Изучение репаративной активности в клетках человека, инфицированных вирусом Колонина Ирина Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Часть I. Обзор литературы

Глава I. Общие представления о процессах репарации ДНК в клетках человека и млекопитающих II

1.1. Виды репаративных систем и основные этапы репарации повреждений ДНК II

1.1.1. Дорепликативная репарация ДНК 12

1.1.2. Пострепликативная репарация ДНК 20

1.1.3. Репарация поврездений, затрагивающих обе нити ДНК в одной области 23

1.2. Роль структурной организации ДНК в процессах репарации 25

Глава 2. Генетический контроль и регуляция процесса репарации ДНК в клетках человека 29

2.1. Клетки людей с наследственными заболеваниями, характеризующимися нарушениями процесса репарации ДНК 29

2.2. Специфические ингибиторы репарации ДНК химической природы 36

2.3. Биологические факторы, влияющие на репарацию

ДНК 38

2.3.1. Модифицирующее действие вирусов на репаративные механизмы клеток 38

2.3.2. Стимуляция процессов репарации в клетках спомощью интерферонов 48

Стр. Глава 3. Краткая характеристика систем вирус - клетка, культивируемых in vitro при хронической вирусной инфекции 50

Заключение по обзору литературы 55

Часть II. Собственные исследования

Глава 4. Материалы и методы 57

4.1. Вирусы 57

4.2. Клеточные культуры 58

4.3. Получение клеточных культур, первично инфицированных вирусами 61

4.4. Мутагены 62

4.5. Обработка клеток мутагенами 63

4.6.' Определение выживаемости клеток 63

4.7. Радиоактивное мечение культуры клеток 63

4.8. Определение репаративной активности клеток методом хроматографии клеточных лизатов на колонках с гидроксиапатитом 64

4.9. Определение репаративной активности клеток методом щелочного градиентного центрифугирования 64

4.10. Калибровка градиентов 65

4.11. Математическая обработка результатов 65

Глава 5. Ингибирование эксцизионной репарации повреждений ДНК, индуцированных 4-нитрохинолин-І-оксидом, в клетках человека, хронически инфицированных вирусами 68

5.1. Клетки человека НЕр-2, хронически инфицированные вирусом краснухи 69

5.1.1. Подбор рабочей дозы и времени экспозиции 4-нитрохинолин-1-оксида 69

5.1.2. Репарация индуцированных 4-нитрохинолин-1~ок-сидом однонитевых разрывов ДНК в культурах клеток НЕр-2 и НЕр-2-ЕКр 77

5.2. Клетки человека НЕр-2, хронически инфицированные вирусом бешенства 80

5.3. Клетки человека Л-4І, хронически инфицированные вирусом паротита 81

5.4. Клетки человека НЕр-2, хронически инфицированные вирусом кори 83

5.5. Заключение 86

Глава 6. Различия в репарации индуцированных гамма-излучением, митомицином С и блеомицином повреждений ДНК в хронически инфицированных вирусами клетках человека 88

6.1. Репарация поперечных сшивок ДНК, индуцированных митомицином С, в клетках НЕр-2 и НЕр-2-ВКр 89

6.2. Репарация однонитевых разрывов ДНК, индуцированных гамма-излучением, в клетках НЕр-2 и

Л-4І, а также НЕр-2-ВКр, НЕр-2-ВБ, Л-4І-БП 93

6.3. Репарация повреждений ДНК, индуцированных блеомицином, в культурах клеток человека НЕр-2 и НЕр-2-ВКр 96

6.4. Заключение 99

Глава 7. Изучение влияния первичной вирусной инфекции на репаративную активность клеток

7.1. Репарация индуцированных 4-нитрохинолин-1-окси-дом повреждений ДНК в клетках человека Л-4І, первично инфицированных вирусом паротита 101

7.2. Репарация поврежденной 4-нитрохинолин-1-оксидом ДНК в клетках человека НЕр-2, первично инфицированных исходным штаммом и персистирущим мутантом вируса бешенства 102

7.3. Репарация поврелщении ДНК, индуцированных 4-нитрохинолин-І-оксидом, в клетках человека НЕр-2, пехівично инфицированных исходным штаммом и персистирущим мутантом вируса краснухи 102

7.4. Заключение 106

Глава 8. Обсуждение результатов 107

Выводы 115

Список литературы 117

Приложение . 146

• Виды репаративных систем и основные этапы репарации повреждений ДНК
• Клетки людей с наследственными заболеваниями, характеризующимися нарушениями процесса репарации ДНК
• Краткая характеристика систем вирус - клетка, культивируемых in vitro при хронической вирусной инфекции
• Получение клеточных культур, первично инфицированных вирусами
• Клетки человека НЕр-2, хронически инфицированные вирусом краснухи

Введение к работе

Актуальность темы. Эффективность и точность работы клеточных репаративных систем обусловливает нормальную жизнедеятель- и ность клеток организмов. Регуляция процессов восстановления ДНК в клетках представляет собой один из важных аспектов молекулярной генетики. Исследования, проводимые в этом направлении, позволяют изучить возможность повышения устойчивости клеток к экзогенным воздействиям различной природы. Известно, что ингибиторами различных этапов процесса репарации клеточной ДНК могут быть некоторые химические вещества (Downes et ai., 1983; park et al., 1983; Hausson et al., 1984 И др.). Кроме того, было установлено, что вирусы также оказывают влияние на репаративную активность клеток высших организмов (Засухина и др., 1975, 1979, 1983; Антоненко и др., 1982; waters, 1977 и др.). Характер влияния вирусов на репаративный потенциал клетки зависит от видовой принадлежности вируса, его генетической характеристики, ряда свойств клеток, типа течения вирусной инфекции, некоторых модифицирующих факторов. Исследование механизмов процесса репарации и его регуляции в клетках человека, хронически инфицированных вирусами, является одним из подходов к пониманию механизмов патогенеза заболеваний на молекулярном уровне.

Ранее было показано, что хроническое инфицирование перевиваемых клеток человека вирусом клещевого энцефалита ингибирова-ло репарацию УФ-индуцированных повреждений ДНК (Богомолова и др., 1974). Однако систематических исследований по выявлению роли и механизмов влияния хронической вирусной инфекции на репарацию ДНК в клетках человека не проводилось.

Известно, что люди, страдающие рядом наследственных болезней, вызванных различными дефектами репарации ДНК, характеризуются одной общей особенностью - высокой предрасположенностью к онкологическим заболеваниям ( bar-tram, 1980; Arlett, Lehmann, 1978; paterson, smith, 1979 и др.). Поэтому не исключено, что хронический тип течения вирусной инфекции, ингибирующий репарацию клеточной ДНК, также может быть связан с повышенным риском заболевания злокачественными новообразованиями. Широкое использование живых вакцин для вакцинации детей может в ряде случаев приводить к неадекватной иммунной реакции детского организма, т. е. к персистенции вируса и, таким образом, к развитию хронического инфекционного процесса. Вероятность развития неадекватной иммунной реакции особенно велика для детей с наследственными дефектами различных звеньев иммунной системы. Кроме того, возрастающее загрязнение окружающей среды может приводить к ин-гибированию специфических и неспецифических механизмов иммунитета, что будет отражаться на пониженной общей реактивности организма и высокой вероятности развития хронической вирусной инфекции. Поэтому выявление роли вирусного компонента в регуляции процессов репарации клетки и особенно молекулярных механизмов взаимодействия вирус - клетка представляет не только теоретический, но и большой практический интерес.

В связи с изложенным целью настоящей работы явилось изучение процессов репарации индуцированных мутагенами повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных неонко генными РЖ-содер-жащими вирусами, при различных типах течения инфекционного процесса.

В задачи исследования входило:

Изучение закономерностей процесса репарации повреждений ДНК, индуцированных 4-нитрохинолин-1-оксидом (классическим представителем мутагенов УФ-типа) в клетках человека (линии НЕр-2 и Л-4І), хронически инфицированных вирусами краснухи (штамм С-66, выделенный от больного), бешества (штамм МНИИВП-74, используемый для профилактики заболевания бешенством), кори (штамм Л-І6, используемый для вакцинации детей в СССР), паротита (штамм Л-3, также используемый для вакцинации детей в СССР).

Изучение особенностей репарации в клетках человека, хронически инфицированных вирусами краснухи, бешенства, кори и паротита при воздействии мутагенов с различным механизмом взаимодействия с ДНК (митомицин С, блеомицин, гамма-излучение).

Сравнительное изучение влияния типа течения вирусной инфекции (первичная инфекция, хроническая инфекция) при заражении клеток исходными штаммами и персистирующими мутантами вирусов краснухи, бешенства, паротита на репаративную активность клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые вскрыта общность феномена ингибирования процессов репарации повреждений ДНК, индуцированных 4-нитрохинолин-1-оксидом, для клеток человека, хронически инфицированных вирусами бешенства, краснухи, кори и паротита.

Получены доказательства, что подавление репаративной активности клеток происходит при длительном сосуществовании вируса и клетки. Первичное инфицирование клеток человека как исходными штаммами, так и персистирующими мутантами исследуемых вирусов не влияло на восстановление поврежденной мутагеном клеточной ДНК.

Получена новая модель клеток человека с ингибированной системой репарации - перевиваемые линии клеток человека (НЕр-2 и Л-4І), хронически инфицированные неонкогенными РНК-содержащими вирусами.

Часть I. Обзор литературы

Виды репаративных систем и основные этапы репарации повреждений ДНК

Функционирование репаративных систем живых организмов, обеспечивающих восстановление структуры молекулы ДНК после повреждающих воздействий различной природы, является одним из основных механизмов, поддерживающих стабильность генетической информации. Репарация ДІЖ была обнаружена в клетках прокариотов и эукариотов, однако наиболее полно этот процесс изучен у бактерий (Hanawalt et al., 1979, ±98i; uanesan et al., 1982 и ДР-).

Основные принципы работы репаративных систем в клетках человека и млекопитающих и в клетках прокариотов аналогичны, но на функционирование этих систем у эукариотов оказывает влияние ряд особенностей, присущих только клеткам высших организмов Cleaver, 1977, 1978; Fujuvara е al., 1977; hanawalt et al., 1979, 1981 и др.). 1С таким особенностям относятся: сложная структурная организация генетического материала клеток; высокал тканевая и клеточная специфичность, влияющая на чувствительность клеток к различным повреждающим воздействиям и на эффективность работы клеточных репаративных систем; невозможность однозначного перенесения результатов, получаемых in vitro, на уровень целого организма и некоторые другие факторы. Кроме того, в отличие от микроорганизмов, для РУІЄТОК человека и млекопитающих отсутствует достаточно широкий спектр картированных мутаций по различным этапам репарации, что значительно усложняет изучение репаративных механизмов в человеческих клетках.

Механизмы репарации ДНК можно условно подразделить по их соотношению с процессами репликации ДНК на до- и постреплика-тивные.

Клетки людей с наследственными заболеваниями, характеризующимися нарушениями процесса репарации ДНК

Генетический и биохимический анализ дефектных по репарации мутантов у бактерий позволил обнаружить существование разветвленной системы репарации в прокариотических клетках. Аналогичным подходом к изучению работы репаративных систем в клетках человека является выделение и исследование культур клеток людей, страдающих наследственными заболеваниями, при которых обнаруживаются нарушения в репарации повреждений ДНК. К таким заболеваниям относятся пигментная ксеродерма (ХР), атаксия телеангиэк-тазия (AT), анемия Фанкони (АФ), синдром Блюма (БС) и некоторые другие. Перечисленные заболевания характеризуются различными клиническими проявлениями, однако имеют следующие общие черты: повышенную чувствительность к повреждающим ДНК агентам; хромосомную нестабильность; высокую предрасположенность к злокачественным новообразованиям (Arlett, Lelmann, 1978; .tsootsma, 1978; betlow, 1978; Robbins, 1979; Засухина, 1983 и др.).

Пигментная ксеродерма. Основными клиническими признаками этого заболевания, наследуемого по аутосомно-рецессивному типу, являются повышенная чувствительность к солнечному излучению, приводящая к ожогам, гиперпигментации и раку кожи, и, в некоторых случаях, неврологические аномалии. Клетки больных ХР дефектны по репарации повреждений ДНК, индуцированных УФ-излуче-нием и некоторыми химическигли агентами, действующшли по УФ-типу ААФ, 4-НХО и др. (Bootsma et al., 1970; D Ambrosio, Setlow, 1978; Dollery et al., 1983). Генетические исследования клеточ-ныхрибридов фибробластов, полученных от различных больных, позволили выделить, по крайней мере, восемь комплементационных групп ХР - А, В, С ... G и ХР вариант (Arase et al., 1979; Cleaver, Bootsma, 1975). Клетки больных ХР комплементационных групп А - а обнаруживают пониженный уровень эксцизионной репарации. При этом обработка клеток комплементационных групп А - Е эндонуклеазой V фага Т4 увеличивает эффективность внепланового синтеза ДЖ до уровня контрольных клеток (Tanaka et al., 1975), что свидетельствует о нарушении этапа инцизии у больных ХР из этих комплементационных групп. Аналогичная обработка клеток группы р поднимала уровень внепланового синтеза лишь до половины контрольного (Hayakawa et al., 1981). По-ВИДИМОМу, КЛЄТКИ комплементационной группы F дефектны не только по этапу инцизии, но и по какому-либо ещё этапу (или этапам) эксцизионной репарации. Существование комплементационных групп А - G указывает на то, что для инициации эксцизионной репарации в клетках человека необходим сложный комплекс генных продуктов, регулирующий работу репаративного фермента или нескольких ферментов.

Краткая характеристика систем вирус - клетка, культивируемых in vitro при хронической вирусной инфекции

Хронически инфицированными считаются культуры, однократно зараженные вирусом и пассируемые в последующем на протяжении длительного срока (от нескольких месяцев до нескольких лет), в результате чего имеет место длительное сосуществование вируса и клетки. Хроническое инфицирование клетки вирусом приводит к образованию системы вирус - клетка, характеризующейся многокомпо-нентностью и гетерогенностью. В процессах становления хронической вирусной инфекции велика роль как вирусного компонента, так и клеточного, включающего в себя различные механизмы противовирусной защиты. Механизмы персистенции вируса в клетке-хозяине могут варьировать в зависимости от вида вируса и особенностей клеточной культуры. Однако для всех хронически инфицированных клеточных культур можно выделить одно общее свойство - пониженную продукцию инфекционного вируса. Современные представления о механизмах становления и течения хронической вирусной инфекции обобщены в ряде монографий и обзоров (Анджапаридзе, Богомолова, 1983; Зуев, 1979; Анджапаридзе и др., 198I и др.).

Среди защитных факторов клетки, обеспечивающих выживание клеточной популяции в период становления хронической вирусной инфекции, определяющую роль могут играть интерферон, а также дефектные интерферирующие вирусные частицы (ДИЧ) или температу-рочувствительные мутанты (ts-мутанты). В ряде клеточных систем имеют место ингибирование образования структурных белков вируса и нарушение сборки вириона, может также произойти селекция менее цитопатогенного варианта вируса и более резистентной популяции клеток. Выявлено, что в некоторых системах вирус - клетка может иметь место интеграция генома вируса с геномом клетки-хозяина.

Далее остановимся более подробно на роли каждого из перечисленных выше факторов в становлении и поддержании хронической вирусной инфекции.

Получение клеточных культур, первично инфицированных вирусами

Заражение клеток НЕр-2 вирусом бешенства. Клетки НЕр-2 заражали при пересеве в суспензию штаммом ВБ (ШИШІ-74) или пер-систирующим мутантом этого вируса с множественностью инфицирования I и 0,1 ЛЦзд/клетка, соответственно. Первично инфицированные вирусом бешенства клеточные культуры брали в опыт на 3-й день после заражения.

Заражение клеток НЕр-2 вирусом краснухи. Клетки НЕр-2 заражали при пересеве в суспензию штаммом БКр (G-66) или персистирующим мутантом этого вируса с множественностью инфицирования 0,3 и 0,02 БОЕ/клетка, соответственно. Так же как и в опытах с ВБ, первично инфицированные БКр клеточные культуры брали в опыт на 3-й день после заражения.

Заражение клеток Д-4І вирусом паротита. Заражение клеток JI-4I вирусом паротита проводили так же, как и заражение клеток НЕр-2 вирусами бешенства и краснухи, с множественностью инфицирования 0,1 ГАДЕзд/клетка. Первично инфицированную культуру брали в опыт на 3-й день после заражения.

Клетки человека НЕр-2, хронически инфицированные вирусом краснухи

Методом градиентного центрифугирования определяли профили седиментации клеточной ДНК для культур НЕр-2 и НЕр-2-ВКр и рассчитывали молекулярную массу. Как видно на рисунке 5.1, обе культуры давали сходные профили седиментации клеточной ДНК. Молекулярная масса ДНК для клеток обоих видов составляла 7,5 х х І02 Мщ.

Следовательно, хроническое инфицирование клеток НЕр-2 вирусом краснухи не оказывало влияния на величину молекулярной массы клеточной ДНК.

Для определения чувствительности клеточных культур НЕр-2 и НЕр-2-ВКр к 4-НХО клетки обрабатывали растворами мутагена в концентрациях от 1-Ю до 2«10 моль/л в течение 30 мин. Долю мертвых клеток в культурах определяли методом их витального окрашивания трипановым синим сразу после обработки мутагеном и после 20-часовой инкубации в ростовой среде.

Из таблицы 5.1 видно, что культуры клеток НЕр-2 и НЕр-2-ВКр практически не различаются по чувствительности к 4-НХО. При этом доля мертвых клеток при обработке культур 4-НХО в концентрациях 1 10 и 5-Ю моль/л была такой же, как и среди контрольных, не обработанных мутагеном клеток.