Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. Клеточные сигнальные пути в эндотелии 10
2.1. Роль эндотелия в физиологических функциях организма 10
2.1.1. Барьерная роль эндотелия сосудов 10
2.1.2 Роль молекул NF-kB и TLR. в осуществлении эндотелием барьерной функции 11
2.1.3 Роль актинового цитоскелета в осуществлении эндотелием барьерной функции 13
2.1.4. Влияние окислительного стресса на барьерную функцию эндотелия 16
2.2. Адгезивные свойства эндотелия 16
2.2.1. Роль молекулы адгезии РЕСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия 17
2.2.2. Роль молекулы адгезии ICAM-1 в физиологии клеток эндотелия 21
2.2.3. Роль молекулы адгезии VCAM-1 в физиологии клеток эндотелия 24
2.2.4. Роль селектинов (в частности, Е-селектина) в физиологии клеток эндотелия 26
2.3. Регуляторная функция эндотелия 29
2.3.1. Синтез и метаболизм N0 29
2.3.2. Роль эндотелиальной NO-синтазы в физиологии эндотелия 32
2.3.3. Роль индуцибельной NO-синтазы в физиологии эндотелия 33
2.3.4. Особенности выработки N0 и экспрессии iNOS и eNOS в клетках культуры эндотелия HUVEC 35
2.3.5. Образование в эндотелии активных форм кислорода и окислительный стресс 35
2.3.6. Апоптотические процессы в клетках эндотелия. Ключевые белки и регуляторы 38
2.3.7. Основные клеточные сигнальные пути, активирующиеся при действии окислительного стресса 39
2.4. Причины и роль дисфункции эндотелия в сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других заболеваниях 40
2.5. Действие на клетки фрагментов вкДНК разного состава 41
2.5.1. Содержание циркулирующей ДНК в крови людей в норме и при патологии 41
2.5.2 Структурные особенности вкДНК 43
2.5.3. Микроокружение циркулирующей ДНК 45
2.5.4. ДНК-узнающие рецепторы и их лиганды. Участие TLR-путей в работе клеток эндотелия в норме и при патологии 48
2.6. Заключение по данным литературы 50
3. Материалы и методы 52
3.1. Цитологические методы. Объект исследования 52
3.1.1. Выделение и культивирование клеток эндотелия 52
3.1.2 Добавление к эндотелию фрагментов ДНК 52
3.1.3. Облучение, обработка и инкубирование эндотелия 53
3.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода 53
3.1.5. Культивирование эндотелия для выявления эффекта свидетеля 53
3.1.6. Получение клеточных лизатов 54
3.2. Цитохимические методы 54
3.2.1 Иммуноцитохимическое определение актина 54
3.2.2 Иммуноцитохимическое определение белков TLR9, АІМ2, iNOS, eNOS, peNOS, NOX4, Ki-67, PCNA, p65(NF-kB) 55
3.2.3. Анализ изображений 55
3.2.4. Определение количества АФК методом проточной цитометрии 56
3.2.5. Определение содержания окиси азота в клетках методом проточной цитометрии 56
3.3. Получение и последующее определение свойств внеклеточной ДНК 57
3.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК из среды инкубации эндотелия/ сыворотки крови 57
3.3.2 Получение модельных фрагментов ДНК 58
3.4. Биохимические методы 58
3.4.1. Выделение РНК из эндотелия, определение ее концентрации и хранение 58
3.4.2. Выделение геномной ДНК из эндотелия, определение ее концентрации и хранение 59
3.4.3. Окисление фрагментов ДНК 60
3.4.4 Определение относительного содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) во вкДНК 60
3.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде методом Грисса 61
3.4.6 Определение количества метаболитов окиси азота в среде с помощью реагента CuFL 62
3.4.7. Методика ДНК комет (single cell gel electrophoresis) для определения содержания одно- и двунитевых разрывов в клетках HUVEC 62
3.4.8. Детекция двуцепочечных разрывов ядерной ДНК методом иммунофлуоресценции 63
3.5. Молекулярные методы 64
3.5.1 Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 64
3.6. Статистическая обработка 66
4. Результаты и обсуждение 68
4.1. Общая схема эксперимента 68
4.2. Характеристика образцов ДНК 68
4.2.1. Лиганды и ингибиторы TLR9 69
4.2.2. Окисленные формы ДНК 71
4.2.3. Характеристика циркулирующей ДНК плазмы человека в норме, при патологии и внешнем воздействии (ионизирующее излучение) 72
4.3. Локализация образцов экзогенной ДНК с различными свойствами в клетках HUVEC 74
4.4. Влияние GC-ДНК и ДНК0Х на экспрессию TLR9 76
4.4.1. Изменения количества мРНК TLR9 76
4.4.2. Изменения количества белка TLR9 79
4.5. Влияние GC-ДНК и ДНКох на экспрессию других ДНК-сенсоров 82
4.6. Изменение уровня АФК в HUVEC при действии различных образцов ДНК 85
4.6.1. Детекция количества АФК в HUVEC различными методами 85
4.6.2. Свойства вкДНК влияют на количество АФК в HUVEC 88
4.7. Свойства вкДНК влияют на количество мРНК N0X4 в HUVEC 93
4.8. Свойства вкДНК влияют на количество мРНК SOD1 в HUVEC 97
4.9. Изменение свойств вкДНК стимулирует образование разрывов геномной ДНК в клетках HUVEC 98
4.9.1. Анализ разрывов ДНК ядер HUVEC методом комет 98
4.9.2.Анализ разрывов ДНК ядер методом иммунофлуоресценции 101
4.10. Изменение свойств вкДНК приводит к нестабильности генома 105
4.11. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию клеток HUVEC.. 109
4.12. Изменение свойств вкДНК влияет на уровень гибели клеток HUVEC. 115
4.13. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC 117
4.14. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина 125
4.15. Изменение адгезивных свойств HUVEC при изменении свойств вкДНК127
4.16. Активация транскрипционного фактора NF-kB при изменении свойств вкДНК 130
4.16.1. Изменение количества мРНК основных генов пути, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, при изменении свойств вкДНК среды культивирования HUVEC 130
4.16.2. Изменение количества белка р65 и локализации его в клетках при изменении свойств вкДНК 132
5. Заключение 137
6. Выводы 141
Список сокращений и условных обозначений 143
Список литературы 144
- Роль молекулы адгезии РЕСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия
- Изменения количества мРНК TLR9
- Изменение свойств вкДНК приводит к нестабильности генома
- Изменение количества белка р65 и локализации его в клетках при изменении свойств вкДНК
Введение к работе
Актуальность темы. Циркулирующая внеклеточная ДНК (вкДНК) присутствует в кровотоке и других биологических жидкостях как здоровых, так и больных людей. ВкДНК активно взаимодействует с клетками организма (Gahan P. et al., 2010). В настоящее время неясно, какие именно внутриклеточные процессы протекают под действием фрагментов вкДНК в эндотелии, и как состав этой ДНК влияет на активацию того или иного внутриклеточного каскада в клетке.
Исследования в этой области проводятся на различных культурах клеток, оцениваются характеристики вкДНК, циркулирующей в крови здоровых людей, больных сердечно-сосудистыми и аутоиммунными заболеваниями, больных раком (Pisetsky D.S. et al., 2011). В области механизмов действия вкДНК в клетках эндотелия известно немногое. Показано, что ДНК влияет на эндотелиоциты путем взаимодействия с двумя типами рецепторов (известные TLR9 и гипотетические, X), которые для передачи сигнала используют один и тот же белок - адаптер MyD88 (Костюк СВ. и др., 2010). Имеются данные о том, что ДНК и гистоны, входящие в состав циркулирующей ДНК, активируют другие рецепторы группы TLR, вызывая продукцию интерлеикинов и иммунный ответ (Cherepanova A.V. et al., 2011).Однако все эти данные не дают ясного понимания механизма взаимодействия клеток эндотелия с вкДНК и необходимо дальнейшее изучение вопроса. Эти исследования важны для понимания механизмов системного повреждения сердечнососудистой системы у пациентов с различными заболеваниями, в развитие которых может быть вовлечена вкДНК.
В настоящей работе впервые оценено, какие именно характеристики вкДНК стимулируют стрессовый ответ и адаптивную реакцию в клетках эндотелия.
Цель исследования. Охарактеризовать ответ эндотелиальной клетки на изменение таких свойств внеклеточной ДНК, как концентрация, GC- состав и уровень окислительной модификации.
Задачи исследования.
-
Сформировать рабочую выборку образцов ДНК из различных источников. Охарактеризовать их свойства (GC-состав и уровень окисления оснований);
-
Определить локализацию в клетках эндотелия культуры HUVEC образцов экзогенной ДНК с различными свойствами;
-
Исследовать влияние образцов ДНК с различными свойствами на следующие показатели состояния эндотелиальной клетки (HUVEC): уровень активных форм кислорода (АФК) и NO; разрывы в ДНК хроматина; пролиферативная активность клеток; показатели гибели клеток; изменения цитоскелета; активация транскрипционного фактора NF-kB.
Научная новизна. Впервые обнаружено, что клетки эндотелия быстро реагируют на изменение свойств вкДНК. Ранний ответ клеток заключается в синтезе
4 большого количества АФК и возникновении одно- и двунитевых разрывов ДНК хроматина ядер, что приводит к остановке клеточного деления. Впервые показано, что окисленная и CG-богатая ДНК, так же как и ДНК людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями, действует на клетки эндотелия через ТЫ19-рецепгоры, и, возможно, через другие ДНК-узнающие сенсоры. Действие вкДНК на эндотелиальные клетки сопровождается активацией стрессового сигнального каскада с вовлечением транскрипционного фактора NF-kB. Впервые обнаружено, что при изменении свойств вкДНК в клетках эндотелия наблюдается формирование стресс-фибрилл актина. Впервые высказано предположение, что свойства циркулирующей ДНК могут являться мишенью для терапии при профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные позволяют по-новому осознать роль циркулирующей ДНК в развитии некоторых заболеваний и в адаптивном ответе организма на неблагоприятные условия. Представляется возможным разработать направления ранней диагностики заболеваний, основываясь на описанных в данной работе эффектах, проявляющихся в клетках эндотелия в ответ на действие различных фрагментов вкДНК. Окисленные фрагменты ДНК, циркулирующие в большой концентрации в кровотоке людей с сердечно-сосудистыми, аутоиммунными, раковыми заболеваниями, могут послужить в качестве мишени для терапии.
Положения, выносимые на защиту
-
Изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления внеклеточной ДНК индуцирует в клетках эндотелия HUVEC увеличение экспрессии гена N0X4 и синтез активных форм кислорода (АФК). Это сопровождается блокированием деления клеток в G1-, S- и G2/M - фазах клеточного цикла.
-
Окислительный стресс, вызванный действием внеклеточной ДНК, стимулирует в клетках эндотелия образование одно- и двунитевых разрывов ДНК HUVEC, что приводит к нестабильности генома, признаками которой являются образование микроядер, фрагментация хроматина и выпячивание ядерной мембраны. На фоне деструктивных процессов включаются репаративные механизмы, направленные на снижение апоптотической активности.
-
В ответ на изменение концентрации, GC-состава и уровень окисления внеклеточной ДНК в клетках эндотелия происходит стимуляция транскрипционного фактора NF-kB. Способность образцов вкДНК активировать NF-kB уменьшается в ряду: GC-ДНК > геномная ДНК > окисленная геномная ДНК.
-
Внеклеточная ДНК влияет на экспрессию гена eNOS на уровне мРНК eNOS, белка eNOS и продукта N0 в клетках эндотелия. Кроме того, GC-ДНК и окисленная ДНК стимулируют в HUVEC структурные изменения клеточного матрикса: наблюдается синтез стресс-волокон полимерного актина и меняется экспрессия мРНК генов молекул адгезии (ICAM1, РЕСАМ1, SELE и VCAM1).
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VII международной конференции «Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum» (Мадрид, 2010); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); на XIII международной конференции «The Leiden International Medical Student Conference» (Лейден, 2011); на XIX и XX международных конференциях «International Student Congress of (Bio)Medical Sciences» (Гронинген, 2012, 2013). Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Федерального государственного бюджетного
5 учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, протокол № 9 от 26.07.2013.
Личный вклад автора. Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Соискатель лично принимал участие в планировании экспериментов, самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, а также из клеток культуры эндотелия. Подбор необходимых условий в методиках, осуществление подготовки и выполнения основных экспериментов автором выполнены самостоятельно. Соискатель провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.
Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 307 источников, из них 7 отечественных и 300 зарубежных авторов. Работа изложена на 184 листах машинописи. Текст содержит 50 рисунков и 4 таблицы.
Роль молекулы адгезии РЕСАМ-1 в физиологии клеток эндотелия
Клетки эндотелия содержат на своей поверхности молекулы адгезии тромбоцитов к эндотелию (Platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PEC AM-1 или CD-31), которые участвуют в образовании межклеточных контактов как в самом эндотелии, так и во взаимодействиях с клетками и постклеточными структурами в кровотоке. Эти же молекулы встречаются на поверхности тромбоцитов, моноцитов, нейтрофилов и некоторых Т-клеток. Уровень экспрессии РЕСАМ-1 в этих клетках гораздо меньше, чем в эндотелии, что позволяет использовать CD-31 как маркер клеток эндотелия. Так, РЕСАМ-1 не экспрессируется в клетках, не связанных с сердечно-сосудистой системой: в мышцах, эпителии, фибробластах (Privratsky et al., 2010).
РЕСАМ-1 (CD-31) - это трансмембранный белок из суперсемейства иммуноглобулинов (Newman et al., 1990) Полноценная молекула CD-31 содержит короткий N-концевой пептид, за которым следует 6 иммуноглобулиновых доменов, далее следует небольшой трансмембранный домен. В цитоплазме находятся 2 хвостовых иммунотирозин-основных ингибирующих мотива (ITIM), опосредующих внутриклеточный сигналинг: они имеют специфические сайты фосфорилирования и связывания цитозольных сигнальных молекул (van Buul et al., 2008). Хотя изначально считалось, что CD31 является только активирующей адгезию молекулой, дальнейшие исследования выявили, что CD-31 может вызывать ингибирование сигналинга через определенные участки молекулы в ходе межклеточного взаимодействия (Newman et al., 1997).
Существуют доказательства того, что РЕСАМ-1 играет немаловажную роль в адгезивном каскаде реакций, приводящем к миграции лейкоцитов в ткани во время воспалительного процесса. Блокирование эндотелиальных молекул РЕСАМ-1, равно как и лейкоцитарных, эффективно ингибировало процессы свертывания и воспаления (Garrido-Urbani et al., 2008), а также аккумуляцию лейкоцитов в очаге воспаления (Vaporciyan et al., 1993).
Эта молекула экспрессируется на поверхности лейкоцитов, что необходимо для удачной миграции лейкоцита в ткани. В литературе говорится о том, что лейкоциты, в достаточной мере экспрессирующие молекулу CD-31, более успешно проникают в места воспаления (Goodman et al., 2008). После того, как лейкоциты попадают на ту часть эндотелия, к которой они могут прикрепиться, они распластываются и проникают сквозь клеточный монослой и базальную мембрану к месту воспаления. РЕСАМ-1 принимает участие во всех стадиях этого процесса (Nakada et al., 2000; Glen et al., 2008; Akers et al., 2010; Luu N et al., 2012).
Взаимодействия между молекулами РЕСАМ-1 на поверхности эндотелия и лейкоцитов являются лишь одним из видов межклеточного взаимодействия. Они также способны взаимодействовать с другими молекулами кластеров дифференцировки, например с CD-I77 на поверхности нейтрофилов (Sachs et al., 2007).
Кроме участия в трансмиграции лейкоцитов, эта адгезивная молекула также выполняет ряд других функций при воспалении. Известно, что белок РЕСАМ-1 способен ослаблять воспалительную реакцию во множестве моделей острого или хронического воспаления у мышей, включая линии животных с аутоиммунными заболеваниями (Wilkinson et al., 2002), индуцированным липополисахаридами септическим шоком (Maas et al., 2005), атеросклерозом и др. (Goel et al., 2008).
Есть основания полагать, что РЕСАМ-1 оказывает свое антивоспалительное действие посредством трех основных механизмов:
1) Повышает барьер активации лейкоцитов, влияя на них в качестве ингибирующего рецептора (Szekanecz et al., 2004)
2) Помогает восстановить и усилить межклеточную барьерную функцию эндотелия (Carrithers et al., 2005)
3) Снижает продукцию провоспалительных цитокинов (Privratsky et al., 2012).
В свою очередь, выработка провоспалительных цитокинов, таких как ФНО- х, снижает экспрессию РЕСАМ-1 как на уровне мРНК, так и на уровне белка в эндотелии (Sawa et al., 2007).
Ранее Cepinskas и соавт. высказали идею о том, что молекулы РЕСАМ-1 вовлечены в процессы трансмиграции лейкоцитов посредством влияния на экспрессию и активацию транскрипционного фактора NF-KB И его транспорт в ядро клеток эндотелия (Cepinskas et al., 2003). Это позволяет предложить такой механизм: ингибирование транслокации транскрипционного фактора в ядро инициирует петлю отрицательной обратной связи. В свою очередь, это предотвращает вовлечение лейкоцитов в воспалительные процессы, снижая NF-кВ-зависимую продукцию провоспалительных молекул адгезии на поверхности клеток эндотелия. Известно, что РЕСАМ-1 является частью специфического механосенсорного комплекса, который реагирует на окислительный стресс в эндотелии. Было обнаружено, что РЕСАМ-1 в кооперации с VE-кадгерином вызывает PDK/Akt-зависимую активацию интегринов, стимулирует полимеризацию актиновых филаментов и активирует NF-kB-зависимый каскад. (Tzima et al., 2005).
Однако в сериях экспериментов других исследователей это предположение было опровергнуто. Данные ученых говорят о том, что молекула РЕСАМ-1 не оказывает значимого влияния на предложенный механизм (Privratsky et al., 2010).
Тем не менее, способность клеток эндотелия отвечать на стресс зависит не только от РЕСАМ-1, но и от VE-кадгерина, выполняющего роль адаптера РЕСАМ-1, а также от рецептора 2 типа фактора роста сосудистого эндотелия VEGFR2, через который активируется киназа PI3K, активирующая, в свою очередь, транскрипционный фактор NF-кВ (Pasparakis, 2012). В экспериментах, проведенных на мышах, было выявлено, что РЕСАМ-1 способен индуцировать внутриклеточный сигнал в ответ на механическое воздействие в случае модели атеросклероза. Этот сигнал приводит к активации NF-kB, последующей выработке провоспалительных генов в местах нарушенного кровотока, а также запускает процессы реорганизации сосудов (Chen et al., 2009).
Таким образом, мы видим, что РЕСАМ-1 может вызывать строго противоположные эффекты. Нельзя сказать, что один из путей - это результат технической ошибки исследователей. Скорее, выбор пути действия зависит от ситуации, от того, в каком органе происходят эти процессы, какая (клеточная или животная) модель использована для эксперимента, какие воспалительные стимулы были использованы изначально.
Исследования, ведущиеся в направлении изучения роли РЕСАМ-1 в развитии атеросклероза, дают понять, что огромную роль играет также изоформа экспрессирующегося белка клеточной адгезии (Privratsky et al., 2011).
Белок РЕСАМ-1 также вовлечен в регуляцию активности eNOS, конститутивно экспрессируемой в эндотелии и служащей для выработки оксида азота, который играет ключевую роль в регуляции диаметра просвета сосудов и многих других событий. Существуют данные о том, что в нокаутной по РЕСАМ-1 культуре клеток эндотелия базовый уровень синтеза оксида азота достоверно снижен по сравнению с таковым в нормальном эндотелии. Что касается механизма, лежащего в основе этих процессов, то можно предположить, что сниженная активность eNOS связана с угнетением в ингибиторных взаимодействиях eNOS с белком кавеолином-1 и со сниженной экспрессией белка eNOS traffic inducer (NOSTRIN) в отсутствии РЕСАМ-1.
Основываясь на данных своих экспериментов, авторы работы полагают, что активация белков STAT3 в отсутствие РЕСАМ-1 как раз приводит к снижению экспрессии NOSTRIN через непосредственное связывание сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции с промотером в гене белка NOSTRIN (McCormick et al., 2011).
Необходимо также упомянуть и об участии РЕСАМ-1 в развитии атеросклероза. Эксперимент был проделан на мышах, подверженных атеросклерозу, одна из групп была нокаутной по гену РЕСАМ-1, другая же экспрессировала его в нормальных количествах. В ходе опыта было обнаружено, что нокаутные мыши имели меньшее количество повреждений кровеносной системы в ходе заболевания. Кроме того, снижение экспрессии РЕСАМ-1 в межклеточном пространстве приводило к снижению выработки других адгезивных молекул, т.к. ICAM-1. Это позволяет предположить, что недостаточность РЕСАМ-1 может носить атеропротекторный характер (Stevens et al., 2008).
Таким образом, если в нормальных условиях интактный эндотелий экпрессирует адгезивные молекулы менее интенсивно, то при его активации под действием изменения условий в кровотоке наблюдается рост экспрессии таких молекул, как РЕСАМ, ICAM-1, VCAM-1, Е-селектина и др. В таких условиях лимфоциты, тромбоциты и даже эритроциты способны прикрепиться к клеткам эндотелия. Это может вести к воспалению, повышенной свертываемости крови в данном месте сосуда, дальнейшей его закупорке и последующей ишемии данного участка ткани (Vestweber, 2012).
Изменения количества мРНК TLR9
TLR9 В среду культивирования субконфлуентной культуры HUVEC добавляли следующие образцы ДНК:
(1) p(rDNA) в концентрации 1-250 нг/мл;
(2) p(satlll) в концентрации 5-50 нг/мл;
(3) ДНК e.coli в концентрации 5-50 нг/мл; (4-7) вкДНКоим(/-б) в концентрации 5 нг/мл;
(8) гДНК в концентрации 5 и 50 нг/мл;
(9) гДНКох (гДНКОХ2) в концентрации 50 нг/мл;
(10) p(rDNA)ox в концентрации (50нг/мл).
Клетки культивировали 3 часа и выделяли РНК. Далее определяли количество РНК TLR9 (Рисунок 4-3).
Бактериальная ДНК, как и следовало ожидать, стимулировала экспрессию TLR9 в эндотелиальных клетках - количество мРНК TLR9 возрастало в 1,3-2,8 раза. Модельные образцы p(rDNA) и p(satlll) в концентрации 50 нг/мл стимулировали увеличение количества мРНК TLR9 примерно в 2 раза. Образец вкДНК (1 или I) с низким содержанием GC-ДНК не влиял на количество мРНК TLR9, но образцы 2-6 с высоким содержанием маркерных GC-ДНК (Булычева и соавт., 2008) стимулировали увеличение количества мРНК TLR9 в 2-2,5 раза. Геномная ДНК в меньшей степени влияет на количество мРНК TLR9. Интересно отметить, что p(rDNA) и p(satlll) в концентрации 5 нг/мл снижали уровень мРНК TLR9 более чем в 2 раза. Этот эффект, по-видимому, не связан с ингибированием TLR9, т.к. p(satlll) не содержит последовательностей-ингибиторов TLR9.
Таким образом, пробы ДНК, содержащие последовательности GC- ДНК, в концентрации 50 нг/мл в течение первых часов культивирования увеличивают уровень экспрессии TLR9, аналогично бактериальной ДНК. Образцы вкДНК больных с высоким содержанием GC-ДНК стимулируют экспрессию TLR9 уже в концентрации 5 нг/мл. Окисление ДНК способствует увеличению ее стимулирующего действия на экспрессию TLR9. В присутствии гДНКох и p(rDNA)ox в клетках синтезируются бОльшие количества мРНК TLR9, чем при действии на клетки неокисленных образцов (Рисунок 4-3).
При хронических заболеваниях, таких, как ишемическая болезнь сердца, в составе вкДНК постоянно увеличено содержание GC-ДНК, в частности рибосомного повтора (Булычева и соавт., 2008). В этом случае можно ожидать развития компенсаторной реакции эндотелиальных клеток, направленной на снижение уровня экспрессии TLR9. Это предположение, было проверено путем анализа уровня мРНК TLR9 через 24 - 72 часа культивирования в присутствии 50 нг/мл образцов ДНК (Рисунок 4-4).
Данные рисунка 4-4 говорят о том, что увеличение экспрессии TLR9 в ответ на изменение свойств вкДНК носит транзиторный характер и наблюдается в первые сутки после изменения. В дальнейшем уровень экспрессии гена этого рецептора практически не изменяется.
Изменение свойств вкДНК приводит к нестабильности генома
Транзиторное увеличение количества двунитевых разрывов ДНК, которое наблюдается в течение 0,5-2 часов после резкого изменения свойств циркулирующей вкДНК (Рисунок 4-25, 1-4).
При попадании в среду культивирования окисленных или GC- богатых фрагментов вкДНК, создаются условия для проявления признаков нестабильности генома. К таким признакам относят образование микроядер, выпячивание ядерной мембраны, образование мостиков хроматина между ядрами. Все перечисленные признаки были проанализированы в клетках, которые инкубировали в течение 1 часа с различными образцами ДНК (гДНК, гДНКох, p(rDNA), p(rDNA)ox и вектором pBR322), введенными в среду культивирования в концентрации 50 нг/мл. Все образцы вызывали изменения, отражающие образование микроядер.
В литературе предполагается, что признаки геномной нестабильности возникают в процессе митоза и характерны для делящихся клеток (Aguilera , Gomez-Gonzalez, 2008). Однако не было обнаружено достоверных отличий в уровне микроядер в пролиферирующей или конфлюэнтной популяции клеток. Также не удалось обнаружить мостиков хроматина между ядрами, которые образуются в делящейся клетке в процессе митоза. Вероятнее всего, образование микроядер происходит необязательно в пролиферирующих клетках и связано с наличием двунитевых разрывов хроматина в примембранной области ядра клетки, в которой был индуцирован окислительный стресс.
Образование микроядер можно наблюдать на микрофотографиях 1-4 на рисунке 4-25. Сначала происходит выпячивание хроматина (1), затем вблизи ядерной мембраны выделяются отдельные гранулы (2), далее гранулы переносятся от ядра в цитоплазму (3) и могут выйти за пределы клеточной мембраны (4). В пользу высказанной гипотезы говорит тот факт, что все клетки, которые продуцировали микроядра, содержали двунитевые разрывы ДНК и окрашивались антителами к гистону у-Н2АХ, равно, как и сами микроядра (Рисунок 4-25, 7-9).
Помимо образования микроядер, также наблюдалась необычная картина фрагментации хроматина ядер (Рисунок 4-25, 5), которая отличалась от классической картины апоптоза с образованием участков конденсированного хроматина (Рисунок 4-25, пример 6). Фрагментация ядер не сопровождалась конденсацией хроматина, но приводила к образованию большого числа микроядер, которые могли выходить из клетки в межклеточную среду.
На рисунке 4-26 А приводятся количественные данные - частота клеток, которые содержат признаки нестабильности генома (микроядра и необычная фрагментация с образованием микроядер).
Максимальный эффект наблюдался в случае окисленных образцов гДНК и GC-ДНК. Данный эффект был подтвержден при получении результатов методом проточной цитометрии (Рисунок 4-26, Б). На рисунке (а) приводится распределение клеток по количеству ДНК. В популяции присутствуют клетки, фрагменты клеток со сниженным содержанием ДНК, а также микроядра различного размера (фракция subGl). Окисленные образцы ДНК вызывают увеличение размера фракции subGl уже в первые 30 минут после введения в среду культивирования HUVEC. Неокисленные образцы ДНК действуют медленнее — увеличение количества гиподиплоидных структур в популяции наблюдается через 1 час инкубации клеток с фрагментами ДНК. При длительном культивировании клеток с образцами ДНК количество гиподиплоидных клеток/частиц снижается до уровня контроля и ниже (в случае p(rDNA)). Чтобы оценить, насколько существенен вклад апоптоза в появление фракции гиподиплоидных клеток, была проведена оценка количества клеток с признаками апоптоза. Для этого использовался белок анексин 5, который взаимодействует с фосфадитил-сериновыми остатками на поверхности клетки, находящейся на ранней стадии апоптоза. Было обнаружено, что спустя 30 минут после изменения свойств вкДНК в популяции сокращается количество клеток с признаками апоптоза, однако через 3 часа количество таких клеток увеличивается. Следовательно, увеличение количества гиподиплоидных клеток сопровождается снижением количества апоптотических клеток, т.е. гиподиплоидные клетки/частицы появляются в среде не в результате апоптоза.
Таким образом, с помощью двух независимых методов мы зафиксировали быстрое образование дополнительных гиподиплоидных клеток/частиц в популяции HUVEC при изменении свойств ДНК среды культивирования.
Изменение количества белка р65 и локализации его в клетках при изменении свойств вкДНК
Одним из признаков активации NF-kB, как транскрипционного фактора, является его транслокация из цитоплазмы в ядро. На рисунке 4-39 представлены результаты анализа методом флуоресцентной микроскопии клеток, которые культивировали в течение часа в присутствии образцов ДНК (50 нг/мл). Фиксированные клетки окрашивали антителами к белку р65 - субъединице транскрипционного фактора NF-kB, ядра окрашивали красителем DAPI.
В контрольных клетках содержалось немного белка р65, и он был локализован в цитоплазме. Геномная ДНК и бактериальный вектор стимулировали увеличение количества р65 в цитоплазме клеток, где он детектировался в составе отдельных гранул. Плазмида p(rDNA) вызывала увеличение количества р65 в клетках, причем практически весь белок был локализован в клеточном ядре. Количество р65 значительно увеличивалось при культивировании HUVEC с образцами окисленной ДНК. Он накапливается преимущественно в цитоплазме клеток, что говорит о его неактивном состоянии.
Также было отмечено, что белок р65 локализован и в ядрах клеток, но картина его распределения значительно отличается от картины, наблюдаемой в клетках, подвергшихся воздействию p(rDNA). Более детальный анализ показал, что р65 локализуется в ядрышках клеток (Рисунок 4-40).
Таким образом, наблюдалось интересное событие - секвестирование белка в ядрышке. Этот эффект ранее был описан для других ядерных белков. При переходе клетки в неактивное состояние ядерные белки мигрируют в структуры ядрышка и становятся неактивными (Cardoso, Leonhardt 1998, Mijatovic et al., 2008). При изменении условий функционирования клеток возможен обратный процесс - миграция этих факторов из ядрышка в ядро. Рибосомный повтор содержит значительное количество сайтов связывания белка р65 (Вейко, 2001). Локализация белка в ядрышкообразующих районах (ЯОР), где расположены только рибосомные повторы, исключает его активность как транскрипционного фактора. Таким образом, не смотря на высокий уровень экспрессии белка и проникновение фактора в ядро, его локализация в ЯОР позволяет предположить слабую активность NF-kB в присутствии окисленной ДНК.
Было также проанализировано влияние образцов вкДНК больных ОИМ на активность транскрипционного фактора NF-kB. Образец вкДНКоиш вызывал в клетках такую же направленность распределения р65, как неокисленный образец гДНК: слабое увеличение окрашивания цитоплазмы клеток. Образцы вкДНК0ИШ и вкДНКоиш вели себя как окисленная гДНК — увеличивали уровень р65 и стимулировали его накопление в цитоплазме и ЯОР. Было известно, что вкДНК содержит высокий процент окисленных оснований (примерно 400 на миллион нуклеозидов).
Еще одним маркером, отражающим активность фактора NF-kB, является фосфорилирование компонентов фактора, в частности р65. Известно, что NF-кВ(р65) в присутствии активаторов, например, TNFa, фосфорилирован по остатку Ser529(p65) ферментом казеинкиназой II (Wang , Baldwin, 1998).
Было проанализировано содержание фосфорилированной формы р65 в клетках. Для этого использовались соответствующие антитела и метод проточной цитометрии. Через 48 часов культивирования клеток в присутствии 50 нг/мл гДНК, p(rDNA) и двух образцов вкДНК больных ОИМ наблюдалось повышенное содержание фосфорилированной формы р65. Окисленная гДНК, вектор и образец вкДНК0ИШ не вызывали такого эффекта (Рисунок 4-41).
Суммируя полученные по этому разделу данные, можно сделать следующие выводы:
(1)Все образцы фрагментов ДНК стимулируют увеличение экспрессии компонента фактора NF-kB на уровне мРНК и самого белка. Механизм увеличения количества р65 зависит от свойств вкДНК. Окисленная ДНК в меньшей степени влияет на процесс транскрипции гена NFKB1, но вызывает значительное накопление р65 в клетках;
(2) GC-богатый рибосомный повтор, активирует NF-kB в наибольшей степени. Окисленная гДНК менее активный стимулятор NF-kB и действует менее продолжительное время. Окисление ДНК сопровождается снижением способности гДНК активировать фактор транскрипции NF-kB; (З)вкДНК, выделенные из плазмы крови людей, перенесших инфаркт миокарда, в разной степени увеличивали активацию и транспорт в ядро NF-kB. Это можно объяснить динамичным составом пула вкДНК в плазме крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями (Arnalich2010).
