Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Экспериментальная часть
Материалы и методы - 82
Результаты и обсуждение 102
Выводы 175
Список литературы 177
Введение к работе
Актуальность темы. В процессе индивидуального развития многоклеточный организм млекопитающих проходит путь от одной единственной клетки, зиготы, до целого организма. В результате четвертого деления зиготы эмбрион на стадии морулы подразделяется на наружные, более крупные клетки и внутренние клетки меньшего размера. На пятый день развития эмбриона человека - на стадии бластоцисты, наружние клетки морулы формируют экстраэмбриональный внешний слой -трофоэктодерму, необходимые в дальнейшем для имплантации эмбриона. Внутренняя часть клеток морулы образует компактную внутреннюю клеточную массы (ВКМ) бластоцисты. Из ВКМ образуются в дальнейшем эмбриональные и экстраэмбриональные ткани организма. Таким образом, в процессе эмбрионального развития организма млекопитающих существует короткий период, когда группа клеток ВКМ способна дать начало многим, если не всем, тканям будущего организма. Клетки внутренней массы бластоцисты, культивируемые в лабораторных условиях, получили название эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). (Evans & Kaufmann 1981, Thomson 1998). Можно подобрать такие условия культивирования, что программа дальнейшего развития ЭСК in vitro не реализуется, они сохраняют свойство плюрипотентности неограниченное время. В то же время, сменив условия культивирования, можно получить контролируемую дифференцировку ЭСК во все производные трех зародышевых листков. На сегодняшний день исследования биологии стволовых клеток и, особенно, биологии эмбриональных стволовых клеток являются интенсивно развивающимся направлением современной науки. ЭСК мыши стали незаменимым инструментом для изучения функции гена, сделав возможным получение генетических нокаутов. ЭСК человека представляют собой уникальный объект для исследования раннего эмбрионального развития человека. С помощью ЭСК можно изучать генетические процессы, происходящие в раннем онтогенезе, особенности поддержания плюрипотентности, исследовать механизмы регуляции экспрессии генов. Помимо перечисленных фундаментальных аспектов, все более реальной становится возможность практического применения технологий с использованием эмбриональных стволовых клеток, как, например, создание модельных систем для поиска путей лечения заболеваний человека или скринига лекарственных средств. Самые большие надежды на применение ЭСК человека в медицине связаны с тем, что в процессе направленной дифференцировки из них можно получить специализированные дифференцированные клетки (кардиомиоциты, клетки сосудов, инсулин-
продуцирующие клетки и др.), которые, в свою очередь, при решении проблемы иммунологической совместимости, можно использовать в терапевтических целях. Именно эти фундаментальные и практические аспекты биологии ЭСК определяют актуальность темы настоящей диссертационной работы, которая посвящена молекулярно-генетическим и эпигенетическим особенностям новых линий ЭСК и изучению возможностей их дифференцировки.
Цель и задачи исследования. Проведение фундаментальных и прикладных исследований по изучению линий эмбриональных стволовых клеток человека. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Получить линии ЭСК человека, в том числе в отсутствии ^охарактеризованных компонентов среды. Создать Российскую коллекцию линий ЭСК человека. Охарактеризовать способность полученных линий ЭСК к самоподдержанию на протяжении длительного временени.
-
Продемонстрировать генетическую стабильность ЭСК на уровне кариотипа при оптимальных условиях культивирования. Провести детальный молекулярно-цитогенетический анализ аномальных хромосом для установления возможных причин их возникновения.
-
Используя ЭСК человека как модель раннего эмбрионального развития, изучить контактное взаимодействие клеток в пределах структурно-морфологической единицы в плюрипотентном и дифференцированных состояниях.
-
Изучить статус инактивации X хромосомы в женских полюрипотентных клетках и в их дифференцимрованных производных.
5. С целью стандартизации линий ЭСК человека в отношении их потенциала
дифференцировки разработать генетические и эпигенетические критерии
характеристик линий ЭСК на основе известных генов раннего эмбрионального
развития
-
С целью возможного дальнейшего практического применения специализированных производных ЭСК человека для скринига или терапии разработать протоколы дифференцировки ЭСК человека в функциональные клетки нескольких типов.
-
Доказать, что полученные из ЭСК человека специализированные производные соответствуют их взрослым аналогам на генетическом и эпигенетическом уровнях. Научная новизна и практическая ценность работы. Новым является создание российской коллекции линий ЭСК человека, полученных с использованием различных методов культивирования, в том числе и с использованием нового метода выделения ВКМ. Новым является установление новых линий ЭСК в среде с полностью
охарактеризованными компонентами не животного происхождения. Впервые при изучении линий обнаружены эпигенетические различия между линиями ЭСК человека. Показана кариотипическая стабильность ЭСК на протяжении более 100 пассажей. Выявлены и охарактеризованы сублинии ЭСК человека с аномальными хромосомами 9 и 18, аналогичные ранее описанным аномалиям у пациентов с рядом патологий. Таким образом, впервые получены модельные объекты для изучения и терапии этих патологий. В ходе исследований разработаны новые протоколы получения и селекции функциональных дифференцированных производных из ЭСК человека. Впервые показано, что статус метилирования промоторных областей генов, связанных с клеточной специализацией, коррелирует с изменением их экспрессии в процессе дифференцировки ЭСК в эндотелий. Эти и другие результаты работы являются оригинальными и получены впервые, о чем свидетельствуют публикации в рецензируемых международных журналах. Результаты работы имеют практическую значимость. Получены «терапевтические» линии ЭСК, разработаны технологии дифференцировки ЭСК и селекции специализированных производных, которые могут в будущем найти применение в регенеративной медицине. Технологии запатентованы. Работа выполнена в соответствии с темой госрегистрации №0120.0802669. Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на Wilsede Meeting "Modern trends in human leukemia" (Wilsede, Germany, 2005), всероссийских конференциях "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2005, 2007), VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток. (Звенигород, 2005), Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006), I-st Congress of the German society for SC research (Cologne, Germany, 2006), Британско-Российском совещании "Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации" (Москва, 2007), на конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004, 2008), Международной конференции Mechanisms of early differentiation (Barsinghausen, Germany, 2008), German-Russian Bilateral Symposium (Санкт-Петербург, 2008), на II съезде Общества клеточной биологии, (Санкт-Петербург, 2007), на II, IV, VT съездах International Society of Stem Cell Research.(Boston, USA 2004, Cairns, Australia, 2007, Barselona, Spain, 2009).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в
планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том
числе 20 статей в российских и международных журналах и 18 тезисов докладов
и материалов конференций, получено 2 патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах и
состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы,
результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Диссертация
содержит рисунков. Библиография включает ссылок.
Обзор литературы
Первые линии ЭСК были получены из бластоцист мышей линии 129. Эта линия мышей характеризуется высокой частотой образования тератом (Stevens and Little, 1954) в которых, кроме дифференцированных тканей, присутствуют типы тканей, напоминающие ткани раннего эмбриона, получившие названия эмбриональной карциномы (Evans 1972, Martin 1980) Такое свойство линии мышей 129 связано напрямую с генотипом, в частности, мутацией Тег, которая через 30 лет была идентифицирована как мутация в гене Dndl, ассоциированном с развитием клеток полового пути (Youngren et al, 2005). В 1981 г. получение плюрипотентных линий ЭСК мыши было доложено сразу двумя группами (Evans and Kaufman, 1981, Martin, 1981). На первый взгляд протокол получения линий ЭСК мыши кажется весьма простым. Главным в методике являлось использование подложки из митотически инактивированных фибробластов -фидера (от англ. feed). Клетки ВКМ, предварительно отделенные от клеток трофобласта, помещенные на фидер, начинали делиться. Через несколько дней сформированную колонию можно разделить на несколько фрагментов и перенести на новый фидер. Если недифференцированные колонии удается пересадить и размножить, то они дают начало в постоянным линиям ЭСК. На самом деле, это простота кажущаяся. Стандартный протокол воспроизводим для ЭСК из инбредной линии мышей 129, даже использование мышей других линий существенно снижает эффективность получения ЭСК. Если говорить о других видах млекопитающих, то трудностей еще больше. Был опубликован ряд работ, в которых сообщалось о получении плюрипотентных клеток следующих видов - цыпленок (Pain et al.,1996), хомяк (Doetschman et al., 1988), кролик (Schoonjans et al., 1996), норка (Sukoyan et al., 1993 ), крыса (Brenin et al., 1997), обезьяна (Thomson et al.„ 1995) овца (Notarianni et al., 1991), корова (Iwasaki, et al., 2000; Mitalipova et al..,2001). Однако, только в случае мыши и цыпленка было продемонстрирована способность ЭСК попадать в зародышевый путь. Далеко не все первоначальные сообщения о получении ЭСК различных видов млекопитающих впоследствии подтвердились.
Получение ЭСК сельскохозяйственных животных очень перспективно. Генетические манипуляции с клетками in vitro дадут возможность получать уникальные породы скота, производящего с молоком или мясом необходимые человеку компоненты питания или лекарственные средства. Однако, усилия многих биотехнологических компаний пока еще не увенчались успехом. Многочисленные неудачные попытки получения плюрипотентных ЭСК различных видов млекопитающих позволяют сделать вывод о необходимости применения специальных условий для выделения и культивирования клеток ВКМ с учетом особенностей генетики и эмбриологии вида и эпигенетического состояния развивающегося эпибласта. И действительно, при развитии ранней морулы мыши, взамная репрессия транскрипционных факторов cdx2 и oct4 приводит к разделению на ВКМ и трофоэктодерму. Впоследствии ВКМ разделяется на эпибласт и примитивную энтодерму, где экспрессируются NANOG и GATA6 соответственно (Kuijket al., 1998). Однако, при развитии эмбриона коровы и свиньи, oct 4 экспрессируется и в трофобластах, и в ВКМ, что наводит на мысль о том, что сегрегация клеток бластоциста этих животных не зависит от oct4 . Более того, разделение эпибласта и примитивной эндодермы в бластоцисте свиньи не связано с дифференциальной экспрессией Nanog и Gata б, так как первый не экспрессируется в бластоцисте свиньи.
В 1998 году группа Джеймса Томсона (Thomson et al., 1998), а чуть позже группа Бенжамина Реубинофф (Reubinoff et al., 2000) получили линии ЭСК человека, тем самым открыв новые возможности не только для изучения эмбрионального развития человека, но и для направленного гистогенеза in vitro. Для получения стабильных линий ЭСК человека берут невостребованные после искусственного оплодотворения бластоцисты человека. Обычно после процедуры вспомогательных репродуктивных технологий количество бластоцист больше, чем необходимо реципиенту. Их можно заморозить, уничтожить, либо, с согласия доноров, использовать для научных целей.
Еще в 2007 г. число получеиых и хорошо охарактеризованных линий ЭСК человека с нормальным кариотипом не превышало нескольких десятков, а на начало 2010 г. их количество уже превысило 400 (www.hesreg.eu)
Генетическая и морфофункциональная характеристика различных линий ЭСК. Как и все клеточные культуры, эмбриональные стволовые клетки нуждаются в четкой характеристике. ЭСК человека растут полотными колониями, размер каждой клетки около 20 микрон. Ядерно-цитоплазматическое соотношение у недифференцированных клеток высоко, что позволяет использовать данный параметр в качестве оценки степени дифференцировки (Reubinoff et al., 2000). Время удвоения популяции для различных линий ЭСК человека может варьировать в достаточно широких пределах от 24 до 72 часов, достигая на ранних пассажах 150 часов и стабилизируясь по мере культивирования (Cowan et al., 2004). ЭСК могут быть адаптированы к росту in vitro в отсутствии фидерного слоя митотически инактивированных эмбриональных фибробластов, но требуется специальный подбор среды и добавление факторов, ингибирующих дифференцировку и поддерживающих популяцию клеток (LIF, FGF, BMPs, Nodal, Wnt и др). При этом морфология колоний меняется, они становятся более плоскими и могут «сливаться» до монослоя. Вопрос об идентичности морфофункциональных характеристик различных линий ЭСК, полученных от различных индивидуумов, также нуждается в тщательном изучении и ему будет посвящена отдельная глава этого обзора. Несомненно, что по своим основным характеристикам, определяющим эти клетки как ЭСК, они одинаковы, это подтверждается и исследованиями на молекулярно-генетическом уровне. Основные гены, играющие роль в поддержании морфофункциональных характеристик ЭСК, т.е. поддерживающие состояние плюрипотептности и способность к самовозобновлению, экспрессируются одинаково в различных линиях (Adewurai et al., 2007).
Эмбриональные стволовые клетки человека имеют характерные поверхностные иммунологические маркеры, например: SSEA-3, SSEA-4 - антигенные детерминанты гликолипидов и TRA-1-60, TRA-1-81 - разные эпитопы одного протеогликана клеточной поверхности, а так же CD90. В отличие от ЭСК мыши, ЭСК человека не экспрессируют SSEA-1 (Thomson et al., 1998, Reubinoff et al., 2000). Также в ЭСК наблюдают высокую активность эндогенной щелочной фосфатазы и теломеразы.
Экспериментальная часть
Как было сказано ранее, эмбриональные стволовые клетки в культуре представляют собой зафиксированное in vitro состояние перехода внутренней клеточной массы предимплантационной бластоциста к формированию из клеток ВКМ эпибласта. При отделении колоний ЭСК от фидерного слоя и культивировании в суспензии в отсутствии факторов, поддерживающих плюрипотентность, ЭСК начинают дифференцироваться в искусственные морфологические аналоги эмбриона на стадии гаструлы, которые получили название эмбриоидных гелец (ЭТ) Морфологическая модельная система ЭТ обязана своим происхождением той же линии мышей 129, что и ЭСК. Как уже говорилось, эта линия имеет повышенную частоту образования тератокарцином (Stevens and Hummel 1957), которые, в свою очередь, при диссоциации на фрагменты способны формировать шарообразные плавающие структуры (Martin and Evans, 1975). Они получили свое название из-за того, что они в значительной мере по своей морфологии и потенциалу развития напоминали мышиные эмбрионы 6-го дня развития. Внешний слой клеток представляет собой экстраэмбриоаальную энтодерму, в то время как внутренние ткани раннего ЭТ представляют собой примитивную эктодерму (Doetschman et al., 1985). В настоящее время остается не до конца выясненным взаимодействие клеток и тканей в такой искусственной системе развития как ЭТ, однако, достоверно показано, что временная последовательность событий хорошо совпадает с развитием постимплантационного эмбриона мыши in vivo (Loebel et al., 2003). In vitro спонтанная дифференцировка ЭСК человека наблюдается как при длительном культивировании прикрепленных колоний (Turksen et al., 2006), так и в процессе роста ЭТ в суспензии (Conley et al., 2004). ЭСК человека также способны формировать ЭТ, однако в отличие от ЭСК мыши, рост ЭТ не происходит из единичной клетки, необходима группа клеток, которые сохраняют взаимосвязь. Размер ЭТ начинается от десятков микрон и может достигать нескольких миллиметров. Внутри ЭТ по мере созревания начинают образовываться полости, хотя в первые дни формирования ЭТ практически полностью заполнено клетками. Иммуноцитохимический и гистололгический анализ позволяет выявить в этом образовании группы клеток, принадлежащие к трем зародышевым листкам. Проблемы направленной тканеспецифической дифференцировки ЭСК
Дифференцированные производные ЭСК человека могут быть использованы для восстановления тканей при широком спектре заболеваний, связанных с утратой клетками возможности нормально функционировать. К таким заболеваниям относятся повреждения ЦНС, заболевания сердца, нейродегенеративные заболевания, диабет, заболевания опорно-двигателыюго аппарата и другие. Более 16 миллионов людей во всем мире страдает от болезней нервной системы, свыше 120 миллионов - от диабета и более 63 тысяч пациентов только в США нуждаются в донорских органах. Трансплантация производных ЭСК (или iPSC) человека могла бы существенно помочь в решении данных проблем.
Однако, представляется очевидным, что у свойства плюрипотентности ЭСК есть и другая сторона: та же пластичность, которая позволяет ЭСК давать начало сотням клеточных типов, делает их плохо поддающимися внешнему контролю.
Существует несколько основных методологических приемов, которые используются при любых типах дифференцировки ЭСК in vitro: Первый -дифференцировка в через стадию ЭТ в суспензионной культуре. Второй - совместное культивирование ЭСК со стромальными клетками. Третий - дифференцировка ЭСК в двумерных условиях с использованием в качестве подложки белков внеклеточного матрикса. Дифференцировка ЭСК через образование ЭТ - это спонтанная, ненаправленная дифференцировка. Как уже упоминалось, ЭТ содержит клетки, происходящие из разных зародышевых листков, и поэтому доля клеток требуемого типа мала. Кроме того, этот подход обладает еще несколькими ограничениями. Например, трудно наблюдать клетки в микроскоп, проводить анализ дифференцировки единичных клеток, трудно разделять клетки из агрегатов клеток в ЭТ. Однако, на сегодняшний день в большом количестве исследований используется именно такой подход. Он обусловлен, в частности, тем, что ЭТ - грубый модельный аналог развивающегося эмбриона, в котором присутствуют различные клетки, в том числе и необходимые исследователю. В отличие от дифференцировки через стадию ЭТ, прямая дифференцировка ЭСК проста для наблюдения за клетками и манипуляций с ними, но требует предварительных долгих исследований по подбору условий дифференцировки.
Каждый из этих подходов успешно использовался для дифференцировки ЭСК мыши и человека в клетки различных гистотипов (обзор Murry and Keller, 2008). В большинстве использованных протоколов дифференцировки широко используются такие компоненты животного происхождения, как сыворотка, фидерные клетки, клеточные и тканевые экстракты и так далее.
Возможное применение дифференцированных производных ЭСК человека в клинической практике и скрининге лекарственных субстанций может потребовать использования строго определенных компонентов культуральной среды. Использование сред, содержащих компоненты животного происхождения, нежелательно по целому ряду причин: во-первых, возможна контаминация сыворотки или фидера вирусами, опасными для человека; во-вторых, неопределенный состав сывороток и фидера из эмбриональных фибробластов варьирует от лота к лоту, что сказывается как на сохранении клетками плюрипотентности и стабильности генома, так и на их потенциале дифференцировки, кроме того, было показано, что чЭСК, культивируемые с использованием фидера из мышиных фибробластов, экспрессируют Neu5Gc, сиаловую кислоту, что может вызвать иммунный ответ при трансплантации (Martin et al., 2005). Таким образом, переход на бесфидерное культивирование ЭСК и использование сред с определенным составом при их дифференцировке является важным шагом на пути к применению в клинической практике и фармакологии.
Суммируя вышесказанное, хорошо разработанная модель дифференцировки должна в идеале соответствовать следующим требованиям: 1. Сам источник дифференцированных клеток - ЭСК должны культивироваться в стандартизованных условиях. 2. Индуцированная дифференцировка должна приводить преимущественно к желаемому клеточному фенотипу. Должна существовать возможность селекции нужных популяции клеток. 3. Протоколы дифференцировки должны быть воспроизводимы и контролируемы на каждом этапе. 4. Функциональность дифференцированных клеток должна быть доказана с помощью трансплантационных и физиологических тестов. 5. Действие факторов, индуцирующих дифференцировку, должно быть хорошо известно. 6. Желательно также избегать нестандартизованных факторов, таких как сыворотка, кондиционная среда, клеточные экстракты и т.д.
На данном этапе развития клеточных технологий на основе ЭСК человека, эти требования выполняются лишь частично, хотя в последнее время опубликовано несколько протоколов дифференцировки ЭСК человека без использования сыворотки и/или кондиционных сред (обзор Murry and Keller, 2008 ).
В этом обзоре будут рассмотрены опубликованные сведения о дифференцировке ЭСК человека в несколько типов клеток, происходящих в эмбриогенезе из разных зародышевых листков. ЭСК мыши и человека, скорее всего, представляют собой различные стадии развития и нуждаются в различных условиях для поддержания клеток в недифференцированном состоянии (Reubinoff et al., 2000, Thomson et al., 2008). Тем не менее, сигнальные пути, которые регулируют дифференцировку ЭСК мыши и человека, во многом схожи. Как показывает опыт подбора условий дифференцировки ЭСК мыши, наиболее успешны стратегии, моделирующие нормальное развитие той или иной ткани в эмбриогенезе (рис.7).
Материалы и методы
В качестве источника клеток, с информированного согласия пациентов, нами были использованы бластоциста, не вошедшие или оставшиеся после завершения программы по вспомогательным репродуктивным технологиям. Для получения четырех линий ЭСК hESMOl-04 на фидере было использовано 46 бластоцист различного качества. Указанные линии были получены с использованием фидерного слоя из инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) (Рис. 13), а культивирование происходило в среде, содержащей сыворотку животных. При получении линий hESMOl-ОЗ в культуральную среду добавлялся человеческий рекомбинантный LIF , но позже было обнаружено, что LIF не участвует в поддержании плюрипотентности ЭСК человека и остальные линии получали и культивировали без него. После 15-18 пассажей линии ЭСК hESMOl-04 были переведены на среду, содержащую заменитель сыворотки и bFGF.
Несомненно, охарактеризованные компоненты среды (например, сыворотка) не позволяют работать в стандартизованных условиях, а линии ЭСК, из-за компонентов животного происхождения (МЭФ), не могут в дальнейшем применяться в практических целях. В связи с этим было решено получить линии ЭСК в коммерчески доступной среде с определенным составом и в бесфидерной системе. Традиционно для получения ВКМ используется комплемент-зависимый лизис с использованием компонентов животного происхождения или механическое извлечение ВКМ. Нами была разработана оригинальная технология выделения ВКМ, основанная на различной чувствительности трофобласта и ВКМ к гипотонической обработке. Это позволило существенно повысить эффективность получения линий ЭСК человека. Четыре бластоцисты качества АА был использованы для получения бесфидерной линии hESMK05 (рис. 13С), три бластоцисты — для получения линии hESMK06. Линии hESMK05-06 были получены и охарактеризованы совместно с Красноярским центром репродукции.
Прозрачная оболочка бластоцист была лизирована 5% раствором проназы в PBS. Трофобласты были лизированы в стерильной воде в течение 30 сек-1 мин, затем добавляли равный объем 2XPBS. ВКМ трижды отмывали в микрокаплях среды. Для культивирования ВКМ использовали 96 луночные культуральные планшеты, предварительно покрытые матригелем. В каждую лунку помещали одну ВКМ в полной среде mTeSRl с добавлением ингибитора киназы Rock Y-27632 (Invitrogen). Смена половины среды проводилась ежедневно. ВКМ, давшие колонии, культивировались в 96 луночных планшетах 1-2 недели, после чего подросшие колонии обрабатывались 0,1% раствором диспазы (Invitrogen) в PBS, механически делились на 4-6 частей и переносились в 24 луночные планшеты, также предварительно покрытые матригелем. По мере роста культуры часть колоний отбирали на исследование экспрессии маркеров плюрипотентности, кариотипирование и морфологический анализ.
Новые линии ЭСК человека - hESMK05-06, полученные и поддерживаемые на среде mTESRl, постоянно культивируются более 2 лет 6 соответственно, прошли более 80 (hESMK05) и 25 (hESMK06) пассажей и перенесли несколько криоконсерваций (рис.ІЗС). Традиционно для извлечения ВКМ используется метод микрохирургии или комплемент-зависимый лизис клеток трофобласта. Первый метод требует достаточно сложной микрохирургичесой техники и может привести к механическому повреждению ВКМ. Второй метод использует компоненты животного происхождения и полученные в итоге клеточные линии не удовлетворяют современным требованиям по их дальнейшему потенциальному использованию как терапевтические. Поэтому разработка нового оригинального протокола по эффективному освобождению ВКМ из бластоцисты имеет целый ряд преимуществ, основное из которых отсутсвие неохарактсризованных компонентов и компонентов животного происхождения. Ранее, для культивирования клеточных культур актвно использовалась сыворотка животных, однако сыворотка содержит охарактеризованные компоненты и ее серии могут значительно отличаться. Это, несомненно, оказывает влияние на плюрипотентное состояние клеток в культуре и их дифференцирововчный потенциал, а также ограничивает дальнейшую применимость клеток в терапевтических целях. Перевод культур клеток на заменитель сыворотки является несомненным достижением, но тем не менее это не решает полностью задачу стандартизации условий культивирования клеток. В 2006 году Ludwig et al. была предложена новая среда для ведения ЭСК человека, содержащая полностью охарактеризованные компоненты и не требовала применения фидерных клеток, которые также дают неохарактеризованный вклад в культивирование. С 2007 г. эта среда стала коммерчески доступна. Для стандартизации условий культивирования и дифференцировок нами было решено перевести все линии ЭСК на эту культуральную среду. В настоящее время все линии культивируются в бесфидерной системе на подложке из Matrgel (BD) в среде mTESRl (StemCellTechnologies). Этот протокол культивирования позволяет быстро hESM04. наращивать большое число клеток с наименьшим процентом спонтанной дифференцировки, хорошо воспроизводим и легок в использовании. При переводе ЭСК с фидерного на бесфидерный способ культивирования, небольшой процент клеток (менее 10%) могут дифференцироваться на первых двух пассажах, однако, культура стабилизируется к третьему-четвертому пассажу. Аналогично, ЭСК с бесфидерного культивирования могут быть переведены в условия культивирования на МЭФ. Все шесть линий ЭСК имеют типичную для ЭСК человека морфологию, растут в виде плотных колоний, хотя имеются минорные различия между культурами ЭСК, растущими на фидере и без (рис.13). Клетки, составляющие колонию, имеют высокое ядерно-цитоплазменное соотношение, выраженные ядрышки и размер около20 цМ. Клетки пассируются каждые 5-7 дней. Для выяснения оптимальной среды культивироания ЭСК человека в 2007 г. был начат международный проект (International Stem Cell Initiative 2, ISCI2). В рассмотрение был взят ряд сред коммерческого и индивидуального производства. В 2010 г. планируется опубликование результатов проекта в виде научной статьи. По предварительным результатам наиболее оптимальной для культивирования ЭСК человека является среда mTeSRl. Однако, необходимо отметить, что уже после начала выполнения проекта появилась коммерчески доступная среда StemPro Фирмы Stemgent. Нами было проведено культивирование в этой среде ряда линий ЭСК человека на протяжении 5-6 пассажей. По нашему мнению эта среда с определенным составом не уступает по своим качествам среде mTeSRl и может быть также рекомендована к использованию для культивирования ЭСК.
Результаты и обсуждение
Культивирование ЭСК в высокой плотности в условиях, дающих преимущество для развития нейроэпителия (добавление noggin, EGF, bFGF), а затем, через две недели культивирования, добавление 10 нг/мл BMP, 20 нг/мл DKK1, 5 нг/мл VEGF и сыворотки до 15% при культивировании около 90 дней приводило к образованию сложных трехмерных структур нейроэпителиального происхождения.
Эти трехмерные структуры состояли из подслоя нервов и глии, пигментного эпителия с характерной гексагональной формой клеток и пигментными гранулами и располагающимися сверху в несколько плотных слоев клетками с плохо определяемой морфологией. Мы выделили эти структуры механически и провели иммуногистохимический и гистологический анализ, ОТ-ПЦР, и электронную микроскопию полученных структур. Морфологически полученные структуры напоминали развивающуюся сетчатку глаза мыши (рис. 42 К), Действительно, совокупные результаты проведенных анализов указывают на то, что, в фокусах происходит формирование структурированных тканей, имеющих маркеры развивающегося глаза (рис. 42).
Так, ОТ-ПЦР показал экспрессию генов, характерных для пигментного эпителия сетчатки (RPE65 и PEDF) , (рис. 42 J), Принадлежность окрашенных клеток в сруктурах, напоминающих развивающийся глаз, была подтверждена гистологическим анализом полутонких срезов (рис. 42 Н) и электронной микроскопией (рис. 42 I). экспрессия фосдуцина и рековерина (рис. 42 J)„ а так же иммуногистохимический анализ антителами к рековерину (рис. 42 Е) говорит о наличии фоторецепторов сетчатки в полученных структурах. ОТ-ПЦР анализ показал также экспрессию кристаллинов А и В, характерных для хрусталика (рис. 42 J) что говорит о том, что, возможно в полученных структурах есть клетки - предшественники хрусталика глаза.
Подобные структуры ранее были получены из ЭСК обезьян , (Hirano et al., 2003) Структуры, напоминающие развивающийся глаз, при дифференцировке ЭСК человека in уіїго.полученьї нами впервые..
Исследование влияния транскрипционного фактора НохВ4 на дифференцировку ЭСК человека в фидерных условиях.
Предпосылкой к исследованию влияния НохВ4 на дифференцировку эндотелия из ЭСК человека послужили опубликованные данные о том, что НохВ4 оказывает положительное влияние на дифференцировку гематопоэтических клеток (см. обзор литературы, , а таюке неопубликованные данные проф. А. Я. Медвинского (Stem cell institute, Эдинбург) о стимулирующей роли НохВ4 при эндотелиальной дифференцировке CD45-FLK1+ клеток из AGM (aorta-gonad-mesonephros) района эмбрионов мыши.
Для изучения роли НохВ4 в дифференцировке ЭСК человека мы сравнили дифференцирующиеся ЭСК человека при культивировании на двух разных фидерах. Первый фидер представлял собой линию стромальных фибробластов мыши ОР9. В научной литературе имеются многочисленные сведения об увеличении количества и скорости дифференцировки клеток крови при кокультивировании с этой линией стволовых клеток крови, клеток, обладающих свойствами гемангиобласта и эмбриональных стволовых клеток мыши и человека (Nakano et al., 1994, Nakano et al,1996,Vodyanik et al., 2005). OP-9 также поддерживает пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных FLkl+ предшественников, происходящих из ЭСК мыши (Hirashima et al., 1999).
Вторым фидером служили клетки ОР9-НохВ4. Это линия клеток на основе линии ОР9, стабильно экспрессирующая секретируемый НохЬ4 с TAT (transduction domain of HIV transactivating protein) для транслокации в ядро, была любезно предоставлена проф. А. Я. Медвинским (Stem cell institute, Эдинбург).
Для проведения эксперимента клетки ОР9-НохВ4 и ОР9 высевали в плотности около 50% монослоя в одинаковые 6-ти луночные планшеты. После прикрепления ОР9-НохВ4 и ОР9 на них высевали колонии ЭСК человека, предварительно освобожденные с помощью коллагеназы от фидера МЭФ. Культивирование проводилось в течение 5-Ю дней в среде для дифференцировке эндотелия с меньшим (5 нг/мл) содержанием всех ростовых факторов. Состояние клеток и степень их дифференцировки оценивались через 7 дней по следующим параметрам:
Число клеток в колонии оценивалось следующим образом: по 20 колоний с каждого из фидеров снимали механически наконечником от пипетки, промывали дважды PBS и инкубировали 15 минут в нагретом до 37С 0.05% трипсине, после чего инактивировали последний добавлением FBS. Клетки центрифугировали, разбавляли в 500 мкл среды DMEM и подсчитывали в камере Горяева.
К сожалению, нам не удалось получить статистически достоверных данных о том, есть ли разница в общем количестве клеток в колониях, растущих на ОР9-НохВ4 и ОР9. Это можно объяснить и объективными, и субъективными факторами: клетки в колонии после 7 дней дифференцировки находятся в разных ее стадиях, популяция гетерогенна и имеет разную чувствительность к трипсину. В то время как одни группы клеток еще не успевают распасться на одиночные, другие «перетрипсиниваготся» и слипаются в конгломераты. Подсчет, таким образом, очень затруднен и мы решили, что он не может считаться достоверным. Другой способ подсчета - окрашивание фиксированных колоний DAPI также не дал обнадеживающих результатов, потому что колонии - структура многослойная и ядра часто заслоняют друг друга и делают подсчет практически невозможным.
