Содержание к диссертации
Введение
1. « Супрессорный » путь развития карцином желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека
1.1 Модель Фогелыитейна для спорадических колоректальных карцином 13
1.2 Белок р53 и его участие в канцерогенезе ЖКТ человека 16
1.2.1. Структура белка р53: домены и их функции 16
1.2.2. Роль белка р53 в формировании ответа клетки на стресс 17
1.2.3. Повреждения генар53 в опухолях ЖКТ 21
2. « Мутаторный» путь развития карцином ЖКТ
2.1. Система коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО) 23
2.1.1. Функциональные комплексы белков системы КНО 23
2.1.2 Участие белков системы КНО в апоптозе клетки в ответ на повреждения ДНК 26
2.1.3. Микросателлитная нестабильность генома (МНГ) —маркер дефектной работы системы КНО 29
2.2 Нарушения функционирования системы КНО, МНГ и канцерогенез ЖКТ 31
2.2.1. Наследственные мутации генов системы КНО и предрасположенность к развитию наследственного неполипозного рака толстой кишки (ННРТК) 31
2.2.2. Спорадические карциномы ЖКТ и МНГ 36
2.2.3. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов системы КНО и их роль в развитии опухолей ЖКТ 37
2.2.4. Различный уровень МНГ в опухолях ЖКТ. Маркеры для определения МНГ 38
2.2.5 Гены-мишени дефектной работы системы КНО и их участие в развитии карцином этой этиологии 40
3. Альтернативность генетических путей развития злокачественных новообразований ЖКТ
3.1 Генетическая картина заболевания и его фенотипические проявления 46
3.2 Диагностические процедуры с использованием МНГ для определения генетического пути развития злокачественного новообразования ЖКТ. Нерешенные вопросы 50
4. Множественные злокачественные новообразования ЖКТ
4.1. Критерии диагностики и клиническая классификация первично- множественных опухолей 51
4.2 МНГ - генетический маркер предрасположенности к полинеоплазии ЖКТ. Образование множественных опухолей ЖКТ путем метастазирования или независимого развития карцином 55
4.3 Перспективы генетических исследований множественных злокачественных новообразований 57
Материалы и методы
1. Клинические характеристики исследованных опухолей 57
2. Выделение ДНК из парафиновых срезов и клеточных культур...63
3. Анализ изменения длины микросателлитных маркеров и мутаций в генах мишенях дефектной работы системы КНО 65
3.1. Полимеразная цепная реакция 65
3.2. Анализ мутационных повреждений исследуемой ДНК 68
3.2.1. Анализ SSCP 68
3.2.2. Электрофорез в денатурирующих условиях (ЭФДУ) 69
4. Идентификация наследственных генетических повреждении в генах hMLHl и hMSH2 системы КНО 71
5. Поиск мутаций в генер53 в опухолях ЖКТ 75
6.. Статистическая обработка результатов 76
Результаты и обсуждение
1. Поиск корреляции между уровнем МНГ и повреждениями гена р53 77
1.1. МНГ карцином ЖКТ человека и различия в уровне МНГ для индивидуальных опухолей. Определение класса МНГ карцином ЖКТ 77
1.2. Уровень МНГ карцином ЖКТ и наличие мутаций в гене р53. Поиск корреляции между уровнем МНГ и мутациями генар53 83
1.3. Тест-система для определения генетического пути развития опухоли 89
2. Генетический анализ множественные карцином ЖКТ человека...92
2.1. Полинеоплазия, инициированная наследственным повреждением системы КНО 92
2.1.1. Генетические повреждения в генерЗЗ и маркерах МНГ. Выявление наследственных мутаций в генах системы КНО 93
2.1.2. Генетической схема прогрессии ННРТК, сопровождающегося множественными карциномами ЖКТ. 98
2.2. Альтернатива при образовании множественных опухолей: метастазирование или независимое развитие. Выявление «природы» множественных карцином на основе их генетического анализа 105
Выводы 108
Список работ, опубликованных по теме диссертации 109
Список цитируемой литературы 111
- Участие белков системы КНО в апоптозе клетки в ответ на повреждения ДНК
- Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов системы КНО и их роль в развитии опухолей ЖКТ
- Анализ изменения длины микросателлитных маркеров и мутаций в генах мишенях дефектной работы системы КНО
- Уровень МНГ карцином ЖКТ и наличие мутаций в гене р53. Поиск корреляции между уровнем МНГ и мутациями генар53
Введение к работе
Опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) являются одной из наиболее распространенной причиной смерти от злокачественных новообразований как во всем мире, так и в России, и, в частности, Санкт-Петербурге - одном из самых «пожилых» и потому «онкологических» мегаполисов Российской Федерации (Аничков et al, 2004). Обширные программы направлены на разработку диагностики и методов лечения этого заболевания. В настоящее время в связи с пониманием генетической природы рака и развитием молекулярно-биологических подходов разрабатываются различные процедуры идентификации генетических повреждений, определяющих инициацию и развитие онкологического заболевания, а также чувствительность карцином этой локализации к терапевтическим воздействиям.
На сегодняшний день известно несколько десятков генетических детерминант, вовлекаемых в патогенез опухолей ЖКТ. По сложившимся представлениям большинство карцином ЖКТ могут развиваться по двум путям - «супрессорному» и "мутаторному" (Ilyas and Tomlinson, 1996). Первый характеризуется мутациями в генах АРС, K-ras, DCC, С-тус, Bcl-2, р53 и др. Одним из ключевых среди них является ген р53, белковый продукт которого является основным регулятором клеточного ответа на различные стрессовые воздействия, а также участником процесса дифференцировки клетки, поддержания стабильности ее генома и т.д. Инициирование же "мутаторного" пути связано с инактивацией системы коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО), которая проявляется в микросателлитной нестабильности генома (МНГ) различной степени: высокой (МНГ-В), низкой (МНГ-Н) и со стабильными микросателлитами (MCC) (Boland et al, 1998). Особенность повреждения системы КНО состоит в том, что в первую очередь мутации будут возникать в генах, содержащих в своей структуре микросателлит. К настоящему времени известен целый ряд таких генов,
белковые продукты которых в норме так или иначе влияют на пролиферацию клеток, и, соответственно, могут вовлекаться в канцерогенез в случае их повреждения или утраты (Boland et al, 1998).
Каждый из двух путей характеризуется разным мутационным профилем, вследствие чего опухоли имеют различия в течении заболевания и чувствительности к разным видам терапии. Колоректальные опухоли с повреждениями системы КНО, как правило, выявляются в более раннем возрасте, склонны к полинеоплазии, являются низкодифференцироваными, чаще локализованы в проксимальном отделе ободочной кишки; есть данные и о более высокой выживаемости пациентов с такими опухолями (Redston, 2001). Мультирезистентность опухолей с повреждениями системы КНО или гена р53 обусловлена потерей клетки способности к апоптозу, который является конечным звеном цитотоксического действия антираковых препаратов на клетку. Белок р53 - один из основных регуляторов запуска апоптотического каскада в клетке в ответ на повреждения ДНК, однако белки системы КНО hMLHl и hMSH2 также участвуют в инициации апоптоза клетки (Fishel, 2001). Различия в спектре узнаваемых повреждений ДНК проявляются в пониженной чувствительности к терапевтическим агентам, определяемой нарушениями в трансформированных клетках системы КНО или гена р53, что продемонстрировано как в экспериментах на ряде клеточных линий, так и в клинических исследованиях (Fink et al, 1998; Manic et al, 2003).
Очевидно, что для выбора эффективной терапии, а также прогнозирования течения конкретного онкологического заболевания ЖКТ полезно определить генетический путь его развития или, как минимум, отделить карциномы с повреждениями в системе КНО или гене р53. МНГ сама по себе является чувствительным маркером, позволяющим идентифицировать карциномы с поврежденной системой репарации КНО. Кроме того, выявление МНГ методически представляет собой простую
процедуру генетического анализа. Таким образом, использование МНГ для диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний ЖКТ представляется перспективным. Тем не менее, до сих пор остается неясным, каков тот уровень МНГ, который позволяет полностью исключить возможность развития карциномы по супрессорному пути с повреждением его «ключевых» генов и в первую очередь гена р53. При этом, наибольшие трудности возникают с классификацией карцином МНГ-Н, их клинической, патологической и биологической сущностью. Поэтому актуальной проблемой остается разработка диагностических методов определения генетического пути развития рака ЖКТ с использованием МНГ в качестве генетического маркера, и, в частности, оптимизация панели чувствительных и специфичных микросателлитов для выявления МНГ разного уровня.
Первично-множественные опухоли (ПМО) ЖКТ представляют собой отдельную группу злокачественных новообразований, характеризующуюся сложностью лечения таких больных (Чиссов и др., 2000). При обнаружении множественных карцином у одного пациента для выбора наиболее оптимальной схемы лечения необходимо знать, являются ли опухоли независимыми или они - метастазы первичной опухоли (Карасева, 1996). Для ответа на этот вопрос в мире используются кроме общепринятых клинических молекулярно-биологические методы исследования, т.к. без них невозможно определить клональную природу конкретной полинеоплазии. Кроме того, множественные карциномы, особенно метахронные опухоли метастатического происхождения, позволяют проследить накопление нарушений в структуре ДНК в ходе канцерогенеза. Таким образом, генетический анализ ПМО представляет как теоретический, так и практический интерес.
Все вышесказанное явилось основой для проведения настоящего исследования.
Цели и задачи исследования
Целями данной работы являются поиск простой процедуры генетического анализа, способной выявить принадлежность исследуемой опухоли к одному из двух возможных генетических путей ее развития, а также исследование множественных злокачественных новообразований ЖКТ для определения их генетической «природы».
В задачи исследования входило:
Выявить опухоли, инициированные повреждениями в системе КНО, используя как высокочувствительные маркеры МНГ (ВАТ26 и ВАТ40), так и гены-мишени дефектной работы системы КНО. На основе этих данных определить уровень МНГ для каждой исследуемой карциномы.
Проанализировать взаимосвязь между уровнем МНГ и наличием повреждений в гене р53. Для этого среди карцином с различным уровнем МНГ исследовать на наличие мутаций пять экзонов гена р53 (с пятого по девятый), наиболее часто вовлеченных в мутационный процесс.
Разработать процедуру генетического анализа карцином ЖКТ для идентификации опухолей с поврежденной системой КНО. Оптимизировать панель специфичных микросателлитных маркеров.
Исследовать мутационный профиль множественных новообразований ЖКТ по 16-ти микросателлитным маркерам и 5-ти участкам гена р53. На основе этого генетического анализа определить характер полинеоплазии у каждого из исследованных пациентов.
5) Проследить накопление генетических нарушений при развитии
наследственного неполипозного рака толстой кишки (ННРТК) путем анализа
опухолей, последовательно возникавших у одного пациента в течение
многих лет.
Научная новизна полученных результатов
Проведена оценка значимости различных маркеров для определения уровня МНГ. Впервые представлена панель высокоспецифичных микросателлитных локусов, включающая повторы в генах-мишенях дефектной работы системы КНО и позволяющая строго отделить опухоли с повреждениями этой системы репарации.
Впервые на примере синхронных и метахронных опухолей одного пациента с синдромом ННРТК продемонстрировано накопление генетических повреждений в гёнах-мишенях дефектной работы системы КНО в ходе канцерогенеза, инициированного выходом из строя этой системы репарации. При исследовании этого редкого случая полинеоплазии выявлено наследственное повреждение гена hMLHl, не описанное ранее.
Научно-практическая и теоретическая значимость работы
Основным результатом работы, обладающим практической ценностью, является разработка тест-системы генетического анализа опухолей, позволяющей строго определить карциномы ЖКТ с повреждениями в системе репарации КНО или гене р53. Предлагаемый тест становится новым дополнительным источником диагностической информации, полезной врачу для выбора стратегии фармакотерапии онкологических больных и прогнозирования развития заболевания.
Показано также, что синхронные множественные новообразования ЖКТ в исследованных случаях проявляют метастатический характер, причем при развитии заболевания как по «супрессорному», так и по «мутаторному» пути. Данные генетического анализа позволяют уточнить клинические критерии, применяемые к пациентам при постановке диагноза полинеоплазии.
Теоретический интерес представляют впервые описанные для карцином ЖКТ наследственная мутация в гене hMLHl и повреждение гена
р53. Кроме того, в исследовании продемонстрированы как накопление мутаций в отдельных карциномах ЖКТ при их прогрессии, так и генетическая гетерогенность гистологически различных фрагментов одного новообразования.
Основные положения, выносимые на защиту
Уровень МНГ опухоли может быть использован как параметр, позволяющий определить один из двух возможных генетических путей развития карцином ЖКТ.
Разработана процедура генетического анализа карцином ЖКТ для строгой идентификации опухолей с поврежденной системой КНО с использованием панели специфичных микросателлитных маркеров.
Предложена генетическая схема поэтапного развития заболевания ННРТК, сопровождавшегося возникновением множественных новообразований ЖКТ, у пациента с наследственной мутацией в гене hMLHl.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на 2-ом (Санкт-Петербург, 2000г.) и 3-ем (Москва, 2004г.) съездах ВОГИС; на 2-ой научной конференции «Актуальные проблемы генетики», посвященной 115-летию со дня рождения Николая Ивановича Вавилова, Москва, 2003 г.; на 7-ой (2003г.) и 8-ой (2004 г.) международных путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино; на Обществе онкологов Санкт-Петербурга, 2003 г., Санкт-Петербург; на международной школе молодых ученых «Hanseatic Students' Days of Science», Росток, Германия, 2000 г.; а также на конференциях молодых ученых Санкт-Петербургского государственного технического университета (1996- 1997гг.) и Петербургского института ядерной физики (1998-2004 гг.). Устные доклады
на международных школах-конференциях молодых ученых «Hanseatic Students' Days of Science», Росток, 2000г., а также «Биология - наука XXI века», Пущино 2004г. были удостоены третьей и первой премий, соответственно.
Публикации
По теме работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах
Структура диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 168 ссылок. Работа содержит 15 рисунков и 17 таблиц.
Участие белков системы КНО в апоптозе клетки в ответ на повреждения ДНК
Повреждения генов системы КНО у бактерий приводят к устойчивости к ряду ДНК-повреждающих агентов, таких как метилирующие и алкилирующие агенты (в частности К-метил-Ы -нитросогуанидин (MNNG)), цисплатин и УФ-излучение (Fram et al, 1985; Karran and Marinus, 1982). Показано также, что бактериальные, дрожжевые и человеческие комплексы MSH связываются с повреждениями в ДНК, вызываемыми подобными агентами (Iaccarino et al, 1996; Li et al, 1996; Mello et al, 1996). Кроме того, в одной из работ продемонстрировано, что ряд метилирующих ДНК агентов стимулируют замену АДФ-»АТФ на гетеродимере hMSH2+hMSH6 (Berardini et al, 2000). Все эти данные дают основания предполагать, что система КНО активизируется не только в случае обнаружения своих прямых мишеней -неспаренностей, но и рядом других повреждений ДНК.
Устойчивость бактериальных клеток с дефектной системой репарации КНО к алкилирующим и метилирующим агентам привела к гипотезе, что белки системы КНО в норме узнают вызываемые этими агентами повреждения ДНК и инициируют так называемый «безуспешный цикл» репарации (Wittinghofer et al, 1997). Предполагается, что множественные попытки белков системы КНО ресинтезировать немодифицированную (дочернюю) нить ДНК при сохранении повреждения во второй нити с достаточно высокой частотой приводят к образованию двунитевого разрыва ДНК, сигнализирующего гибель клетки. В случае же дефектности системы КНО такие повреждения просто остаются незамеченными, что позволяет клетке выживать (Fishel, 2001).
Аналогичная устойчивость КНО-дефектных клеточных линий к ряду ДНК-повреждающих агентов была задокументирована и для человека (Branch et al, 1993). По всей видимости, в этом случае подобная устойчивость достигается за счет изменения апоптотического ответа клетки на повреждение ДНК (Hickman and Samson, 1999; Zhang et al, 1999). Действительно, в работе Дзанга и др. продемонстрировано увеличение количества апоптозирующих клеток в ответ на введение алкилирующих агентов, в частности MNNG, в то время как в клетках hMSH27" подобной реакции не наблюдалось (Zhang et al, 1999).
Таким образом, к настоящему времени имеются свидетельства того, что белки системы КНО обладают способностью индуцировать апоптотический ответ клетки на ряд повреждений ДНК. Кроме того, в ряде работ по устойчивости клеточных линий к метилирующим и/или алкилирующим агентам продемонстрирована независимость апоптотического процесса от р53 - одного из основных регуляторов инициации апоптотического каскада в клетке (Davis et al, 1998; Hickman and Samson, 1999). Возможно, что двунитевые разрывы, связанные с «бесполезным циклом» репарации белками системы КНО инициируют апоптоз независимо от р53, хотя механизм подобной избирательности остается неясным. С другой стороны, вероятно, что функционирование белковых комплексов системы КНО в виде «скользящих замков» и накопление подобных структур вблизи повреждения ДНК является сигналом к запуску апоптотического каскада. Такая модель передачи сигнала a priori не зависит от наличия двунитевых разрывов, исключая необходимость р53-опосредованного ответа. Таким образом, белки системы КНО узнают неспаренности и/или др. повреждения ДНК, формируют вблизи повреждения множественные структуры «скользящего замка» тем самым инициируя либо репарацию неспаренного основания либо апоптоз клетки (Рис. 5) (Fishel, 2001).
Какие же именно белки, составляющие систему КНО, участвуют в инициации запуска апоптотического каскада в ответ на некоторые виды повреждений ДНК? Исследование клеточных линий, полученных из нокаутных мышей, показали, что только мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ) Msh2Y и Mshfr/ устойчивы к MNNG, тогда как МЭФ MshS f чувствительны точно также, как и клетки дикого типа (de Wind et al, 1999). В экспериментах с использованием микроинъекций показано, что сверхэкспрессия генов hMSH2 и hMLHl индуцировала апоптоз в течение 24 часов, тогда как сверхэкспрессия генов hMSHS, hMSH6 и hPMS2 не приводила к апоптозу (Zhang et al, 1999). Оказалось возможным также выделить стабильные трансфектанты, экспрессирующие hMSH3, hMSH6 и hPMS2, тогда как многочисленные попытки выделить стабильные трансфектанты, экспрессирующие hMSH2 или hMLHl, предпринимаемые с 1993 и 1994 годов, когда эти гены были идентифицированы, не увенчались успехом. Целый ряд работ по исследованию чувствительности раковых клеток к различным химиотерапевтическим агентам демонстрируют, что человеческие опухолевые клеточные линии, дефектные по hMLHl или hMSH2, устойчивы к метилирующим и алкилирующим агентам, а также к другим препаратам, повреждающим ДНК (Aebi et al, 1996; Karran and Bignami, 1992). Всё это вместе взятое поддерживает представление о том, что hMSH2, hMLHl и, в меньшей степени, hMSH6 незаменимы для сигналинга апоптоза в ответ на определённые типы повреждений ДНК.
Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов системы КНО и их роль в развитии опухолей ЖКТ
Термин «эпигенетическая регуляция» используется для обозначения наследственных и приобретенных изменений в экспрессии гена без соответствующих структурных изменений в его нуклеотидной последовательности. Одним из механизмов такой регуляции является метилирование/деметилирование ДНК, представляющее собой фермент-индуцированную химическую модификацию структуры ДНК Метилирование ДНК вовлечено в широкий круг биологических процессов, которые включают регуляцию экспрессии тканеспецифичных генов, клеточную дифференцировку, геномный импринтинг, инактивацию X-хромосомы, регуляцию структуры хроматина, репликацию ДНК, латентный период у вирусов, канцерогенез и старение (Wajed et al, 2001). Тем не менее, нарушение метилирования ДНК достаточно часто является одной из возможных причин малигнизации клеток. К настоящему времени описаны три варианта участия метилирования ДНК в канцерогенезе (Laird, 1997; Wajed etal, 2001): 1) Спонтанный мутагенез - возникновение замен [С—»Т] в последовательности ДІЖ за счет дезаминизирования Met-C. Подобные точечные мутации составляют до 70% от всех выявленных генетических повреждений такого онкосупрессорного гена как р53 (Tornaletti and Pfeifer, 1995). 2) Гипометилирование, приводящее к активной транскрипции онкогенов, в норме находящихся в метилированном состоянии (BCL-2, С-MYC) (Goelz etal, 1985; Hanada etal, 1993; Sharrard etal, 1992); 3) Гиперметилирование или аномальное метилирование CpG-островков в промоторньгх районах некоторых онкосупрессорных генов, что приводит к их полной инактивации или необычному сплайсингу (Baylin et al, 1987; Laird and Jaenisch, 1996). Таким образом, при отсутствии каких-либо структурных изменений нуклеотидной последовательности гена он теряет свою активность, что может рассматриваться как функциональная деления (ріб, р15, hMLHl, Н19).
Именно метилирование промоторной области гена hMLHl, по-видимому, является одной из причин образования спорадических опухолей ЖКТ с МНГ, а также, но со значительно меньшей частотой, ННРТК, являясь в этом случае причиной «молчания» аллеля дикого типа, не несущего наследственного повреждения в этом гене. Действительно, метилирование промотора этого гена системы репарации выявлено в 90% спорадических колоректальных карцином, до 77% злокачественных образований эндометрия и до 100% спорадических раков желудка с МНГ (Esteller et al, 1998; Herman etal, 1998; Toyota etal, 1999).
МНГ с различной частотой выявляется в целом ряде злокачественных новообразований человека: более чем в 90% случаев ННРТК, 15-20% спорадических колоректальных карцином, около 60% семейных раков желудка и др. (Arzimanoglou et al, 1998). Эти статистические данные, по крайней мере для ННРТК, являются хорошей основой для разработки диагностических методов. Поскольку выявление МНГ является достаточно простой процедурой по сравнению с поиском мутаций в генах системы КНО, генетический анализ МНГ позволяет первично идентифицировать опухоль с поврежденной системой репарации. Для введения некоего единообразия в оценке МНГ у разных авторов, а также для повышения объективности полученных в разных работах результатов были разработаны единые критерии для определения МНГ (Boland et al, 1998). Эти критерии затрагивают как количество маркеров, используемых для определения МНГ, так и их спектр. Кроме того, в зависимости от числа выявленных изменений длины микросателлитов панель маркеров должна определить уровень МНГ для каждой опухоли. В качестве локусов для определения МНГ был предложен набор из пяти микросателлитов, включающий три динуклеотидных повтора: D2S123, D5S346 и D17S25, а также два мононуклеотидных повтора ВАТ25 и ВАТ26. Последние содержат в своей структуре повторы (СІА25) и (ёА2б) соответственно. Если в двух или более из исследованных локусов выявляется изменение длины, то опухоль классифицируется как обладающая высоким уровнем МНГ (МНГ-В), если изменен только один повтор, то опухоль с низким уровнем МНГ (МНГ-Н) и если ни в одном из пяти локусов не наблюдается изменение длины повтора, то опухоль классифицируется как стабильная (МСС). Эти критерии позднее были дополнены введением дополнительных мононуклеотидных маркеров для более точного отделения МНГ-В и МНГ-Н (Umar et al, 2004).
Тем не менее, несмотря на известность этих критериев, многие авторы используют другие наборы маркеров для определения МНГ в опухолях различной этиологии, расширяя или сужая их спектр (Wheeler et al, 2000). Так в ряде работ в качестве единственного маркера МНГ используется микросателлит ВАТ26, для которого неоднократно продемонстрированы компетентность (до 90%) в выявлении МНГ-В, а также консервативность -очень низкая частота встречаемости полиморфизмов этого локуса, что позволяет исключить анализ ДНК нетрансформированной ткани каждого пациента (Hoang et al, 1997). Также в работах некоторых авторов используется высокочувствительный маркер ВАТ40, содержащий в своей структуре повтор (dA4o), хотя этот локус достаточно полиморфен в общей популяции, что предполагает обязательный анализ ДНК из нормальных клеток больного (Samowitz et al, 1999). Кроме того многие исследователи используют для определения МНГ тетрануклеотидные повторы, а также моно- и динуклеотидные микросателлиты, не входящие в общепринятую панель (Jass et al, 1995). В целом, все эти данные, в совокупности с различными критериями, использованными разными авторами для классификации уровня МНГ, до сих пор значительно усложняют статистическую обработку опубликованных результатов и, как следствие, разработку диагностических методик.
Анализ изменения длины микросателлитных маркеров и мутаций в генах мишенях дефектной работы системы КНО
Все образцы ДНК в паре рак/норма были проанализированы на наличие изменений длины микросателлитных локусов ВАТ26 и ВАТ40, а также мутаций в генах-мишенях дефектной работы системы КНО (JBAX, TGFpRII, E2F4, IGFIIR, TCF4, Caspase-5, MED, RIZ BLM, hMSH3, hMSH6, hRAD50, MRE11 и ATR). Фрагменты ДНК, содержащие исследуемые микросателлиты (70-200 н.п.), выделяли с помощью ПЦР.
Полимеразную цепную реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей: 62 мМ Tris-HCl, рН 8,5; 1,5 мМ MgCl2; 35 мМ КС1; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,15% Тритон Х-100; 0,01 мМ ЭДТА; 0,1 мМ DTT; 5% глицерин; по 250 мМ каждого из четырёх dNTP («Медиген», Новосибирск); по 10 пМ каждого праймера (НПО "Синтол", Москва); 60-100 нг ДНК; 1ед. Taq-полимеразы (НПО "СибЭнзим"). Чтобы предотвратить испарение реакционной смеси в ходе ПЦР, наслаивали 25 мкл вазелинового масла. Амплификацию проводили на амплификаторе "Терцик" (термостат программируемый четырехканальный для проведения ПЦР анализа ТП4-ГЩР-01 - "Терцик" ТУ 9452-001-46482062-98) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР в микроцентрифужных полипропиленовых пробирках с крышкой объемом 500 мкл (НПО "ФинБио") при помощи термостабильной высокопроцессивной рекомбинантной Taq ДНК полимеразы (НПО "СибЭнзим", "Promega", США). В исследовании использовались шестнадцать пар различных праймеров, описанных ранее (Calin eta!., 2001; Kim etal, 1999; Youngetal., 2001) (Табл. 7.).
Подбор условий амплификации для каждой пары праймеров осуществлялся путём варьирования концентрации хлорида магния (1,5-4,5 мМ), праймеров (10-30 пМ), а также изменением как температуры отжига праймеров (± от рассчитанной теоретически по формуле: То, =число (G+C) 4 + число (А+Т) 2-3 (Херрингтон и Макги, 1999), так и количества циклов в использованном температурном режиме. Экспериментально подобранные условия проведения ПНР для каждой пары праймеров сведены в табл. 8.
Стандартный температурный режим реакции представлял собой: 4 мин. при 95С; 30-40 циклов, включающих денатурацию ДНК при 94С в течение 30 с, отжиг праймеров при Т0ТЖИга=:55-65оС (в зависимости от состава праймеров) втечение 40 с, полимеризацию при 72С в течение 40 с; 7 мин. при 72С. Кроме этого, в каждый опыт включали две контрольные пробы: 1) смесь без ДНК (негативный контроль амплификации); 2) смесь, содержащую 100 нг хромосомной ДНК (позитивный контроль амплификации).
Для оценки эффективности ПНР, а также контроля специфичности реакции продукты амплификации подвергали одномерному электрофоретическому разделению при 30 мА (150В) в вертикальных пластинах (90x120x1 мм) 6%-го полиакриламидного геля (ПААГ). Продолжительность электрофореза определяли по движению в ПААГ красителей ксилен-цианола и бромфенолового синего, входящих в состав буфера для нанесения проб (водный раствор 0.25% ксилен-цианола, 0.25% бромфенолового синего, 30% глицерина), результаты визуализировали нитратом серебра («Вектон», Санкт-Петербург). Об успешном проведении ПНР можно судить по наличию одной чёткой зоны в геле, местоположение которой соответствует размеру амплифицированного участка.
Для выявления мутационных повреждений в исследуемых участках генов применяли два различных метода, основанных на сравнительном анализе электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК в паре рак/норма.
Для первичного поиска изменений в структуре ДНК использовали метод конформационного полиморфизма однонитевых молекул ДНК (ЮГОМ) или SSCP в англоязычной литературе (от англ. Single Strand Conformational Polymorphism), дающий качественный ответ о наличии искомых повреждений. Такой прямой анализ возможен благодаря различной электрофоретической подвижности однонитевых структур ДНК, имеющих разный нуклеотидный состав. Отличия в скорости миграции разных по нуклеотидному составу однонитевых ДНК при проведении их электрофореза в ПААГ связаны с образованием этими молекулами различных конформаций, индивидуальность которых определяется их первичной структурой, позволяя идентифицировать единичные изменения нуклеотидной последовательности (Orita, 1990).
При проведении SSCP-анализа в стандартных условиях продукты ПЦР денатурировали в 98% формамиде при 92С в течение 5-Ю мин. и подвергали электорофоретическому разделению в 10-15% (в зависимости от размера ампликона) полиакриламидном геле (90x120x1 мм) в неденатурирующих условиях при 4С и силе тока 30 мА. Продолжительность электрофореза определяли по движению в ПААГ красителей ксилен-цианола и бромфенолового синего, входящих в состав буфера для нанесения проб (98% формамид, 10 мМ ЭДТА, 0.25% ксилен-цианола, 0.25% бромфенолового синего) результаты визуализировали нитратом серебра ("Sigma", США). Наличие генетических повреждений в амплифицированных фрагментах ДНК опухолей определяли по изменению картины электрофоретического разделения по сравнению с ДНК из трансформированной ткани пациентов.
Для определения характера мутаций использовали метод гель-электрофореза в денатурирующих условиях (ЭФДУ), позволяющий разделять фрагменты ДНК в строгом соответствии с их молекулярным весом и, соответственно, выявлять делеции или инсерции в нуклеотидных повторах генов-мишеней дефектной работы системы КНО, а также изменения длины микросателлитных маркеров. Разрешающая способность метода составляет 1 н.п.
Уровень МНГ карцином ЖКТ и наличие мутаций в гене р53. Поиск корреляции между уровнем МНГ и мутациями генар53
В целом, представленные результаты согласуются с данными литературы (Табл. 13) об обратной корреляции между МНГ-В и нарушениями функций гена р53. Однако в ряде исследований, как упоминалось ранее (см. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, п. 3.2), повреждения гена/?53 выявляются в опухолях МНГ-В с более высокой частотой, чем описано нами. Это может свидетельствовать либо о нестрогом разделении генетических путей развития опухолей, либо о более оптимальном подборе маркеров, использованных нами для выявления карцином МНГ-В, инициированных выходом из строя системы КНО. В большинстве работ в качестве маркеров МНГ применяли либо стандартную панель микросателлитов, расположенных в интронных областях генов (так называемая "панель Bethesda", в которую входят два мононуклеотидных (ВАТ26 и ВАТ25) и три динуклеотидных повтора {D5S346, D2S123, D17S250)), либо набор микросателлитов, расположенных в некодирующих областях и включающих от 6 до 10 маркеров (Fujiwara et aL? 1998; Jass et al, 1999; Samowitz et al, 2001b; Young et al, 2001). В нашей работе был использован ряд микросателлитов, локализованных в кодирующих последовательностях генов, белковые продукты которых либо непосредственно ответственны за нестабильность генома, участвуя в репарации повреждений, либо могут регулировать клеточную пролиферацию, контролируя продвижение по клеточному циклу, или связывая факторы роста. Использование таких функционально значимых маркеров позволяет более строго выделить карциномы с нарушенной системой репарации неправильно спаренных оснований. Как видно из табл. 13, повреждения этих генов-мишеней дефектности системы КНО чрезвычайно редко выявляются в карциномах МНГ-Н и MCC (Fujiwara et al, 1998; Salahshor et al, 1999; Samowitz et al, 2001b; Schwartz et al, 1999). Это свидетельствует об их прямом участии в развитии новообразований, инициированных повреждением системы КНО, и подтверждает их высокую специфичность в выявлении таких опухолей. Кроме того, в исследованиях некоторых авторов (Umar et al., 2004) показано, что динуклеотидные повторы (а тем более три-, тетра- и пента-) оказываются менее чувствительными для выявления МНГ-В, чем мононуклеотидные повторы, а последние и были преимущественно использованы в нашей работе. Таким образом, выбор маркеров МНГ, использованный нами, предполагает более строгое отделение опухолей ЖКТ, развивающихся по КНО-зависимому или «мутаторному» пути, поэтому, классификация опухолей как МСС, МНГ-Н и МНГ-В, использованная в нашей работе, сделана по критериям, отличным от предложенных ранее.
Одной из задач нашей работы была разработка простой процедуры генетического анализа, позволяющей определить путь развития конкретного злокачественного новообразования ЖКТ, что могло бы уточнить прогноз течения заболевания и предложить оптимальную схему лечения пациента. Опираясь на полученные результаты, мы предложили использовать уровень МНГ опухоли как основной параметр, позволяющий определить генетический путь ее развития. Выявление микросателлитной нестабильности является достаточно простой процедурой генетического анализа, однако использование столь значительного количества маркеров для определения уровня МНГ каждой опухоли, очевидно, требует слишком много временных и материальных затрат, невозможных в клинической практике. Учитывая это, мы проанализировали статистическую значимость каждого из исследованных маркеров для выявления уровня МНГ с помощью программы Graphpad Instat (см. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, п.6). С этой целью для каждого маркера были подсчитаны следующие параметры: р -вероятность случайного отнесения карциномы к одному из путей развития, чувствительность, специфичность, позитивные и негативные предсказательные значения (табл. 14). Выяснилось, что ВАТ40 является оптимальным маркером для отделения карцином МСС от МНГ-Н и МНГ-В (р 0,0001), ВАТ26 эффективно определяет карциномы МНГ-В (р 0,0001). С уровнем статистической достоверности более 95% оказались пригодными для выявления карцином МНГ-В три микросателлита в составе генов TGF/3RII (р 0,0001), ВАХ (р = 0,0005) и HMSH6 (р = 0,0185). Результаты данного исследования не позволяют однозначно определить пригодность микросателлитов в генах IGFIIR (р = 0,0539), E2F4 (р=0,0586), BLMK hMSH3 (j)=0.1390) для анализа уровня МНГ. Отметим, что все маркеры являются высокоспецифичными (за исключением микросателлита в составе E2F4); специфичность остальных составляет 1,000. Позитивное предсказательное значение при анализе уровня МНГ также очень высокое; различия же между маркерами состоят в их чувствительности и негативном предсказательном значении.
Предлагаемая нами панель для определения уровня МНГ состоит из двух наборов мононуклеотидных повторов: основного и дополнительного. В качестве «основного набора» мы предлагаем использовать два чувствительных повтора в интронных областях генов - ВАТ40 и ВАТ26 и специфичный микросателлит Аю в гене TGF/3RIL «Дополнительный набор» состоит из специфичных микросателлитов в составе генов-мишеней дефектной работы системы КНО: ВАХ и hMSH6. Идентификацию генетического пути развития опухоли по стабильности микросателлитов в ее ДНК предлагается проводить по следующей схеме: определяем уровень МНГ по изменению длины микросателлитов основного набора. Если все три микросателлита стабильны, карцинома относится к классу МСС. Если два или три из них нестабильны, карцинома относится к классу МНГ-В. Если нестабилен лишь один из этих маркеров, необходимо привлечь к анализу дополнительный набор. В случае нестабильности только одного из 5 маркеров карцинома относится к классу МНГ-Н, если же выявляется изменение длины еще хотя бы одного микросателлита, то значительна вероятность развития опухоли по пути повреждения системы репарации КНО.
