Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Основные механизмы репарации повреждений ДНК в клетках человека и млекопитающих 8
Глава II. Репаративная активность в клетках, инфицированных вирусами 26
Глава III. Цитопатология, вызываемая вирусом кори в клеточных культурах собственные исследования 42
Глава ІV.Материал и методы исследований 51
Глава V. Влияние вакцинного Л-І6 и "дикого" Эдмонстон штаммов вируса кори на физиологическое состояние перевиваемых клеток человека Л-4І 60
5.1. Исследование цитопатического эффекта вирусов .61
5.2. Влияние вируса кори на митотический режим клеток Л-4І 63
5.3. Влияние коревой инфекции на продолжительность клеточного цикла 65
Глава VІ. Влияние вакцинного и "дикого" штаммов вируса кори на репарацию повреждений ДНК, индуцированных УФ-облучением 71
6.1. Кинетика образования тиминовых димеров 71
6.2. Вырезание тиминовых димеров, индуцированных УФ-облучением, в клетках Л-4І, инфицированных вакцинным и "диким" штаммами вируса кори 74
6.3. Уровень репаративного синтеза ДНК, индуцированного УФ-облучением в клетках Л-4І, инфицированных вирусом кори 84
6.4. Ресинтез разрывов ДНК 97
Заключение 104
Выводы 116
Литература
- Исследование цитопатического эффекта вирусов
- Влияние вируса кори на митотический режим клеток Л-4І
- Кинетика образования тиминовых димеров
- Вырезание тиминовых димеров, индуцированных УФ-облучением, в клетках Л-4І, инфицированных вакцинным и "диким" штаммами вируса кори
Введение к работе
Актуальность проблемы. Значительные успехи, достигнутые за последнее десятилетие в области молекулярной биологии и генетики, открытие репаративных процессов в клетках человека, представили возможность осуществить новый подход в изучении механизмов гомеостаза организма и, в частности, позволили определить роль клеточных систем репарации ДНК в устойчивости клетки к химическим, физическим и биологическим мутагенам. Установлено, что снижение эффективности и точности работы репаративных систем приводит к возрастанию частоты мутационных изменений и повышенной гибели клетки.
В настоящее время обнаружено, что вирусы, в зависимости от их видовой принадлежности и типа течения вызываемого инфекционного процесса, могут ингибировать, стимулировать или не оказывать влияния на репаративную активность клеток (О.Г.Анджапаридзе и др.,1972,1976,1977; Г.Д.Засухина, 1979; Г.Д.Засухина и др., 1978,1979,1981,1983; KLshiyama Y., Rapp F., 1981; Altmann Н. et al., 1983).
Анализ данных литературы показал, что сведения об особенностях репарации индуцированных повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных вирусами, немногочисленны и посвящены, как правило, изучени отдельных этапов репарационного процесса. Исследование всех этапов эксцизионной репарации в одной системе вирус-клетка не проводилось. В то же время представляется возможным, что вирусы могут неодинаково влиять на те или иные этапы процесса репарации, обеспечиваемые активностью различных ферментов.
В литературе также полностью отсутствуют сведения об особенностях влияния различных штаммов одного и того же вируса, об-
5.
ладающих неодинаковыми генетическими свойствами, на репаратив-ную активность клетки. Вместе с тем известно, что именно генетические свойства вируса могут определять степень его вирулентности, характер влияния на основные функции клетки.
Роль вакцинных штаммов вирусов в устойчивости клетки, обеспечиваемой согласованной и безошибочной работой репаративных систем, к мутагенам и канцерогенам, в том числе и естественным факторам окружающей среды, каким является УФ-облучение, до настоящего времени не была исследована.
В то же время детальная биологическая характеристика атте-нуированных вирусов, применяющихся для вакцинации людей, является необходимым этапом в проблеме общей оценки безопасности вакцинных препаратов. Новым критерием определения степени безвредности вакцин могут служить результаты исследования влияния аттенуированных вирусов на репаративные процессы в клетке.
Влияние коревой инфекции на эксцизионную систему репарации в клетках человека до сих пор не изучалось. В связи с тем, что в настоящее время проводится массовая иммунопрофилактика кори с использованием живой вирусной вакцины, а также с тем, что корь остается довольно распространенным и тяжелым заболеванием у детей раннего возраста, сведения о влиянии вакцинного и "дикого" штаммов вируса кори на одну из основных функций клетки -способность восстанавливать повреждения ДНК, могут иметь не только теоретический, но и практический интерес. В частности, они могут способствовать познанию механизмов влияния РНК-содер-жащих инфекционных вирусов на репаративную активность клеток человека и дать представление о том, как вакцинация детей отражается на репаративной функции клетки, участвующей в поддержании стабильности генетического материала.
6.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - дать сравнительную оценку аттенуированного и "дикого" штаммов вируса кори по новому параметру - способности влиять на процесс восстановления клеточной ДНК, поврежденной УФ-лучами.
Основные задачи исследования:
I. Изучить влияние аттенуированного и "дикого" штаммов вируса кори на основные этапы эксцизионной репарации ДНК клетки, поврежденной УФ-лучами:
а) вырезание повреждений, индуцированных УФ-облучением;
б) репаративный синтез ДНК;
в) ресинтез разрывов ДНК.
Z, Исследовать ряд характеристик аттенуированного и "дикого" штаммов вируса кори: цитопатическуго активность, способность влиять на митотическую активность клеток, на продолжительность клеточного цикла и отдельных его фаз.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние вируса кори на репаративную активность клеток человека. На одной модельной системе - вирус кори-клетки человека впервые проведено комплексное исследование основных этапов эксцизионной репарации ДНК клеток, поврежденной УФ-лучами.
Впервые показана роль индивидуальных различий аттенуированного (Ленинград-16) и "дикого" (Эдмонстон) штммов вируса кори, связанных со степенью их аттенуации, в характере оказываемых эффектов на способность клеток человека восстанавливать индуцированные повреждения ДНК.
Полученные данные дают представление об особенностях протекания процесса эксцизионной репарации УФ-индуцированных повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных различными штаммами вируса кори, и вносят определенный вклад в познание меха-
7.
низмов влияния вирусов на способность клеток восстанавливать повреждения собственной ДНК.
Результаты исследований, свидетельствующие о сниженной способности клеток, инфицированных "диким" вирусом кори, восстанавливать индуцированные повреждения ДНК, дают дополнительную информацию для понимания механизмов мутагенного действия вируса.
Научно-практическая значимость работы. На основе проведенных исследований предложен новый критерий для оценки безвредности применения как традиционно используемых, так и вновь конструируемых вакцинных препаратов: влияние на системы репарации, восстанавливающие повреждения клеточной ДНК.
Установленные различия в эффектах, оказываемых вакцинным и "диким" штаммами вируса кори на репаративный синтез ДНК, индуцированный УФ-облучением, в силу доступности метода, используемого для его оценки, могут служить одним из критериев степени аттенуации вируса кори при создании вакцинных препаратов.
8.
Исследование цитопатического эффекта вирусов
При инфицировании клеток Л-4І как вакцинным, так и "диким" штаммами вируса кори в дозе 0,01 ТЦД50 на клетку первые, единичные симпласты, содержащие не более 5 ядер, появлялись через 24 ч после инфицирования. В последующие сутки в обеих клеточных культурах число симпластов и количество ядер в них увеличивалось. Однако, если через 48 ч в культурах, инфицированных вакцинным вирусом, обнаруживалось 8% симпластов, содержащих до 5 ядер, и 5% - включающих по 5-Ю ядер, то в культурах, инфицированных "диким" вирусом, в этот же период отмечалось 18% симпластов, содержащих до 5 ядер, 7% - 5-Ю ядер и 7% - более 10 ядер. Деструкция клеток, инфицированных вакцинным вирусом, наступала через 9-Ю суток, "диким" - через 6-7 суток после заражения.
Определение титра вируса в культуральной жидкости через 24, 48 и 72 ч после заражения клеточных культур вакцинным и "диким" штаммами выявило различия в выходе вируса в культуральную среду (рис. 5.1.2). Титр вирусеодержащей жидкости у вакцинного вируса возрастал от 0,75 lg ТЦД50/0,5 мл до 2,5 ig ТЦД50/0,5 мл, у "дикого" - от I.Oig до 3,0 ig ТЦДзо/0,5 мл.
Таким образом, проведенные исследования показали, что цито-патическое действие вакцинного и "дикого" штаммов вируса кори в культуре клеток Л-4І имеет однотипный характер, отличаясь по времени появления и интенсивности поражения клеток, уровню репродукции вируса.
Для того, чтобы иметь возможность сравнивать репаративную активность клеток не только при одинаковой множественности инфицирования их различными штаммами вируса кори, но и при равной выраженности цитопатического эффекта, вызываемого ими, в отдельной серии экспериментов использовалась доза заражения вакцинным вирусом 0,1 ТЦД50 на клетку, при которой характер цитопатичес-ких изменений был сходен с наблюдаемым при инфицировании клеток "диким" штаммом вируса в дозе 0,01 ТЦД о на клетку.
Митотическую активность клеток определяли через 24 и 48 ч после инфицирования. Проведенные исследования показали, что ни вакцинный, ни "дикий" штаммы вируса не вызывали достоверного угнетения митотической активности клеток Л-4І через 24 ч после инокуляции (табл.5.2.1). В контрольных культурах митотический индекс через 24 ч составлял 35,3+2,3%,в инфицированных вакцинным штаммом - 30,7+2,14%о,"диким" - 31,8+2,31%о (р 0,05). Однако через 48 ч эти различия становились достоверными. Особенно четко проявлялось ингибирующее действие "дикого" штамма. Количество митозов в клетках, инфицированных этим вирусом, снижалось по сравнению с интактяыми на 65% и составляло I8,6+I,9%0 . В это же время в культурах, инфицированных вакцинным штаммом, митотический индекс составлял 25,9+0,3% , в контроле -52,2+3,1%0 (р 0,01).
Другие показатели митотического режима исследуемых клеточных культур были близки между собой. Коэффициент фаз, характеризующий скорость прохождения клетками стадий митоза, в интактных культурах составлял 5,0+0,71, в инфицированных вакцинным вирусом - 4,1+0,77, "диким" - 3,9+0,61 (р 0,05). Однако при определении процента патологических форм митозов среди делящихся клеток в контрольных и инфицированных культурах был обнаружен более высокий их уровень в клетках, инфицированных "диким" вирусом кори. Доля патологических митозов, связанных с повреждениями хромосом и митотического аппарата, в инфицированных "диким" штаммом культурах составила 15,5+1,12%, вакцинным -10,3+2,0%, в контроле - 8,8+1,51% (р 0,05).
Качественный анализ патологии митозов позволил установить, что как в контрольных, так и в инфицированных обоими штаммами коревого вируса культурах, большинство аномальных форм митозов возникало на стадии метафази.
Влияние вируса кори на митотический режим клеток Л-4І
Продолжительность периодов клеточного цикла вычисляли по изменению процента меченых митозов в различные промежутки вре-мени после однократного введения Н -тимидина (20 мин). Первыми мечеными клетками, вступившими в митоз, были клетки, которые при введении изотопа находились в конце s-периода. о ЛИ
Поэтому время от момента введения Н -тимййа до появления пер -вых меченых митозов указывает на продолжительность постсинтетического периода G2, который в неинфицированных культурах клеток Л-4І составлял 2 ч (табл. 5.3.3). Затем фракция меченых митозов увеличивалась и достигала максимума к 12 ч (88,3%), после чего наблюдалось снижение числа меченых митозов. Вторая волна мече -ных митозов после введения Н-тимидина начиналась через 26-28ч. Для определения продолжительности s-периода был измерен интер -вал времени, в течение которого наблюдалось 50$ меченых мито -зов. Продолжительность s-периода в неинфицированных культурах составила 8-Ю ч, После завершения всего цикла клетки вновь начинают делиться и число меченых митозов возрастает. Интервал времени между двумя максимумами меченых митозов соответствует продолжительности всего митотического цикла, т.е. времени ге -нерации - Т. Для контрольных культур это время было равно 22-24 ч . Продолжительность пресинтетического периода G1 » определяли с помощью пересчета: а = Т - ( s + &2 + М), учитывая, что время митоза (М) для клеток млекопитающих, в целом, равно одному часу (М.Г.Чумак,1963). Следовательно, длительность G -периода в неинфицированных культурах составила 10-12 ч.
Как видно из данных, представленных в табл.5.3.3., в культурах, инфицированных вакцинным вирусом кори, в отличие от контрольных клеток, первые меченые митозы появлялись через 4 ч после введения Іг-тимидина, однако в дальнейшем,динамика их накопления была сходной с наблюдавшейся в неинфицированных культурах. Продолжительность клеточного цикла (Т) не отличалась от контроля и составляла 22-24 ч. Длительность s -периода равня -лась 10-12 ч, &-периода - 7-8 ч, G2 -периода - 4-5 ч. При подсчете числа меченых (ДНК-синтезирующих) клеток через 20-24 ч после заражения было установлено, что индекс меченых клеток в инфицированных культурах снижен по сравнению с неинфицирован -ными и составляет 29,8% и 48,2%, соответственно.
Все это свидетельствовало о том, что вакцинный ..штамм вируса вызывал задержку вступления части клеток в s-период. Однако в клетках, уже начавших синтез ДНК, продолжительность клеточного цикла не изменялась по сравнению с неинфицированными клетками.
В культурах, инфицированных "диким" штаммом вируса кори, первые меченые митозы появлялись, также как в контрольных клет-ках, через 2 ч после введения Н-тимидина, однако накопление их в первые 4-5 ч после введения метки происходило менее интенсив но. Максимальное число меченых митозов отмечалось через 8-Ю ч (84,0%). Вторая волна меченых митозов, отражающих начало вто -рого митотического деления клетки, после введения метки начи -налась через 30-33 ч. Пик этой волны приходился на 40-47 ч. Таким образом, время генерации Т в этих культурах составило 35 -43 ч, продолжительность s-периода = 10-12 ч, G = 18-24 ч, что, по сравнению с интактными культурами, свидетельствовало о замедлении скорости прохождения клетками, инфицированными "диким" вирусом кори, митотического цикла. Через 20-24 ч после заражения индекс меченых клеток в этих культурах составлял 15,2%. Следовательно, можно предположить, что в данном случае происходило торможение перехода клеток из &і в s-период.
Таким образом, проведенные исследования позволили выявить различия во влиянии вакцинного и "дикого" штаммов вируса кори на продолжительность клеточного гтдкла и его отдельных периодов, заключавшиеся в том, что вакцинный штамм, не влияя на продол -жительность клеточного цикла, вызывал задержку вступления части клеток вs -период, "дикий" штамм - приводил к увеличению времени генерации клеток на 13-19 ч, по-видимому, в результате образования блока G -s .
Кинетика образования тиминовых димеров
Для индукции повреждений в ДНК клеток использовали УФ-облу-чение, являющееся естественным мутагенным Фактором окружающей среды. Основным фотопродуктом, образующимся при УФ-облучении клеток, являются дилеры ташина, с которыми связывают биологические эффекты, выражающиеся в мутационных преобразованиях и гибели клеток. Количество димеров определяется, прежде всего, дозой УФ-облучения и зависит также от нуклеотидного состава ДНК, вида клеток, условий роста, фазы клеточного цикла ( Carrier її.,
Regan J.,1983). О различной чувствительности клеток к УФ-об -лучению в зависимости от стадии клеточного цикла, на которой они находились в момент облучения, свидетельствуют данные ряда исследователей (Bollum P.,Setlow R.B., 1963; Clarkson J.м. ,1978; Slor Н.,Cleaver J.,I978;uelson j.et al., 1982). Было обнаружено нарастание фотохимического повреждения ДНК в УФ-облученных клетках от митоза к S -стадии клеточного цикла ( Bownes o.S.et al., 1979). Показано также, что в s -фазе уровень димеризации тиминовых оснований может увеличиваться на 20-50$ по сравнению с G т.
В связи с этим, учитывая факт воздействия вируса кори на отдельные показатели функционального состояния клетки, было исследовано влияние коревой инфекции через 24--48 ч после заражения на индукцию УФ-облучением тиминовых димеров.
Проведенные исследования показали (рис.6.1.3.), что в неин-фицированных клетках Л-4І количество димеров тимина, определяе мых сразу после облучения в кислотонерастворимой фракции ДНК» линейно возрастает с увеличением дозы до 40 Дж/м2. При 5 Дж/м2 димеризуется 0,35 0,09% тиминовых оснований в ДНК, при 10 ДжДг-0,8 0,10%, при 20 Дж/м2 - 1,2 0,09%, при 40 Дж/м2 - 1,48 0,12%. При дальнейшем повышении дозы облучения количество димеров уве -личивается незначительно и при максимальной,в наших эксперимен -тах, дозе. 100 Дж/м2 составляет 1,56 0,07%.
В культурах, инфицированных вакцинным вирусом кори, отме -чается сходная кинетика димеризации тимина. При облучении в дозе 5 Дж/м2 число димеров составляет 0,47 0,08%, 10 Дж/м2 - 0,63 0,08%, 20 Дж/м2 - 1,09 0,09%, 40 Дж/м2 - 1,35 0,11%,Ю0 Дж/м2 -1,41 0,10%. Наблюдавшиеся различия в числе индуцированных при соответствующих дозах УФ-облучения димеров в интактных и инфицированных культурах были статистически недостоверными (р 0,05).
При исследовании клеточных культур, зараженных "диким" штаммом вируса, оказалось что уровень димеризации тиминовых основа -ний при всех дозах УФ-облучения в них ниже, чем в контрольных и инфицированных вакцинным штаммом культурах. Облучение в дозе 5 Дж/м индуцировало 0,2 0,04%, 10 Дж/м2 - 0,4 0,07%, 20 Дж/м2-0,74 0,08%, 40 Дж/м2 - 0,80 0,11% тиминовых димеров; при даль -нейшем увеличении дозы количество тиминовых димеров оставалось на том же уровне.
Таким образом, проведенные исследования показали, что инфицирование клеток не отражается на кинетике возникновения УЗнпов-реждений ДНК. Как в неинфицированных, так и в инфицированных обоими штаммами коревого вируса клетках Л-4І, количество димеров тимина возрастало с увеличением дозы облучения до 40 Дж/м . При дальнейшем повышении дозы облучения до 100 Дж/м2 их количество изменялось незначительно. Однако, при инфицировании клеток "диким" штаммом вируса число обнаруживаемых в кислотонерастворимой фракции ДНК тиминовых димеров при всех применявшихся дозах облучения было ниже, чем в контрольных и инфицированных вакцинным вирусом культурах.
Поскольку условия УФ-облучения были стандартными для всех исследуемьк культур, пониженный уровень димеризации тимина в клетках, инфицированных "диким" штаммом, нельзя объяснить различиями в величине падающей дозы УФ-лучей.
Нами было показано,- чта "дикий" штамм вируса кори вызывает задержку вступления клеток в s -фазу клеточного цикла, увеличи -вая продолжительность G -периода до 18-24 ч. Поскольку к моменту УФ-облучения меченых ( s -фазных ) клеток обнаруживалось только 15,6%, можно полагать, что основная их часть находилась в G -периоде. Исходя из данных литературы о том, что уровень димеризации тиминовых-оснований может изменяться в зависимости от фазы кле -точного цикла ( Dcnmes c.et ai., 1979), можно предположить, что более низкое содержание тиминовых димеров в клетках, инфицированных "диким" вирусом, по сравнению с неинфицированным, обусловле -но влиянием этого агента на митотический режим клеток. Можно предположить также, что снижение числа тиминовых димеров происходит за счет изменения количественного соотношения индуцируемых УФ-лучами видов повреждений, в результате вызываемых "диким" виру -сом кори нарушений в белковом компоненте хромосом ( Aula Р., 1965).
Вырезание тиминовых димеров, индуцированных УФ-облучением, в клетках Л-4І, инфицированных вакцинным и "диким" штаммами вируса кори
Вырезание из ДНК участков, содержащих повреждения, являет -ся одним из критериев наличия механизма эксцизионной репарации в клетке. Показано, что из ДНК перевиваемых: клеток человека за 24 ч после УФ-облучения в дозах 2,5 -15 Дж/м2 удаляется 80-100% ДИМерОВ (Regan J.et al., 1971; Regan J,, Carrier W.L., 1974). УФ-эндонуклеазочувствительные сайты удаляются из ДНК нормаль -ных клеток человека при УФ-облучении в дозе 15 Дж/м2 по двух -фазной экспоненциальной кинетике - примерно 60% сайтов элиминируется в течение 14 ч, остальные 25% в течение последующих 34 ч ( paterson м.с., 1982). Однако при больших дозах УФ-облуче-ния полного удаления димеров из ДНК не происходит, что указывает на ограниченную эффективность системы эксцизионной репарации пи-римидиновых димеров ( Regan j., carrier ЇЇ.Ь J974). Элиминация димеров отсутствует или резко снижена в фибробластах больных пигментной ксеродермой, что обусловлено низким уровнем УФ-эндо -нуклеазы ( paterson м.с, 1982).
Для проведения исследований по влиянию коревой инфекции на вырезание УФ-индуцированных тиминовых димеров из ДНК клеток Л-4І использовали дозу УФ-облучения 20 Дж/м , при которой, по данным проведенных нами предварительных экспериментов, за 24 ч пострадиационной инкубации вырезалось, в среднем, 50% тиминовых диме -ров, что давало возможность выявлять как стимулирующий, так и ингибирующий эффекты вирусной инфекции. Кроме того, такая доза облучения не оказывала выраженного влияния на жизнеспособность клеток в период исследования. Число погибших клеток через 24 и 48 ч после облучения колебалось в пределах 2-10%.
О вырезании индуцированных УФ - облучением тиминовых ди -меров из ДНК судили по уменьшению их числа в кислотонераство-римой фракции через 12 и 24 ч пострадиационной инкубации с помощью радиохроматографического метода. Результаты изучения вли 76. яния коревой инфекции на"вырезание тиминовых димеров из ДНК представлены на рис. 6.2.4
В интактных культурах при пострадиационной инкубации в течение 12 ч количество димеров сникалось от 1,2+0,09 до 0,76+0,01%, а через 24 ч - до 0,56+0,14%. Таким образом, в течении 12 ч после облучения вырезалось в среднем 35%, а через 24 ч - 54% индуцированных димеров тимина.
В культурах, инфицированных вакцинным вирусом кори, за 12 ч пострадиационной инкубации число димеров уменьшалось с 1,09± ±0,03 до 0,49±0,04%, через 24 ч - до 0,34±0,01% (57 и 70% соот вегственно).
Подобный уровень вырезания тиминовых димеров отмечался нами также в клетках НеЬа, инфицированных вакцинным штаммом вируса кори (табл.б.2Л). Через 12 ч после УФ-облучения в дозе IOO Дк/м2 доля вырезанных димеров тимина в неинфицированных клетках составляла 30%, а в культурах, инфицированных вакцинным вирусом кори, - 57%.
В клетках, инфицированных "диким" штаммом вируса, вырезание димеров тимина происходило менее интенсивно, чем в интактных и инфицированных вакцинным вирусом культурах Л-4І (рис.6.2Л). В течение 12 ч после УФ-облучения число димеров уменьшалось от 0,74+0,05 до 0,59+0,03, что составляло всего 20$, а через 24 ч вырезанными оказались только 32% индуцированных повреждений.
Для оценки и сопоставления силы и достоверности влияния двух одновременно изучаемых факторов (коревая инфекция, время пострадиационной инкубации) на вырезание УФ-индуцированных повреждений в ДНК и сравнения различий среднего уровня процессов вырезания в интактных и инфицированных культурах результаты описанных экспериментов были обработаны статистически в двухфактор-ном комплексе Фишера.
За фактор А была принята клеточная культура Л-4І с двумя градациями (Aj - интактная, к - инфицированная). Фактором В было обозначено время (часы) пострадиационной инкубации с тремя градациями (Bj - 0 ч, В2 - 12 ч, Bg - 24 ч после облучения).
Дисперсионный анализ данных, полученных в опытах с культурами, инфицированными вакцинным вирусом кори (табл.6.2.5) показал достоверное влияние организованных в опытах факторов (#х= 93%, р -0,001). Степень участия случайных, неорганизованных факторов - рН среды, температурные колебания, плотность посева в отдельных чашках и др. составлял лишь 7% (р 0,001).
