирования на уровень индуцированных тиофосфамидом СХО.
Полученные результаты представлены в табл. 12. Как видно из таблицы и рис. 8, где графически показаны изменения числа СХО на клетку в зависимости от времени введения БДУ, уровень СХО на клетку снижается независимо от концентрации тиофосфами-да. Так, при концентрации в 15 мкг/мл на 24 часу введения БДУ число СХО на клетку равно 57,37 + 1,65, а на 72 часу 16,38+0,75. Это снижение везде было пропорционально увеличению времени,прошедшему между началом культивирования и введением БДУ в культуру. Следует отметить, что уровень СХО на клетку возрастает прямо пропорционально концентрации тиофосфамида (рис.9) и не зависит от времени введения БДУ.
При анализе интенсивности пролиферации лимфоцитов обнаруживается уменьшение среднего числа клеточных делений (табл. 13, рис. 10, II). Зависимость среднего числа клеточных делений от сроков введения БДУ представлена на рис, 10. Как видно из рисунка, на 24-м, 36-м, 48-м часах введения БДУ уровень среднего числа клеточных делений одинаков и лишь после 60-го часа введения БДУ происходит снижение скорости клеточного цикла.
