Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы (Внеклеточная ДНК – биологически активная молекула) 16
1.1. Свойства внеклеточной ДНК 17
1.1.1. Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК 17
1.1.2. Концентрация вкДНК 21
1.1.3. Фрагментация вкДНК 23
1.1.4. Содержание различных последовательностей в составе вкДНК 26
1.1.5. Эпигенетические модификаци вкДНК: метилирование фрагментов вкДНК 30
1.1.6. Окислительная модификация оснований вкДНК 31
1.1.7. Свойства вкДНК определяют ее характеристики как маркера при
патологии и при опасных для генома воздействиях 1.1.7.1. Применение вкДНК в качесве маркера ранней диагностики в
онкологии 1.1.7.2. Применение вкДНК в качесве маркера в пренатальной диагностике,
транспланталогии и других областях диагностики 1.2. Происхождение вкДНК. Механизм появления вкДНК в циркуляции 42
1.3. Формы существования вкДНК 48
1.4. Биологическая активость вкДНК 53
1.4.1. ВкДНК как активатор иммунных реакций 53
1.4.2. ВкДНК как фактор стресс-сигнализации в индуцированном
ионизирующей радиацией эффекте свидетеля 1.5. Способы проникновения вкДНК внутрь клетки 58
1.6. Внутриклеточные рецепторы, опознающие фрагменты вкДНК 60
1.6.1. Белки семейства TLR – сенсоры фрагментов вкДНК 61
1.6.1.1. Общая характеристика белков TLR 61
1.6.1.2. Природные и синтетические лиганды TLR9 64
1.6.1.3. Ингибиторы взаимодействия CрG -ДНК с TLR9 67
1.6.1.4. Механизм доставки лигандов к TLR, расположенным на эндосомах 70
1.6.1.5. Шапероны – роль в подготовке и перемещении TLR в эндосомы 75
1.6.1.6. Как иммунная система отличает нуклеиновые кислоты
болезнетворных микроорганизмов и собственные нуклеиновые кислоты 1.6.2. Другие рецепторы - кандидаты на роль связывания вкДНК 82
1.6.2.1. ZBP1 или DAI – сенсор цитозольной ДНК 84
1.6.2.2. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 85
1.6.2.3. AIM2 и инфламмасома 1.7. Внеклеточная ДНК – индуктор окислительного стресса в клетках 88
1.7.1. Роль фермента NOX4 в синтезе активных форм кислорода,
индуцированном вкДНК 1.8. Внеклеточная ДНК принимает участие в регуляции клеточного цикла 92 1.9. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, активирующиеся в клетках 96
при действии внеклеточной ДНК
1.9.1. Внеклеточная ДНК вызывает активацию транскрипционного фактора
NF-kB 1.9.2. Внеклеточная ДНК вызывает активацию ядерного фактора NRF2 100
1.9.3. Взаимодействие между NRF2 - и NF-kB - сигнальными путями 102
1.10. Заключение по данным литературы 104
2. Материалы и методы. 106
2.1. Анализируемая выборка 106
2.2. Выделение внеклеточной ДНК 106
2.3. Определение концентрации и размеров фрагментов ДНК вкДНК 107
2.4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК
107
2.5. Определение нуклеазной активности 108
2.6. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах 108
2.7. Культивирование мезенхимных стволовых клеток (МСК) 109
2.8. Культивирование HUVEC (клеток эндотелия из вены пуповины) 109 2.9 Культивирование фибробластов 109
2.10. Выделение лимфоцитов 109
2.11. Приготовление образцов ДНК 110
2.12. Определение количества активных форм кислорода 111
2.13. Определение уровня окиси азота в клетках 111
2.14. Определение количества нитритов и нитратов (метаболитов окиси азота)
в среде культивирования
111
2.15 Определение f-актина 111
2.16. Определение содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) в 112
составе вкДНК
2.17. Определение одно- и двуцепочечных разрывов ДНК в клетках. Метод 112 ДНК-комет (single cell gel electrophoresis)
2.18. Определение двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток методом 112 иммунофлуоресценции
2.19. Анализ разрывов ДНК в клетках методом TUNEL 113
2.20. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 113
2.21. Определение ферментативной активности каспазы 3 113
2.22. Определение уровня экспрессии белков 114
2.23. Ингибирование TLR9 клеточного пути 114
2.24. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 114
2.25. Статистическая обработка результатов 118
3. Результаты и обсуждение 119
3.1. свойства внеклеточной ДНК. Поиск свойств, определяющих 1 1 9
биологическую активность вкДНК
3.1.1. Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса
3.1.1.2. Концентрация вкДНК зависит от нуклеазной активности плазмы крови 124
3.1.2. Длины фрагментов внДНК 126
3.1.3. Концентрация повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови
127
3.1.3.1. ГЦ-богатая последовательность рибосомного повтора накапливается в составе вкДНК
130
3.1.3.2. Содержание АТ-богатой последовательности генома в циркулирующей вкДНК плазмы крови лиц, подвергавшихся 133
профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения снижено по сравнению с контрольной группой
3.1.4. Окислительная модификация вкДНК 135
3.1.5. Фрагменты рДНК, накапливающейся в составе вкДНК, образует в крови комплексы с антителами
3.1.5.1 Титры антител к рДНК в выборке облученных лиц выше, чем в контрольной 141
3.2. Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность генома гистологически различных культивируемых клеток человека с разным 143
пролиферативным потенциалом
3.2.1. Общая схема эксперимента 143
3.2.2. Характеристика культивируемых клеток 144
3.2.3. Характеристика образцов вкДНК и модельных фрагментов 146
3.2.4. Локализация окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК в клетках разных типов 152
3.2.5. Изменение уровня активных форм кислорода в разных типах клеток при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 156
3.2.5.1. Количество АФК в HUVEC определяется свойствами вкДНК 157
3.2.5.2. Синтез АФК в МСК при воздействии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК 165
3.2.5.3. Окисленные вкДНК индуцируют в раковых клетках MCF-7 кратковременный окислительный стресс 171
3.2.5.4. Изменение уровня активных форм кислорода в фибробластах при действии гДНК и гДНКокси 175
3.2.6. Окислительные модификации вкДНК индуцируют повышение уровня окислительных модификаций собственной ДНК в ядрах клеток 178
3.2.7. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют кратковременную экспрессию NOX4 в разных типах клеток
181
3.2.8. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают быстро репарируемые разрывы ДНК ядер клеток
187
3.2.8.1. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают в ядрах HUVEC быстро репарируемые разрывы ДНК 188
3.2.8.2. Внеклеточная ДНК с измененными свойствами стимулирует образование и репарацию разрывов хроматина культивируемых мезенхимных стволовых клеток человека
3.2.8.3. Окисленные вкДНК стимулируют увеличение количества разрывов ДНК в ядрах клеток MCF-7 199
3.2.8.4. Окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень двунитевых разрывов в HEF и HDF , культивируемых в условиях окислительного стресса 203
3.2.9. Окисленные вкДНК повышают уровень нестабильности генома 206
3.2.9.1. Окисленные фрагменты вкДНК транзиторно увеличивают содержание фракции subG1 в разных типах клеток 210
3.2.10. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов клеток 212
3.2.10.1. Снижение содержания Ki-67 в клетках в ответ на присутствие вкДНК 212
3.2.10.2. Изменение экспрессии маркера пролиферации и репарации PCNA в клетках в ответ на присутствие фрагментов вкДНК 216
3.2.11. ВкДНК вызывает остановку клеточного цикла 220
3.2.11.1. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК
223
3.2.12. Активация процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК
227
3.2.12.1. Изменение пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района 1q12 при действии фрагментов 229
вкДНК
3.2.13. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень гибели клеток разных типов 232
3.2.14. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают количество клеток с признаками апоптоза в разных клеточных популяциях
237
3.2.14.1. ВкДНК снижает активность каспазы 3 в клетках разных типов 240
3.2.14.2. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции апоптоза при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 241
3.2.15. ВкДНК повышает транскрипционную активность клеток 247
3.2.16. TLR9 – рецептор, через который фрагменты вкДНК реализуют стимулирующее действие
249
3.2.16.1. ВкДНК больных ревматоидным артритом, модельные ГЦ- богатые фрагменты увеличивают экспрессию гена TLR9 в лимфоцитах человека 250
3.2.16.2. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в эмбриональных фибробластах легкого человека
252
3.2.16.3. ГЦ-ДНК снижает экспрессию TLR9 в лимфоцитах больного СКВ 252
3.2.16.4. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в СD34+ клетках и мононуклеарах костного мозга
254
3.2.16.5. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК активируются рецепторы TLR9 в МСК
255
3.2.16.6. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК реализуют свое активирующее действие на HUVEC с участием TLR9
264
Изменение уровня экспрессии белка TLR9 при действии на HUVEC вкДНК с измененными свойствам
Изменение уровня экспрессии TLR9 в MCF7 при действии вкДНК с измененными свойствами 268
3.2.16.8. ГДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК TLR9 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 271
3.2.17. Участие рецепторов АIМ2 в проведении сигнала от вкДНК в клетках
3.2.17.1. Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в МСК
3.2.17.2. ВкДНК повышает уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в HUVEC
человека
3.2.17.3. Изменение экспрессии рецептора AIM2 на уровне гена и на уровне
белка при действии фрагментов вкДНК на культуру раковых клеток MCF-7
280
3.2.17.4. Геномая ДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК AIM2 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 283
3.2.18. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 284
3.2.18.1. Влияние вкДНК на уровень экспрессии гена RIG1 в МСК 285
3.2.18.2. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в HUVEC 287
3.2.18.3. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в MCF7 и HDF 288
3.2.19. Роль STING в проведении сигнала от вкДНК 289
3.2.20. Влияние вкДНК на экспрессию белков семейства TLR 291
3.2.21. ВкДНК активирует TLR-сигнальный путь 296
3.2.21.1. Изменение уровня экспрессии гена MyD88 –адаптера TLR сигнального пути в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК)
296
3.2.21.2. Динамика изменения количества мРНК гена MyD88 – адаптера TLR-сигнального пути в ответ на стимуляцию HUVEC и MCF7 фрагментами 301
вкДНК
3.2.21.3. Влияние фрагментов вкДНК на активацию адаптера TLR9 сигнального пути – MyD88 на уровне транскрипции в лимфоцитах, CD34+ клетках костного мозга и фибробластах
3.2.22. ВкДНК активирует NF-kB- сигнальный путь в разных типах клеток 303
3.2.22.1. ВкДНК активирует экспрессию генов NF-kB - сигнального пути в МСК 304
3.2.22.2. Фрагменты вкДНК активируют экспрессию транскрипционного фактора NF-kB (RelА или p65) и его перемещение в ядро в МСК
307
3.2.22.3. Активация процессов транскрипции генов цитокинов при действии фрагментов п(рДНК) на МСК. Активация синтеза цитокинов - IL10 и TNF 312
фрагментами ГЦ-обогащенной вкДНК
3.2.22.4. Изменение экспрессии генов молекул сигнального каскада, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, в HUVEC при действии
3.2.22.5. Влияние фрагментов вкДНК на количества белка р65 и его локализацию в HUVEC
3.2.22.7. Изменение уровня экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1, контролируемых фактором NF-kB, при действии окисленных и ГЦ 3.2.22.6. ВкДНК повышает экспрессию генов цитокинов IL8, IL6, IL10 и
TNFа в HUVEC богатых фрагментов вкДНК в HUVEC 321
3.2.22.8. ГЦ-обогащенная п(рДНК) активирует NF-kB - сигнальный путь в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров 322
3.2.22.9. Активация экспрессии генов NF-kB – сигнального пути образцами окисленной и неокисленной вкДНК в MCF7 324
3.2.22.10. Влияние окисленных фрагментов вкДНК на активность NF-kB – сигнального пути в фибробластах в условиях окислительного стресса 238
3.2.23. Активация фрагментами вкДНК NRF2 – сигнального пути 331
3.2.23.1. вкДНК активирует NRF2 – сигнальный путь в МСК 332
3.2.23.2. Активация NRF2- сигнального пути фрагментами вкДНК в HUVEC 336
3.2.23.3. Окисленные и неокисленные образцы вкДНК снижают активность транскрипционного фактора NRF2 и активируют транскрипционный фактор STAT3 в клетках MCF7
3.2.23.4. Окисленные вкДНК активируют NRF2 – сигнальный путь в фибробластах
341
3.2.23.5 Изменение уровня экспрессии гена SOD1 при действии ГЦ-богатых и окисленных ДНК в разных типах клеток 342
3.2.24. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в разных типах клеток 346
3.2.24.1. Активация экспрессии STAT3 фрагментами вкДНК в МСК 347
3.2.24.2. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в
3.2.24.3. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в MCF-7 350
3.2.25. Активация транскрипционного фактора PPARG2 фрагментами вкДНК в клетках разных типов 353
3.2.26. Окисленная вкДНК – фактор стресс-сигнализации в передаче сигнала при радиационно-индуцируемом эффекте свидетеля 357
3.2.27. Окисленная вкДНК повышает устойчивость HDF к ионизирующей радиации
3.2.28. Воздействие ГЦ- ДНК улучшает выживаемость МСК после облучения 359
3.2.29. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют в МСК устойчивость к
повреждающему действию этанола 361
3.2.30. Влияние изменения свойств вкДНК на специфическую функциональную активность клеток
3.2.30.1. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC
3.2.30.2. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина 368
3.2.30.3. Повышение экспрессии генов миогенной дифференцировки при
действии вкДНКокси на МСК
374
Выводы 389
Применение результатов научных выводов 389
Список литературы
- Содержание различных последовательностей в составе вкДНК
- Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК
- Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса
- Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов клеток
Содержание различных последовательностей в составе вкДНК
В 1940-х годах было обнаружено, что ДНК млекопитающих не только заключена в ядре клеток, но и циркулирует в периферической крови [Mandel and Metais, 1948]. Фрагменты ДНК, циркулирующие вне клеток, называют внеклеточной ДНК (вкДНК), экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, ДНК плазмы, ДНК сыворотки, в англоязычной литературе - cell-free DNA, circulating DNA, CNAPS [Galeazzi et al., 2003].
Повышенный интерес к вкДНК связан с возможностью ее использования в диагностических целях: для диагностики разных типов рака по измененной вкДНК опухоли; для выявления патологии течения беременности и нарушений развития плода; для оценки риска повреждающих факторов, в том числе, ионизирующей радиации и ультрафиолета [El Messaoudi et al., 2013; Schwarzenbach, 2013; Gonzlez-Masi et al., 2013; Jung et al., 2010; Zhang et al., 2010; Chiu et al., 2013]. ВкДНК используют как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях; при острых состояниях, сопровождающихся гибелью большого количества клеток (инсультах, инфарктах миокарда); при сепсисе; при трансплантации; при травме [Cui et al., 2013; Bliksen et al., 2012; Tsai et al., 2011; Ren et al., 2013; Fleissner et al., 2012; Nielsen, 2012; Dwivedi et al., 2012; Shimony et al., 2010; Swarup and Rajeswari, 2007; Urbanova et al., 2010; Hanaoka et al., 2012]. В настоящее время появились работы о присутствии в сыворотке циркулирующей РНК, которая также может служить маркером многих патологий [Turchinovich et al., 2011; Arroyo et al., 2013; Kosaka et al., 2013; Katsuda et al., 2013; Kinet et al., 2013]. С развитием современных методов диагностики стало возможным проведение анализа первичной последовательности и метилирования вкДНК [Yi et al., 2013; Martinez et al., 2013]. Однако, несмотря на интенсивные исследования возможности применения вкДНК для диагностики, в клиническую практику было введено только несколько тестов в области пренатальной диагностики и онкологии [Chiu and Lo, 2013; El Messaoudi et al., 2013], что связано с отсутствием методов стандартизации выделения и анализа вкДНК [El Messaoudi et al., 2013].
В настоящее время внимание исследователей привлечено не только к использованию вкДНК в качестве раннего маркера заболеваний и патологических состояний, но и к исследованию возможных биологических функций вкДНК [Gahan et al., 2010; Gonzlez-Masi et al., 2013; Rykova et al., 2012; Ermakov et al., 2011; Malinovskaya et al., 2011; Ermakov et al., 2008]. В данном обзоре мы рассматриваем возможные механизмы влияния внеклеточной ДНК на функционирование клеток организма человека. Однако, чтобы определить влияние фрагментов циркулирующей ДНК на процессы, протекающие в клетках и в организме в целом, необходимо иметь представление о свойствах вкДНК и о характере взаимодействия фрагментов вкДНК с клетками организма. Заранее приношу свои извинения коллегам, работающим в области исследования вкДНК, чьи работы остались за рамками обзора из-за ограничения объема.
Свойства внеклеточной ДНК При патологии и опасных для генома воздействиях изменяются такие свойства вкДНК, как концентрация, фрагментация в плазме крови, содержание различных последовательностей ядерной и митохондриальной ДНК в составе вкДНК, эпигенетические характеристики вкДНК, такие, как метилирование и окислительные модификации вкДНК [Tsai et al., 2011; El Messaoudi et al., 2013; Gahan et al., 2012; Ermakov et al., 2013; Swarup and Rajeswari, 2007; Urbanova et al., 2010; Yi et al., 2013]. Изменение этих характеристик может служить тестом для ранней диагностики патологического процесса в организме [Gonzlez-Masi et al., 2013; Kim, 2013; Ulivi and Silvestrini, 2013; Urbanova et al., 2010; Yu 2012; Skibsted et al., 2013].
Несмотря на растущий интерес к циркулирующей вкДНК и ее применение в качестве маркера в различных областях медицины, особенно, в онкологии и пренатальной диагностике, мало исследований посвящено стандартизации методов, применяемых авторами разных работ, несмотря на то, что этот вопрос регулярно поднимается исследователями в статьях [El Messaoudi et al., 2013; Urbanova et al., 2010; Swarup and Rajeswari, 2007; Tong et al., 2006]. Несогласованность между различными протоколами для обработки проб и методами, использованными для анализа вкДНК – одно из основных препятствий к вводу анализа вкДНК в область клинической практики [Urbanova et al., 2010].
Методы выделения и определения количества вкДНК/РНК плазмы/сыворотки крови являются критичными при анализе данных. Требуется стандартизация методов выделения и количественного определения вкДНК/РНК, осторожная оценка и анализ данных согласно общим параметрам, таким, как специфичность и чувствительность. Необходимо определить, какой источник – плазма или сыворотка крови является более пригодным для анализа внеклеточных нуклеиновых кислот. Легкие, дешевые и более быстрые методы в будущем могут сделать идентификацию вкДНК и ее количественный анализ рутинным лабораторным биохимическим тестом [El Messaoudi et al., 2013].
Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК Несмотря на накопившиеся данные, свидетельствующие о повышении уровня вкДНК при многих патологиях, определение концентрации вкДНК до сих пор не является введенной в практику тест-системой, поскольку данные в разных литературных источниках противоречат друг другу: концентрация вкДНК плазмы у больных раком варьирует от нескольких тысяч нг/мл до нескольких нг/мл, перекрываясь с диапазоном концентраций вкДНК здоровых людей [Weiss et al., 2013; Jung et al., 2010; Chan et al., 2007]. Кроме того, фрагментация вкДНК при онкологических заболеваниях по разным литературным источникам может быть ниже, эквивалентна, или выше, чем фрагментация вкДНК в контрольной группе [Holdenrieder et al., 2008; Jiang et al., 2007; Schmidt et al., 2008; Mouliere et al., 2011; Mouliere et al., 2012]. Такие различия в полученных данных связаны с разным принципом формирования выборок исследуемых больных, с разным источником выделения вкДНК (из плазмы или сыворотки), с разницей процедур выделения, очистки, определения концентрации и хранения образцов вкДНК, используемых каждой лабораторией, так как нет единых стандартных протоколов [El Messaoudi et al., 2013]. Это и является основным препятствием для клинического применения вкДНК в качестве диагностического маркера.
Основной вопрос, какой источник лучше использовать для выделения ДНК – сыворотку или плазму крови. В нескольких работах сравнивали концентрацию вкДНК, полученную при параллельном выделении из сыворотки и плазмы одного и того же донора [El Messaoudi et al., 2013; Chan et al., 2005; Lee et al., 2001; Umetani et al., 2006; Lui et al., 2002]. Концентрация вкДНК в сыворотке крови была значительно выше, чем в плазме - в таблице 1.1 приведены некоторые результаты из опубликованных статей.
Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК
CpG - ОДН класса А являются мощными активаторами NK-клеток (естественных киллеров) и активаторами секреции интерферона альфа плазмацитоидными дендритными клетками, но слабо стимулируют В-лимфоциты. Канонические ОДН А-класса содержат polyG-мотивы на 5 - и/или 3 - конце, которые способны образовывать сложные высокоупорядоченные структуры, известные как G-тетрады, и центральную фосфодиэфирную область, содержащую один или более CpG-мотивов внутри самокомплементарных палиндромов [Krieg, 2006; Yasuda et al., 2006; Vollmer et al., 2006]. CpG - ОДН класса B имеют фосфоротиоатный остов, не образуют высокоупорядоченных структур, содержат один или несколько CpG-мотивов [Krieg, 2012; Klinman et al., 2004; Vollmer, 2006]. ОДН типа B являются сильными активаторами В-лимфоцитов и вызывают in vivo длительные эффекты по типу лимфаденопатии, но слабо активируют NK-клетки и дендритные клетки [Krieg, 2012; Degli-Esposti and Smyth, 2005; Klinman et al., 2004; Heikenwalder et al., 2004]. Стимуляция клеток иммунной системы ОДН типа В приводит к индукции секреции фактора некроза опухоли и интерлейкина-12 лимфоцитами, к активации Т-хелперов (Th1-клеток), а также сопровождается регуляцией молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности антигенпредставляюших клеток [Krieg, 2012; Klinman et al., 2004; Krieg, 2002]. Показано, что у фосфоротиоатных ОДН более высокая степень сродства к TLR9 чем у ОДН с фосфодиэфирной основой [Haas et al., 2008].
CpG - ОДН класса С имеют фосфоротиоатный остов, аналогично ОДН класса В, но образуют палиндромы [Krieg, 2012; Lenert et al., 2006; Vollmer, 2006]. По стимулирующему действию на клетки иммунной системы ОДН класса C объединяют характеристики ОДН класса А и B –стимулируют секрецию В-лимфоцитами интерлейкина-6 и секреции интерферона альфа плазмацитоидными дендритными клетками [Hartmann et al., 2003; Marshall et al., 2003; Vollmer, 2006].
Ни один из классов CpG-ОДН не вызывает иммуностимулирующего эффекта у мышей, дефицитных по TLR9 [Vollmer, 2006]. Механизм, посредством которого различные классы ОДН вызвают различные иммунные эффекты при стимуляции TLR9, остается не вполне ясным [Krieg, 2012]. Предполагают, что интерферон-активирующее действие ОДН опосредуется через взаимодействие с CXCL16, которые экспрессируются в дендритных клетках и отсутствуют у В-лимфоцитов [Gursel et al., 2006]. За последнее десятилетие было проведены клинические испытания CpG-ОДН как адъювантной вакцины при иммунотерапии аллергии, рака и инфекционных заболеваний [Krieg, 2012]. Разрабатываются новые эффективные препараты на основе синтетических иммуностимулирующих CpG-ОДН [Krieg, 2012; Kaminski at al., 2013; Krishnamachari at al., 2009; Klinman at al., 2008]. Наличие в бактериальной ДНК неметилированных CpG-мотивов определяет ее иммуностимулирующую активность, однако, CpG-мотивы, не являются уникальными для патогенных микроорганизмов, они присутствуют и у позвоночных, но на гораздо более низком уровне из-за CpG-метилирования и подавления [Krieg, 2002; Kawai and Akira, 2011].
Фрагменты вкДНК также могут выступать в роли лигандов для TLR9. Так во внеклеточной ДНК накапливаются фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора [Вейко с соавт., 2006], которые обогазены неметилированными CрG-мотивами [Костюк с соавт., 2010; Bird, 1986]. По представленности последовательностей, взаимодействующих с TLR9, транскрибируемая область рибосомного повтора весьма сходна с бактериальной ДНК [Костюк с соавт., 2010]. На протяжении 13 314 п.н. транскрибируемой области рибосомного повтора содержится суммарно более 100 мотивов PuPuCGPyPy, CGTCG и GTCGTT, которые обуславливают взаимодействие ДНК с TLR9 [Костюк с соавт., 2010; Krieg et al., 1995; Bauer et al., 2001; Branda et al., 1996]. Кроме рибосомного повтора во вкДНК могут накапливаться и другие ГЦ-обогащенные последовательности, например, в промоторной области многих генов встречаются неметилированные «CрG-островки» (длиной примерно 1 т.п.о.), близкие по свойствам к транскрибируемой области рибосомного повтора [Bird, 1986].
Ингибиторы взаимодействия CрG -ДНК с TLR9
Не все CpG-ОДН обладали иммуностимулирующей активностью, некоторые, CCGG -мотив, например, блокировали индуцированную CрG-активацию клеток [Chen et al., 2001]. Было обнаружено, что метилированные CpG-мотивы в ДНК млекопитающих, и ОДН, содержащие ГЦ-шпильки, в достаточно высокой концентрации способны супрессировать иммунную активность клеток [Chen et al., 2001; Klinman et al., 2009; Dong et al., 2005].
ДНК млекопитающих метилирована и содержит теломерные последовательности, которые не присутствуют в бактериальной ДНК [Blasco et al., 1999]. Теломерные повторы TTAGGG расположены на концах теломер и физиологически защищают хромосомы млекопитающих от деградации [Blasco et al., 1999]. Видимо, когда ДНК ядер освобождается из клеток, эти теломерные регионы отвечают за ингибирующие эффекты вкДНК млекопитающих [Klinman et al., 2009; Chen et al., 2001; Gursel et al., 2001]. Олигонуклеотиды, содержащие повторяющиеся TTAGGG-мотивы, были способны блокировать синтез провоспалительных цитокинов, индуцируемых не только лигандами TLR9, но и различными антигенами (двухцепочечной РНК, пептидогликаном, липополисахаридом) [Klinman et al., 2009; Gursel et al., 2003]. In vivo TTAGGG-инг-ОДН предотвращали развитие воспалительного артрита при их внутрисуставной инъекции грызунам [Zeuner et al., 2003]; СКВ и нефрита у предрасположенных к СКВ мышей NZB/NZW [Dong et al., 2005]; индуцированного липополисахаридом токсического шока [Shirota et al., 2005]. Предполагается, что создание препаратов на основе TTAGGG-инг-ОДН может быть перспективным при лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний [Klinman et al., 2009]. Хотя механизм действия этих инг-ОДН не до конца ясен, показано, что их иммуносупрессивная активность в значительной степени зависит от способности G-повторов формировать устойчивые вторичные структуры [Lenert et al., 2010; Klinman et al., 2009; Gursel et al., 2003; Vollmer, 2006]. Действие TTAGGG-мотивов частично может быть обусловлено их связыванием с STAT1 и STAT4 и блокированием последующего фосфорилирования молекул STAT [Shirota et al., 2005]. Показано также связывание синтетических инг-ОДН на основе TTAGGG повторов с транскрипционным фактором STAT3, скавенджер-рецепторами и СКВ-аутоантигенами Ku [Lenert et al., 2010; Jing et al., 2004; Bianchi et al., 1999].
Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса
Эктодомены TLR, таким образом, требуют и gp96, и PRAT4A для правильной сборки и скручивания перед выходом из ЭПР, однако, остается еще множество вопросов, связанных с особенностями сборки, димеризации и стабилизации TLR; ролью в этих процессах gp96 и PRAT4A; участием других шаперонов в этих процессах; идентификацией структурного мотива в gp96 и PRATA, узнающего TLR [Lee et al.,2012].
UNC93B1 способствует перемещению TLR к эндолизосомам UNC93B1 (Uncoordinated 93B1) – тренсмембранный гликопротеин, расположенный в ЭПР, содержащий 598 аминокислот и проходящий через мембрану ЭПР двенадцать раз (таблица 1.5) [Tabeta et al., 2006]. У мышей, гомозиготных по миссенс-мутации (H412R), расположенной в девятом трансмембранном домене UNC93B1, нарушается перемещение TLR7 и TLR9 к CpG – содержащим эндолизосомам и передача сигнала через TLR3, TLR7 и TLR9 [Tabeta et al., 2006; Kim et al., 2008]. Клетки человека с мутациями, приводящими к укороченным транскриптам UNC93B1, имеют дефект передачи сигнала через TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 [Lee et al.,2012]. Таким образом, UNC93B1 требуется для проведения сигнала через эндосомальные TLR (рисунок 1.15), взаимодействие TLR с UNC93B1 осуществляется через трансмембранные домены TLR [Brinkmann et al., 2006]. Таким образом, TLR, связывающие нуклеиновые кислоты, должны взаимодействовать с UNC93B1 через их трансмембранные домены, чтобы UNC93B1 опосредовал их доставку к эндолизосомам, где они могут связывать соответствующие лиганды [Lee et al.,2012; Tabeta et al., 2006; Kim et al., 2008; Brinkmann et al., 2006]. UNC93B1 спсобен различать разные TLR: мутации в разных областях UNC93B1 оказывают влияние на связывание UNC93B1 с конкретным типом TLR, и не оказывает влияния на его связывание с другими TLR [Fukui et al., 2011]. Предстоит ответить на много вопросов относительно роли UNC93B1 в биологии TLR: как клетка воспринимает сигнал, первоначально необходимый для перемещения комплекса UNC93B1LR из ЭПР в эндолизосомы; есть ли на поверхности клетки функциональные TLR, связывающие нуклеиновые кислоты, которые могут передавать сигнал внутрь клетки, или в процессе участвуют дополнительные сенсоры нуклеиновых кислот [Lee et al.,2012]. AP3 – фактор переноса TLR9 к лизосомам AP3 (Adaptor protein 3) является необходимым компонентом механизма внутриклеточного перемещения TLR9. Члены семейства Ар - тетрамерные белки, состоящие из четырех субъединиц: , 3A, 3A и 3, обеспечивают сортировку мембранных белков в секреторном и эндоцитозном направлении [Sasai et al.,2010]. AP3 способствует переносу комплекса TLR9 - CpG из эндосомы в лизосомы и органеллы, связанные с лизосомами (LRO – lysosomerelated organelles) (рисунок 1.15) [Sasai et al.,2010]. В макрофагах, выделенных из костного мозга (BMDM - bone marrow derived macrophage), с отсуствующей субъединицей 3A белка AP3 (Ap3b1 -/-) снижена экспрессия нтерфеона в ответ на стимуляцию клеток CpG, PolyI:С и ЛПС и нарушено перемещение TLR9 в лизосомы [Sasai et al.,2010].
Протеазы, участвующих в расщеплении TLR Протеолитическое расщепление TLR9 в эндосомах/лизосомах с помощью протеаз, таких как катепсины и аспарагин-эндопептидаза (AEP), является ключевым событием в активации TLR9 фрагментами CpG-ДНК [Bauer et al., 2012].
TLR9 подвергается протеолитическому расщеплению по прибытию в эндолизосомальный компартмент и, возможно, в ранние эндосомы с низким рН и протеазами [Bauer et al., 2012; Ewald et al., 2008; Park et al.,2008]. Протеазы, которые процессируют TLR, должны взаимодействовать с TLR9, по крайней мере, временно, и могут считаться кофакторами TLR9 [Ewald et al., 2008]. Эндосомально/лизосомальный комплемент протеаз состоит в основном из катепсинов, катепсины вовлечены в функционирование TLR9 [Park et al.,2008].
Катепсины В, L, S и катепсин F ассоциированы с функционированием TLR9 в B-лмфоцитах, ингибирование этих катепсинов блокирует TLR3 - , TLR7 - и TLR9 – опосредованный ответ [Matsumoto et al.,2008]. Комбинированное действие катепсина L и S в расщеплении TLR9 необходимо для проведения сигнала через TLR9 [Ewald et al., 2008; Park et al.,2008]. Для полноценной активности TLR9 требуется активность нескольких катепсинов, ингибирование отдельных катепсинов не полностью ингибирует расщепление и TLR9 - контролируемый ответ [Bauer et al., 2012; Ewald et al., 2008; Park et al.,2008]. AEP (аsparagine endopeptidase) является лизосомальной протеазой, которая расщепляет C - конец TLR9 по остаткам аспарагина и приводит к его активации в антиген-представляющих клетках [Ewald et al., 2011]. Для функционирования TLR3 и TLR7 также важен протеолитический процессинг [Ewald et al., 2011; Qi et al., 2013]. Считается, что расщепление TLR в эндосомальном компартменте клеток предотвращает активацию TLR эндогенными нуклеиновыми кислотами в физиологических условиях [Brencicova et al., 2013].
Выявление новых молекул – кофокторов в функционировании TLR и выяснение механизма их действия приведет к более глубокому пониманию биологии TLR [Brencicova et al., 2013; Sasai et al., 2013; Lee et al., 2012].
Как только стало понятным, что нуклеиновые кислоты эндогенного происхождения могут быть активаторами TLR, расположенных на эндосомах, возник вопрос о том, как же клетки отличают экзогенную ДНК/РНК от вкДНК, образующуюся в результате гибели клеток организма [Brencicova at al., 2013; Theofilopoulos at al., 2011]. Предполагалось, что TLR9 может различать неметилированные CpG мотивы, которыми изобилует бактериальная ДНК, от собственной ДНК, которая у млекопитающих сильно метилирована – это свойство лигандов TLR9 легло в основу создания синтетических лигандов [Kaminski at al., 2013; Krishnamachari at al., 2009; Klinman at al., 2008]. Однако выяснилось, что при ряде патологий в организме накапливаются фрагменты собственной CpG - богатой неметилированной вкДНК, которая может служить лигандом TLR9 [Вейко с соавт., 2006; Вейко с соавт., 2008; Pisetsky, 2010; Pisetsky, 2012].
Связывание комплексов вкДНК с рецепторами клеточной поверхности одинакова как для вкДНК экзогенного происхождения, так и для своей собственной вкДНК [Kostyuk at al., 2013; Brencicova at al., 2013]. Это логично, поскольку организм должен равно избавляться от нуклеиновых кислот микроорганизмов и ДНК погибших клеток [Brencicova at al., 2013]. Однако, процессы, запускаемые в ответ на эндогенную вкДНК и вкДНК экзогенного происхождения должны отличаться, поскольку связывание эндогенной вкДНК антиген-представляющими клетками сопровождается активацией аутоиммунитета [Barrat et al., 2005; Boule et al., 2004].
Показано, что наиболее важным событием в узнавании вкДНК/РНК является перемещение нуклеиновых кислот в эндосомальный компартмент [Brencicova at al., 2013]. Предположили, что в физиологических условиях запрещен доступ собственных нуклеиновых кислот в эндосомы, что предотвращает активацию эндосомальных TLR [Brencicova at al., 2013; Barton and Kagan, 2009]. В отличие от вирусов и бактерий, у которые развиты специализированные механизмы проникновения внутрь клетки, способность эндогенной вкДНК проникать в клетку и попадать в эндосому ограничена [Yasuda et al., 2005; Haas et al., 2008]. В эксперименте in vitro показано увеличение активации TLR9 при использовании веществ, облегчающих доступ вкДНК в клетку [Lande et al., 2007; Sandgren et al., 2004]. Так, комплекс ДНК с LL37 облегчает активацию TLR9 в дендритных клетках человека, поскольку LL37 способствует переносу ДНК на эндосомы [Sandgren et al., 2004]. Аналогично, образование ДНК - DOTAP (cationic lipid) комплексов или иммуноглобулин – хроматин иммунных комплексов также повышает уровень интернализации вкДНК в эндосомы [Yasuda et al., 2005; Haas et al., 2008; Boule et al., 2004].
Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов клеток
Исследовали влияние окисленной вкДНК на экспрессию AIM2 в клетках в условиях хронического окислительного стресса. Культивирование фибробластов кожи (HDF) в среде без сыворотки приводит к хроническому стрессу. Однократно в бессывороточную среду культивирования фибробластов добавляли гДНК или ДНКокси1/ ДНКокси2 в различной концентрации (20 и 100 нг/мл), через 72 часа измеряли уровень экспрессии гена AIM2 (рисунок 3.2.108).
Уровень экспрессии AIM2 в HDF через 72 часа после добавления гДНК и гДНКокси 20 и 100 нг/мл. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР. Данные приведены относительно контроля – интактных клеток HDF, культивируемых в отсутствие сыворотки. Приведены средние значения для 2-х экспериментов.
Количество мРНК AIM2 уменьшается при введении в среду культивирования фибробластов дополнительно фрагментов окисленной ДНК независимо от концентрации, повышение концентрации вкДНК за счет введения гДНК в концентрации 100 нг/мл также снижает уровень экспрессии гена AIM2 (рисунок 3.2.108) [Kostyuk et al., 2013].
Таким образом, рецептор AIM2 является внутриклеточным рецептором, опосредующим действие вкДНК на клетки разных типов. Уровень экспрессии рецептора AIM2 в разных типах клеток, вероятно, обуславливает вклад этого рецептора в ответ клеток на действие фрагментов вкДНК. Рецептор AIM2 связывает попадающую в цитоплазму ДНК независимо от ее нуклеотидной последовательности. Мы показали, что наиболее сильно рецептор AIM2 активируют окисленные формы вкДНК. Вероятно, это связано с более легким проникновением окисленной ДНК в клетки разных типов, что делает взаимодействие вкДНКокси и рецептора AIM2 более вероятным. Кроме того, было показано, что существуют пути регуляции активации AIM2 по принципу обратной связи – со временем снижается его экспрессия и на уровне гена, и на уровне белка. Этот механизм также, видимо, направлен на сохранение клеток в условиях длительного окислительного стресса.
Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК Ожидается, что существуют дополнительные, пока еще не определенные, рецепторы, опознающие и связывающие вкДНК, которые функционируют в цитоплазме или в ядре. Предполагалось, что возможно пересечение TLR9 – сигнального пути и RIG1-зависимого сигнального пути, поскольку при активации TLR9 активируются адаптерные молекулы RIGI – сигнального пути [Selvarajoo 2011]. Поскольку лигандом RIGI является двуцепочечная РНК, непосредственная активация рецепторов RIG-1 фрагментами вкДНК не рассматривалась в качестве возможной, однако в последнее время был обнаружен механизм активации RIG-I АТ-богатой ДНК с участием РНК-полимеразы III, конвертирующей АТ- богатую двухцепочечную ДНК в цитоплазме (или, потенциально, в ядре) в 5 - дцРНК, узнаваемую рецептором RIGI (retinoic acidinducible gene I) [Ablasser et al., 2009]. Мы рассмотрели, участвуют ли рецепторы RIGI в проведении сигнала, инициируемого вкДНК.
Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена RIG1 в МСК Исследовали влияние на экспрессию гена RIG1 образцов вкДНК здоровых доноров и больных ОИМ. Кроме того анализировали действие вкДНК, выделенной из среды культивирования HUVEC (вкДНК(HUVEC)); HUVEC, обработанных пероксидом водорода вкДНК((HUVEC)окси1/2); первичных клеток опухоли РМЖ - маммосфер (вкДНК(РСК)) и из среды клеток опухоли, облученных ионизирующим излучением в дозе 10сГр. Все образцы вызывали повышение экспрессии гена RIG1 через 1 час после начала воздействия, неокисленные – в 1,5 – 1,8 раза, окисленные – в 2 - 2,5 раза (рисунок 3.2.109).
Рисунок 3.2.109. Уровень экспрессии гена RIG1 при культивировании МСК в присутствии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК (50 нг/мл, время воздействия указано на рисунке). Количественное измерение кДНК RIG1 проводилось методом ПЦР в реальном времени. Количество мРНК гена AIM2 нормализовано по гену ТВР (контроль – на графиках горизонтальная линия 1,0 ± 0,3 отн.ед.). Приводятся средние значения и SD для трех независимых экспериментов на трех разных культурах. ( ) - Различия между указанными значениями и контролем статистически значимы (р 0,05). Через 24 часа после добавления фрагментов неокисленной вкДНК уровень экспрессии RIG1 остается повышенным, действие окисленных фрагментов – краткосрочное, к 24 часам уровень РНК RIG1 снижается до уровня контрольных значений (рисунок 3.2.109).
Исследовали действие неокисленной и окисленной ГЦ-богатой п(рДНК), п(СатIII), гДНК и гДНКокси, выделенной из РСК РНК и вкРНК из среды культвирования РСК (рисунок 3.2.109) на транскрипцию гена RIG1. Все образцы РНК незначительно (в 1,5 – 1,8 раза) в первые сутки после воздействия повышают уровень экспрессии гена RIG1. Выделяемая из клеток и из среды РНК не является лигандом рецептора RIG1, однако, может незначительно стимулировать экспрессию гена RIG1 из-за наличия в клетках взаимопересекающегося воздействия сигнальных путей (рисунок 3.2.109). Двуцепочечная гДНКокси повышает уровень экспрессии гена RIG1 в течение 1-3 часов примерно в 2,5 раза, к 24 часам уровень мРНК RIG1 падает до уровня контроля (рисунок 3.2.109). Геномная ДНК стимулирует повышение уровня экспрессии гена RIG1 постепенно – к 24 часам после начала воздействия уровень экспрессии гена RIG1 повышается в 2,2 раза и снижается к 48 часам (рисунок 3.2.109).
Таким образом, любая вкДНК повышает уровень экспрессии гена RIG1 в МСК в 1,5 – 2,5 раза. Окисленные фрагменты быстрее и легче проникают внутрь клетки и включают механизмы, стимулирующие транскрипцию гена RIG1. Уровень экспрессии гена RIG1 в ответ на присутствие ДНКокси повышается быстрее и включает механизмы, регулирующие транскрипцию гена RIG1 по принципу обратной связи, в результате действие вкДНКокси краткосрочное.
ГЦ- ДНК незначительно стимулирует экспрессию гена RIG1, вероятно, через пересечение TLR9-сигнального пути и RIG1-пути. В таком случае блокирование рецептора TLR9 с помощью ингибиторного ОДН и проведения путей передачи сигнала через мембранные эндосомные рецепторы (такие как TLR) с помощью хлорокина, не будет влиять на активацию экспрессии гена RIG1 в присутствии ДНК.Действительно, наше предположение о том, что п(рДНК) и п(рДНК)окси стимулируют экспрессию гена RIG1 через пересечение с TLR-сигнальным путем, подтверждается, поскольку при использовании инг-ОДН, блокирующих TLR9, и хлорокина, изменяющего рН в эндосомах, п(рДНК) и п(рДНК)окси не стимулируют повышения экспрессии гена RIG1 (рисунок 3.2.110).
