Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Введение 6
1.1. Цель и задачи исследования 8
1.2. Научная новизна и практическая значимость 8
1.3. Положения, выносимые на защиту ю
1.4. Апробация работы 10
1.5. Публикации 11
1.6. Структура и объем диссертации 11
Глава 2. Современное состояние проблемы. Анализ литературных данных 12
2.1. Развитие поджелудочной железы 13
2.2. Генетические механизмы развития поджелудочной железы 16
2.3. Формирование энтодермы 20
2.4. Ключевые гены панкреатической детерминации и дифференцировки 25
2.4.2. Ген nkx2.2 27
2.4.3. Гены nkx6.1 иnkx6.2 28
2.4.4. Ptfla 29
2.5. Гены эндокринной дифференцировки 30
2.5.1. Neurod 30
2.5.2. Neurogenin 3 31
2.5.3. Notch сигнальный путь 32
2.5.4. Hesl 34
2.5.5. Isll 34
2.5.6.рах4ирах6 35
2.5.7. Mafa 36
2.6. Проблема лечения сахарного диабета 36
2.7. Сигнальный путь инсулина 38
2.8. Диабет зрелого типа у молодых (mody) 41
2.9. Современные подходы к лечению инсулпнзависпмого сахарного диабета 43
2.9.1. Терапия, основанная на восстановлении регенерации в- клшок островков лангерганса 43
2.9.2. Терапия, основанная на трансплантации островков лангерганса 45
2.9.3. Терапия с-шрного диабета с помощью стволовых клеток 46
Глава 3. Материалы и методы 50
3.1. Получение культуры клеток 50
3.2. Выделение cd146+популяции клеток 51
3.4. Дифференцирование выделенных mck 53
3.5. Получение аденовирусной конструкции 54
3.6. Трансфекцпя клеток и индукция панкреатической дифференцировки 59
3.7. Анализ экспрессии панкреатических маркерных генов 60
3.7.1. Анализ изменения транскрипции генов 60
3.7.2. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 63
3.7.3. Анализ транскрипции инсулина во времени 63
3.7.4. Elisa (тест на толерантность к глюкозе) 64
3.8. Статистическая обработка данных 64
Глава 4. Результаты и обсуждение 65
4.1. Трансфекция pad5-pdx1 стандартных мск из жировой ткани и пупочного канатика человека 67
4.2. Трансфекция pad5-pdx1 мск периваскулярного фенотипа из жировой ткани и пупочного канатика человека 74
4.3. Выбор условий дифференцировки трансфицированных популяций мск cd146+cd31-человека pad5-pdx1 80
4.4. Анализ экспрессии нестина в исследованных популяциях МСК 86
Глава 5. Заключение 89
Глава 6. Выводы 90
Список литературы
- Научная новизна и практическая значимость
- Ключевые гены панкреатической детерминации и дифференцировки
- Диабет зрелого типа у молодых (mody)
- Анализ экспрессии панкреатических маркерных генов
Введение к работе
Актуальность темы
Распространение диабета в мире постепенно достигает эпидемических масштабов. Согласно прогнозам, в течение следующих 25 лет произойдет увеличение количества больных диабетом почти в два раза (до 300 миллионов человек). Сегодня более 5 миллионов человек по всему миру больны диабетом первого типа (наиболее жесткая форма заболевания), 395 тысяч из них – дети. Сахарный диабет 1 типа (СД 1) характеризуется разрушением - клеток путем аутоиммунной атаки. Недостатки современных методов лечения СД 1 – инсулинотерапии и трансплантации ткани поджелудочной железы (ПЖ) - стимулируют развитие и совершенствование клеточной терапии, в частности, поиск новых альтернативных источников - клеток.
В связи с этим, в последние годы стали активно разрабатываться и изучаться новые методы регенерационной терапии, предусматривающие выделение и ex vivo предифференцировку эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Эти клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем зрелые дифференцированные островки ПЖ и поэтому могут оказаться хорошим материалом для получения достаточных количеств функционально-активной массы - клеток.
Дифференцировка в инсулин-продуцирующие клетки должна включать индукцию регуляции секреции, которая подразумевает накопление инсулина в клетках и быстрое выделение его в ответ на различные физиологические сигналы. Чтобы достичь этого, в клетках должен быть активирован комплекс панкреатических генов, очень сходный с таковым в нормальных - клетках. Получение просто продуцирующих инсулин клеток, без обратной связи и какого-либо контроля его секреции не дает никаких преимуществ по сравнению с простыми методами введения инсулина. Мультипотентные стромальные клетки (МСК) взрослого организма привлекают внимание исследователей и практических врачей по следующим причинам: они наилучшим образом подходят для аутологичной трансплантации; высокая скорость пролиферации позволяет нарастить достаточное количество клеток для трансплантации; обладают способностью к дифференцировке в разные клеточные линии.
Существует предположение, что для эффективной направленной дифференцировки в инсулин – продуцирующие клетки, необходима экспрессия клетками нестина (Lee S., 2000), т.к. показано, что нестин-экспрессирующие клетки, изолированные из человеческих или крысиных островков поджелудочной железы могут дифференцироваться в эндокринные и экзокринные клетки in vitro (Zulewski H., 2001; Blyszczuk P., 2003; Zhang L., 2005). И авторы многих работ для получения таких клеток используют стадию селекции нестин-экспрессирующих клеток, описанную ранее для генерации нейронов (Blyszczuk P., 2003). До сих пор остается неясным, является ли необходимой экспрессия нестина для эффективной трансдифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки.
В настоящее время активно развивается тема о происхождении МСК из предшественников перицитов, имеющих фенотип CD146+CD31- и обладающих более широким спектром дифференцировки по сравнению со стандартно пассированными МСК. Работ по получению инсулин-продуцирующих клеток из популяций данного фенотипа не обнаружено. Опубликовано несколько первых исследований, демонстрирующих возможность использования МСК из костного мозга в качестве источника получения инсулин-продуцирующих клеток, в том числе аутологичных (Karnieli O., 2007; Li Y., 2007). Эффективная трансдифференцировка МСК из жировой ткани и сосудов пупочного канатика в инсулин-продуцирующие клетки в литературе не описана.
Цель исследования
Получение инсулин-продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и пупочного канатика человека.
Задачи исследования
-
Выделить и охарактеризовать популяции МСК из сосудистой стенки пупочного канатика и жировой ткани.
-
Подобрать метод доставки гена, кодирующего транскрипционный фактор Pdx1, играющий ключевую роль в дифференцировании клеток поджелудочной железы.
-
Оптимизировать условия трансфекции, культивирования и состав дифференцировочной среды.
-
Трансфицировать МСК из пупочного канатика и жировой ткани геном Pdx1 и проанализировать транскрипцию ключевых генов панкреатической дифференцировки: NGN3, NeuroD, MafA, Insulin.
-
Показать способность полученных инсулин-продуцирующих клеток изменять уровень секреции инсулина в ответ на изменение концентрации глюкозы (тест на толерантность) к глюкозе.
-
Проанализировать экспрессию нестина в полученных популяциях МСК и проследить корреляцию между уровнем экспрессии нестина и способностью к эффективной дифференцировке в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки.
Научная новизна и практическая значимость
Впервые показано, что эффективная дифференцировка в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки преимущественно происходит в CD146+CD31- популяциях МСК жировой ткани и пупочного канатика человека.
Подобраны оптимальные условия трансфекции (необходимая концентрация аденовирусной конструкции, время сорбции, а так же эффективность трансфекции) CD146+CD31- и CD146-CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека.
Подобраны условия культивирования трансфицированных клеток, а так же состав дифференцировочной среды. Показано, что добавление этапа культивирования в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к увеличению транскрипции инсулина в 7 раз в трансфицированных CD146+ популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM.
В результате проведенного исследования установлено, что транскрипция инсулина сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.
Показано, что полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.
Проведен анализ зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин. Корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдали экспрессию нестина на высоком уровне, к активации транскрипции инсулина не приводила.
В настоящей работе впервые разработан метод получения функционально-активных инсулин-продуцирующих клеток из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека путем транзиентной трансфекции геном Pdx1.
Положения, выносимые на защиту
-
Популяции МСК из пупочного канатика и жировой ткани периваскулярного фенотипа, несущие на поверхности маркер CD146 эффективно дифференцируются в функционально-активные инсулин-продуцирующие клетки путем транзиентной трансфекции геном Pdx1. Трансфекция популяций МСК, не имеющих маркер CD146, к эффективной дифференцировке в панкреатическом направлении не приводит.
-
Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к значительному увеличению транскрипции гена Insulin в трансфицированных CD146+CD31- популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM. Транскрипция гена Insulin сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.
-
Полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.
-
В процессе анализа зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдалась экспрессия нестина на высоком уровне, к активации транскрипции Insulin не приводила.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по аутологичным стволовым клеткам (Москва, 2009); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов на Дону, 2010); Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по стволовым клеткам и регенеративной медицине (Москва, 2010).
Личный вклад автора в проведение исследования
Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен лично. Протоколы исследования разработаны автором. Публикации работы, а также описание исследования выполнены автором самостоятельно.
Публикации
Результаты диссертационной работы отражены в 6-ти печатных работах: 3-х статьях и 3-х тезисах. Три статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Внедрение результатов работы
Результаты исследования внедрены в курс лекций «Соединительные ткани» кафедры гистологии и эмбриологии РГМУ и в работу МГНЦ РАМН.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 109 стр. машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 163 источника отечественной и зарубежной литературы.
Научная новизна и практическая значимость
Поджелудочная железа (ПЖ) — непарный орган, расположенный ниже желудка на уровне нисходящей части петли двенадцатиперстной кишки и селезенки (рис. 1). Эта железа обладает одновременно экзокринной и эндокринной функциями. Экзокринная функция осуществляется ацинусами, вырабатывающими пищеварительные ферменты, из которых наибольшее значение имеет трипсин, а также липолитический и амилолитический ферменты. Эти пищеварительные ферменты секретируются ацинусами в неактивной форме (в виде проферментов, например трипсиноген) и в нормальных условиях активируются только в полости двенадцатиперстной кишки. Эндокринная функция принадлежит островкам Лангерганса, (были описаны в 1869 г. П. Лангергансом) представляющим вторую структурную единицу паренхимы поджелудочной железы. Панкреатические островки диффузно распределены в экзокринной паренхиме ПЖ; они составляют 1,5-2 % общего объема ПЖ. Каждый островок содержит около 1000 различных эндокринных клеток, а также несколько резидентных макрофагов, играющих важную роль в индукции и поддержании аутоиммунных процессов в островке, приводящих к развитию сахарного диабета типа 1.
Островки Лангерганса имеют округлую форму, и их количество нарастает от головки к хвосту, а общее их число составляет приблизительно 1 млн. Они образованы пятью типами эндокринных клеток: а-клетки (10—30%) секретируют глюкагон, В-клетки (60—80%) — инсулин, d- и dl- клетки (5—10%) — соматостатин и вазоинтестинальный пептид, РР-клетки (2—5%) — панкреатический полипептид. В -клетки располагаются преимущественно в центральной зоне островка, a, d, dl- и РР-клетки — по его периферии. В поджелудочной железе обнаружен также особый тип клеток — ациноостровковые (смешанные, или переходные), вырабатывающие одновременно гранулы энзимогена и гормоны: они располагаются главным образом вблизи панкреатических островков.
В эмбриогенезе поджелудочная железа развивается в течение первых 5 недель эмбрионального периода и формируется из двух выпячиваний (дуоденального и печеночного дивертикула) энтодермы первичной кишечной трубки на уровне печеночного протока в месте ее перехода в среднюю кишку. Первое выпячивание выявляется уже у эмбриона длиной 3 мм на дорсальной стороне первичной кишечной трубки рядом с печеночным дивертикулом. Из дорсальной части в дальнейшем развиваются тело и хвост поджелудочной железы (рис. 2). Недалеко от этого выпячивания на вентральной стороне первичной кишечной трубки каудально к печеночному дивертикулу, а иногда и от него образуется второе выпячивание (состоящее в свою очередь из левого, который при нормальном развитии затем полностью исчезает, и правого пузырьков); из него развивается головка поджелудочной железы (рис. 2). Печеночный дивертикул, увеличиваясь, входит в вентральную часть поджелудочной железы и в последующем образует общий желчный проток. Полное разделение указанных частей происходит у эмбриона человека уже к 7-й неделе внутриутробного развития. Оба выпячивания увеличиваются за счет нерегулярного роста протоков. На этой стадии развития поджелудочная железа состоит из неделящихся трубочек цилиндрического эпителия, которые окружены мезенхимальной тканью. У 2-4- месячного эмбриона система протоков преобразуется в дольки, в центре которых выявляются островки, образующиеся вдоль системы протоков из их тубулярной части. На 8-9-й неделе эмбрионального развития в поджелудочной железе выявляются все четыре типа основных эндокринных клеток, которые локализуются отдельно от эпителия протоков.
Эндокринная и экзокринная ткани поджелудочной железы развиваются из эмбрионального панкреатического эпителия. До настоящего времени еще остаются загадкой механизмы дифференцировки этой ткани на ацинозную и островковую. Установлено, что мезенхимальная и эмбриональная эпителиальная ткани взаимодействуют между собой. И существует предположение, что мезенхимальная ткань помогает осуществлять контроль за пролиферацией и дифференцировкой панкреатического эпителия в ацинозную ткань и 6-клетки. Показано, что созревание fi-клеток происходит и при отсутствии мезенхимы, тогда как для нормального развития экзокринных клеток она необходима (Park et al.,2010). E8.5
Развитие поджелудочной железы из энтодермы первичной кишечной трубки. Выявлены тесные взаимоотношения между панкреатическими протоками и островками в поджелудочной железе взрослого человека. Показано, что эндокринные и экзокринные клетки могут развиваться из эпителия протоков поджелудочной железы, следовательно, в постнатальном периоде возможно образование эндокринных клеток из клеток панкреатических протоков. Новообразование эндокринных клеток в поджелудочной железе взрослого человека происходит благодаря митотической активности паренхиматозных, а также путем пролиферации и дифференцировки клеток протоков в эндокринные клетки. В норме митотическая активность эндокринных клеток островков небольшая. Dudek и другие показали образование островка из трансплантированных протоков взрослых крыс, "завернутых" в фетальную кишечную мезенхиму, которая индуцировала указанную цитодифференцировку взрослых протоков в эндокринные клетки.
В течение многих лет считалось, что В - клетки дифференцируются к концу внутриутробного периода и их количество в постнатальной жизни не изменяется. Однако, благодаря многочисленным экспериментальным исследованиям и новым технологиям, стало ясно, что общий пул В -клеток в поджелудочной железе не постоянен, а динамичен и количество В-клеток изменяется для поддержания гомеостаза глюкозы в зависимости от различных внешних и внутренних факторов. Общий пул В - клеток в островке поджелудочной железы зависит от их количества при рождении и запрограммированной смерти. Увеличение количества эндокринных клеток, обычно наблюдаемое в эмбриональном периоде, осуществляется не только за счет репликации существующих клеток островка, но и путем их трансформации из пула быстроделящихся клеток протоков железы.
Генетические механизмы развития поджелудочной железы Появление глюкагон - продуцирующих клеток в первичных зачатках ПЖ является первым доказательством цитодифференцировки панкреатических клеток. Считалось, что это предшественники всех эндокринных клеток. Однако, затем было установлено с использованием Cre-Lox рекомбиназ, что инсулин - и глюкагон - продуцирующие клетки не родственны. Удалось показать, что инсулиновые клетки не проходят через стадию экспрессии глюкагона (Неп-era et al., 2000). Так же было показано, что и глюкагон - продуцирующие клетки не развиваются через стадию экспрессии инсулина, и было сделано заключение, что эти типы клеток развиваются независимо(.Тепзеп et al., 2000). Существует общий источник эндокринных клеток существует в виде предшественников, не экспрессирующих гормональные продукты, а-и р -клетки развиваются из Pdxl-экспрессирующих клеток (Herrera et al., 2000).
Gu et al., (2002) показали, что все происходящие из энтодермы эпителиальные клетки поджелудочной железы - эндокринные, экзокринные и клетки протоков - происходят из предшественников, экспрессирующих Pdxl. Установлено, что клетки протоков дифференцируются в течение короткого периода времени между Е9.5 и Е12.5 стадиями развития у мышей. Такого временного ограничения не отмечено для экзокринных и эндокринных клеток. Было также показано, что клетки, экспрессирующие Ngn3, исключительно эндокринного типа (Gu et al., 2002), что согласуется и с другими исследованиями (Gradwohl et al., 2000; Jensen et al., 2000; Schwitzgenel et al., 2000). Наконец, Kawaguchi et al., (2002) используя нокаут гена Ptfla, выявили, что панкреатические экзокринные клетки возникают из предшественников, экспрессирующих Ptfla, а также установили, что Ptfla подобно Pdxl экспрессируется и в недифференцированных панкреатических предшественниках. Всё это демонстрирует, что панкреатические клетки проходят стадию общего предшественника, экспрессирующего гены Ptfla и Pdxl - и что дифференцировка в эндокринном и экзокринном направлениях происходит посредством активации генов транскрипционных факторов (например, Ngn3 в случае эндокринных клеток).
Ключевые гены панкреатической детерминации и дифференцировки
Диабет зрелого типа у молодых (mody)
Дифференцирование более детерминированных компартментов энтодермы предопределяется пространственной активацией определенных генов сети с помощью - в значительной степени - неизвестных морфогенетических стимулов, регулирующих самих себя с помощью внутренних факторов. Таким образом, панкреатическая детерминация осуществляется с помощью активации Pdxl и НВ9 и непосредственно сопровождается дальнейшей активацией других генов {Nkx2.2, Nkx6J). Состояние панкреатической детерминации не является перманентным -клеткам необходимо приобретать свою более специализированную окончательную судьбу и подобная специализация осуществляется с использованием клеточных внутренне присущих регуляторов. В случае эндокринных частей ПЖ происходит активация гена Nenrogenin3 (atoh5), сопровождаемая несколькими генами, которые могут быть общими для всех эндокринных клеткок (Рахб, Ы1, NeuroD) или клеточно-специфичными (Рах4, Вт4) среди эндокринных типов в панкреатических островках. Аналогично развитие экзокринных клеток отражается в непрерывной активации гена Ptfl сопровождаемой активацией гена Mistl. Некоторые гены, такие как ядерный рецептор 5А2 (пг5а2) или Gata4, скорее всего могут играть роль, но эти гены не специфичны для поджелудочной железы, и снова обнаруживается, что набор из комбинации генов детерминирует тканевую специфичность, а не единичное действие высоко специфичного регулятора. 2.3. Формирование энтодермы
Дефинитивная энтодерма формируется во время гаструляции из набора клеток вблизи и спереди от узелка, который занимает положение на вентральной поверхности яйцевого цилиндра у эмбрионов мышей после миграции через первичную полоску. У рыб имеются гомеобоксные гены Bonnie-and-clyde (Bon) и Casanova, которые индуцируют ген Sox 17 Sox-типа, участвующего в развитии энтодермы. Nodal, лиганд TGF3/BMP-типа, предопределяет экспрессию Casanova посредством гена Mixer, указывая тем самым на участие BMP сигналов в развитие энтодермы (Alexander et al., 1999). У Xenopus повышенная экспрессия TGF(3/BMP-типа лиганда activm индуцирует развитие энтодермы, а одновременная работа генов Sox J 7 и A4IXER способны индуцировать эндокринную дифференцировку (Henry and Melton, 1998). Activin индуцирует также ген XlhboxS (Gamer and Wright, 1995), который является ортологом гена Pdxl у млекопитающих. Близким гомологом MIXER у млекопитающих является ген Mixl. Было показано, что экспрессия этого гена у Xenopus индуцирует энтодермальную программу (Molm et al., 2003). Таким же образом, ортолог млекопитающих Soxl 7 необходим для формирования энтодермы. Nodal/BMP-подобные сигналы также вовлечены в индукцию энтодермы у млекопитающих. Известно, что мыши, с отсутствием гена SMAD2 (madhl), который вовлечен в сигнальный путь TGFp/BMP, не способны формировать энтодерму (Tremblay et al., 2000). Аналогично, отсутствие гена SMAD4 (madh4) из этого же сигнального пути, приводит к невозможности образования энтодермы (Yang et al., 1998). TGFp/BMP-лиганды, участвующие в формировании энтодермы у млекопитающих детально еще не изучены.
Гены семейства Gata также участвуют в детерминации и формировании энтодермы. Мутация у рыбок Danio гегіо по гену Gata5 вызывает сильную редукцию энтодермального компартмента со сниженной экспрессией гена Axial (ортолог Foxa2), а также Soxl 7 (Reiter et al., 2001). У лягушек экспрессия Gata5 непосредственно стимулируется с помощью гена Activin (Weber et al., 2000). Геном мыши и человека содержит близкие гомологи Gata5, Специфическая роль гена Gata.5 мыши в развитии энтодермы не показана. Мыши с инактивированным геном Gata5 имеют дефекты мочеполовой системы, а также пониженную жизнеспособность (Molkentin et al., 2000).
Одним из ключевых генов в развитии энтодермы является ген Forkhead (Foxa2) или его ортологи (Ang et al., 1993; Ang and Rossant, 1994). При изучении индукции энтодермы в ЭСК клетках было показано, что экспрессия Foxa2 индуцируется геном Foxd3 и ингибируется с помощью гена Oct4 (Guo et al., 2002). Таким образом, дифференцировка в энтодермальном направлении может регулироваться с помощью понижения или потери экспрессии гена Oct4 (pou5fl). Известно также, что ген Foxd3 и ген Oct4 (pou5fl) экспрессируются в ЭСК, а сам по себе FoxdS играет роль в развитии нейрального гребня (Kos et al., 2001) и не экспрессируется в развивающейся энтодерме. Показано, что повышенная экспрессия Foxd3 может индуцировать формирование энтодермы (Ang et al., 1993).
Ген Foxa2 является ключевым регулятором и участвует в лёгочно-(Costa et al., 2001), печеночно- (Cirillo et al., 2002), и панкреас-специфической (Cockell et al., 1995; Wu et al., 1997) экспрессии генов. Foxa2, помимо указанных выше, регулируется посредством других генов, стоящих выше и необходимых для предопределения энтодермальной судьбы во время гаструляции. В печени и поджелудочной железе ядерный рецептор Nr5a2 участвует в поддержании экспрессии Foxa2, а в отсутствии гена Hex экспрессия Foxa2 в клетках печени, но не в передней кишке, теряется (Martinez -Barbera et al., 2000).
Возможно, что нижестоящей мишенью для Foxa2 является ген Hnf4, участвующий в энтодермальной программе (Bailly et al., 2001). Этот ген прежде всего необходим для развития висцеральной части энтодермы (Chen et al., 1994). Hnf4 также необходим для нормальной дифференцировки клеток печени. Помимо печени HNF4 участвует в регуляции развития кишечника и поджелудочной железы у взрослых (Sladek et al., 1990; Hayhurst et al., 2001). HNF4 экспрессируется в ходе всего развития поджелудочной железы, но его роль в этом процессе не изучена. Он экспрессируется в недифференцированных панкреатических предшественниках, а также в зрелых экзокринных и эндокринных клетках (Nammo et al., 2002). Во взрослой поджелудочной железе, и Hnfla (Tcfl) и Нп/4 важны для функции взрослых Р-клеток. Гипоморфные мутации Нп/4 ответственны за MODY1 (maturity onset diabetes of the young), a Hnflfi (Tcf2) мутации ответственны за MODY3 (Yamagata et al., 1996).
Гены Gata6 и Hnflfi (Tcf2) расположены выше пары Hnf4/Hnfla. Они активируют промотор гена Hnf4 (Morrisey et al., 1998). Мутация по гену Gata6 ведет к нарушению пост-эмбрионального развития (Morrisey et al., 1998; Koutsourakis et al., 1999). Gata6 не является необходимым для индукции формирования энтодермы, но участвует в её дифференцировке (Morrisey et al., 1998). Эмбрионы, имеющие мутацию по гену Gata6 не способны активировать множественные энтодермальные маркёры, такие как Нп/4, Foxal, и Gata4 (Morrisey et al., 1998). Gata6 не ограничивается ролью в ранней энтодерме и экспрессируется во многих не-энтодермальных типах клеток (Narita et al., 1996). В лёгких Gata6 необходим для морфогенеза ветвления (Keijzer et al., 2001; Yang et al.,2002), а в сердце Gata6 участвует в развитии кардиомезодермы (Molkentin et al.,2000а). HNF1/3 является геном, участвующим в активации генов MODY, MODY5 (Horikawa et al., 1997). Hnflp, как было показано, играет роль в некоторых процессах энтодермального развития у рыбок Danio rerio, а именно в активации Pchcl и Shh (Sun et al., 2001).
Анализ экспрессии панкреатических маркерных генов
Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевои кислоты приводило к увеличению транскрипции Insulin в 7 раз в трансфицированных CD146+CD31-популяциях МСК по сравнению с культивированием в обычной среде (рис. 21).
Культивирование в дифференцировочной среде трансфицированных популяций МСК CD146-CD31- к активации транскрипции гена Insulin не привело. Таким образом, было найдено новое, ранее не использованное авторами, сочетание индукторов дифференцировки - коммерческая среда CMRL-1066 с добавлением ретиноевои кислоты.
Проведена оценка морфологических изменений МСК после трансфекции pAd5-Pdxl. Через сутки после трансфекции во всех типах клеток морфологических изменений не обнаружено. Через 7 дней культивирования трансфицированных клеток в подобранных условиях во всех культурах, кроме МСК CD146-CD31- из пупочного канатика, 4.5-І Относительный уровень мРНК Рисунок 21. Анализ уровня мРНК гена Insulin в трансфицированных клетках, культивированных в различных дифференцировочных средах. 1-контроль, 2-трансфицированные клетки в обычной среде; 3- в среде CMRL-1066, 4- в среде CMRL-1066 с GLP-1, 5- в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой, 6- в среде CMRL-1066 с никотинамидом, 7- в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой, GLP-1 и никотинамидом, 8- в среде CMRL-1066 с GLP-1 и ретиноевой кислотой. Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени. (п=6). - различия достоверны (р 0,05) по отношению к контролю.
Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводило к увеличению транскрипции Insulin в 7 раз в трансфицированных CD146+CD31-популяциях МСК по сравнению с культивированием в обычной среде (рис. 21).
Культивирование в дифференцировочной среде трансфицированных популяций МСК CD146-CD31- к активации транскрипции гена Insulin не привело. Таким образом, было найдено новое, ранее не использованное авторами, сочетание индукторов дифференцировки - коммерческая среда CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты.
Проведена оценка морфологических изменений МСК после трансфекции pAd5-Pdxl. Через сутки после трансфекции во всех типах клеток морфологических изменений не обнаружено. Через 7 дней культивирования трансфицированных клеток в подобранных условиях во всех культурах, кроме МСК CD146-CD31- из пупочного канатика, отмечено снижение количества живых клеток. В МСК CD146+CD31- из жировой ткани наблюдалось образование суспензионных кластеров не плотной структуры. В CD146+CD31- популяциях МСК из пупочного канатика обнаружены плотные островковоподобные структуры, которые были прикреплены к подложке. В поле зрения сохранялись одиночные прикрепленные клетки (рис. 22, 23). Рисунок 22. Морфологические изменения CD146-CD31- (А, Б, В) и CD146+CD31-(Г, Д, Ж) популяций МСК жировой ткани после трансфекции pAd5-Pdxl. А, Г- не трансфицированные клетки, культивированные в дифференцировочной среде в течение 7 дней; Б,Д- трансфицированные клетки через сутки после трансфекции; В, Ж-трансфицированные клетки через 7 дней культивирования в дифференцировочной среде. Рельефный фазовый контраст (XI00). A. трансфицированные клетки через 24ч после трансфекции; В, Ж-трансфицированные клетки через 7 дней культивирования в дифференцировочной среде. Рельефный фазовый контраст (XI00). Одним из важнейших вопросов при получении трансфицированных клеток, продуцирующих инсулин, является период дифференцировки клетки и сохранения секреции гормона. Трансфицированные клетки культивировали в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой в течение 7, 14 и 21 дня соответственно (рис. 24).
Анализ транскрипции инсулина в трансфицированных CD146+CD31-популяциях МСК во времени. Анализ проведен методом ПЦР в реальном времени. (п=9). - различия достоверны (р 0,05) по отношению к контролю.
Показано, что транскрипция Insulin максимальна на 14 день после трансфекции. Через 21 день после трансфекции транскрипция инсулина значительно падала. Падение транскрипции гена Insulin обуславливалось гибелью клеток. Дифференцировочная среда не содержит сыворотки, что является необходимым для остановки пролиферации клеток, в такой среде клетки долго жить не могут. Добавление к среде сыворотки может вызвать пролиферацию клеток и, соответственно, выброс аденовирусных частиц, т.е. блокировать панкреатическую дифференцировку. Именно поэтому 10-12 дней для in vitro дифференцировки клеток является оптимальным. 4.4. Анализ экспрессии нестина в исследованных популяциях МСК
Поскольку в большинстве работ по получению инсулин -продуцирующих клеток авторы для эффективной направленной дифференцировки используют популяции нестин - положительных клеток (Blysrczuk et al., 2003), были проведены исследования по анализу экспрессии нестина в полученных популяциях МСК (CD146-CD31- и CD146+CD31-) из пупочного канатика и жировой ткани с целью проследить зависимость между эффективностью дифференцировки и экспрессией нестина. Были получены данные об экспрессии нестина на уровне транскрипции гена методом ПЦР-РВ, а также на уровне белка методом иммуноцитохимического окрашивания (Рис. 25, 26).
Сравнительный анализ уровня мРНК нестина в различных популяциях МСК (CD146+CD31- и CD146-CD31-) пупочного канатика и жировой ткани человека. Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени. (п=11). -различия достоверны (р 0,05) по отношению к контролю.
В CD 146- популяциях МСК из жировой ткани обнаружена транскрипция нестина на невысоком уровне, а в CD146+CD31- культурах транскрипция гена нестина отсутствует (Рис.25). Рисунок 26. Иїимуноцитохимическое окрашивание антителами к нестину. А, В МСК CD 146- CD 31-, выделенные из жировой ткани и пупочного канатика соответственно; Б, Г - MCK CD146+CD31-, выделенные из жировой ткани и пупочного канатика. Флуоресцентная микроскопия (XI00). В популяциях клеток из пупочного канатика CD146-CD31- и CD146+CD31- транскрипция нестина наблюдалась на высоком уровне, в 2, 5 раза выше, чем в CD146-CD31- популяциях жировой ткани.
Анализ экспрессии нестина в различных популяциях МСК на уровне белка методом иммуноцитохимического окрашивания подтвердил данные ПЦР-РВ. В клетках обеих популяций МСК из пупочного канатика был регистрирован белок нестина на высоком уровне (Рис.26 В, Г). В МСК CD 146- CD 31- из жировой ткани часть клеток содержали небольшое количество белка нестина по сравнению с МСК пуповины, а в CD146+CD31- культурах экспрессия нестина не обнаружена.
Таким образом, в процессе анализа зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин корреляция не обнаружена. CD146+CD31-популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался, эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин-продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдалась экспрессия нестина на высоком уровне, к активации транскрипции Insulin не приводила. Глава 5. Заключение
В настоящей работе впервые разработан метод получения функционально-активных инсулин-продуцирующих клеток из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека путем транзиентной трансфекции геном Pdxl с добавлением этапа культивирования в дифференцировочной среде. Проведен анализ зависимости эффективности дифференцировки в инсулин продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин. Корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался, эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин продуцирующие клетки. Трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдалась экспрессия нестина на высоком уровне, к активации транскрипции инсулина не приводила. Показано, что преимущественно дифференцировка в инсулин-продуцирующие клетки происходит в CD 146+CD31-популяциях МСК.
