Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Ботаническая характеристика перца (род Capsicum) 9
1.2. Классификация рода Capsicum 12
1.3. Генетика перца 15
1.4. Селекция на гетерозис 22
1.5. Комбинационная способность образцов 27
1.6. Технологии молекулярного маркирования в селекции 30
1.7. Применение молекулярных систем маркирования для идентификации генотипов перца 32
1.7.1. Использование микросателлитных повторов для маркирования растительного генома 33
1.7.2. Использование AFLP-метода для маркирования растительного генома 35
1.8. Углеводный обмен растений 37
1.8.1. Ферменты углеводного обмена растений и кодирующие их гены 38
1.8.2. Альфа-глюкан фосфорилазы растений 40
1.8.3. Фермент сахарозосинтаза и его функции в растениях 40
1.8.4. Гены сахарозосинтазы семейства Solanaceae 42
1.8.5. Инвертазы растений 43
2.Материалы и методы исследований 45
2.1. Молекулярно-генетические методы 47
3. Результаты исследований 59
3.1. Анализ генома сортов перца Capsicum аппиит и его близкородственных видов методом AFLP з
3.1.1. Подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Capsicum 59
3.1.2. AFLP-анализ межвидового полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК перцев 61
3.2. SSR анализ генома сортов перца Capsicum аппиит и близкородственных видов Capsicum 69
3.2.1. Подбор микросателлитных локусов для проведения SSR анализа видов и сортов перца 70
3.2.2.Оптимизация ПНР для амплификации микросателлитных локусов перца 71
3.2.3. Микросателлитный анализ сортов перца С.аптшт, а также близкород ственных культурных видов Cfrutescens, C.chinense, Cbaccatum 73
3.2.3.1. Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса СЗ 74
3.2.3.2. Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С1а 80
3.2.3.3. Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С5 84
3.2.3.4. Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С9а 3.2.4. Сравнение частот встречаемости аллелей SSR локусов сортов перца С.аппиит и видов Cfrutescens, Сchinense, С. baccatum 91
3.2.5. Применение исследованных микросателлитных локусов для паспортизации сортов перца С.аптшт и видов Cfrutescens, C.chinense, Cbaccatum 93
3.3. Проведение предварительного сортоиспытания, расчет ОКС и СКС родительских линий 96
3.3.1. Эффект гетерозиса по основным хозяйственно ценным признакам 102
3.4. Анализ полиморфизма генов углеводного обмена 118
3.4.1. Анализ полиморфизма гена Stp23 119
3.4.2. Анализ полиморфизма гена Sus4 123
3.4.3. Анализ полиморфизма гена Pain-l 129
Выводы 134
Рекомендации к практическому использованию в селекции 135
Список литературы
- Селекция на гетерозис
- Подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Capsicum
- Микросателлитный анализ сортов перца С.аптшт, а также близкород ственных культурных видов Cfrutescens, C.chinense, Cbaccatum
- Применение исследованных микросателлитных локусов для паспортизации сортов перца С.аптшт и видов Cfrutescens, C.chinense, Cbaccatum
Введение к работе
Актуальность проблемы. Перец (род Capsicum) в настоящее время является одной из основных овощных культур. В настоящее время перец (как острый, так и сладкий) возделывается во всех странах земного шара, где климатические условия позволяют вести промышленную культуру. Площадь под перцем в мире в 2010 году составила 1,86 миллионов гектар, а мировое товарное производство перца составляет около 27,55 миллионов тонн (FAO, 2010). Перец является «рекордсменом» среди овощей по содержанию витамина С и Р-активных веществ, в 5-10 раз превосходя такие традиционные овощные культуры, как томат и баклажан. Хорошие вкусовые и диетические качества плодов обеспечивают устойчивый постоянный спрос на них в течение всего года, - и это приводит к востребованности новых сортов с различными характеристиками. Ежегодно создаются десятки новых сортов и гибридов перца классическими методами с комплексом хозяйственно ценных признаков.
В настоящее время для ускорения отдельных этапов селекционного процесса и повышения эффективности отбора наиболее рациональным считается применение высокоточных, быстрых и надежных молекулярно-генетических методов. В семеноводстве для определения степени гибридности при получении коммерческих гибридов, а также для контроля сортовой чистоты при размножении сортов, отдельное значение приобретают молекулярные маркеры и разработанные на их основе молекулярно-генетические паспорта. В связи с введением в действие законов РФ «О селекционных достижениях» создание молекулярно-генетических паспортов сортов сельскохозяйственных культур имеет особое значение, в том числе и для защиты авторских прав селекционеров.
На сегодняшний момент оценка полиморфизма как всего генома, так и его отдельных функциональных участков осуществляется с помощью современных методов молекулярного маркирования (AFLP, SSR, RAPD, SSAP, ISSR, SNP и др.). Полученные данные применяются для подбора родительских форм, генотипирования сортов и линий, идентификации ценных генотипов, а также для маркирования отдельных генов и локусов растений. В последние годы в связи с тенденцией увеличения потребления перца и количества новых сортов проблема геномной идентификации сортов становится особенно актуальной, но, несмотря на это, в
России не проводилось целенаправленной научно-исследовательской работы по созданию систем молекулярного маркирования генотипов сортов перца отечественной селекции. Молекулярная идентификация сортов с помощью созданных маркерных систем могла бы стать основой Государственного реестра отечественных сортовых стандартов.
Все вышесказанное определяет актуальность разработки систем молекулярной идентификации геномов отечественных сортов перца и оценку их геномной вариабельности.
Цель и задачи работы. Цель работы - разработка систем маркирования генома культурных видов Capsicum для оценки генетического полиморфизма и получения молекулярных маркеров для идентификации сортов перца отечественной селекции, а тюке для ускорения отдельных этапов селекционного процесса. В соответствии с целью поставлены следующие задачи:
Используя молекулярные системы маркирования (мультилокусное AFLP маркирование, система микросателлитных SSR маркеров) определить уровни вариабельности генома образцов рода Capsicum, включающих сорта Саппиит отечественной и зарубежной селекции, а также гибриды F^
Для каждого микросателлитного локуса определить аллельный состав и частоту встречаемости каждого аллеля у сортов перца отечественной и зарубежной селекции;
На основе определенных аллельных вариантов микросателлтиных локусов составить молекулярно-генетические паспорта анализируемых сортов;
По результатам молекулярно-генетического анализа подобрать родительские пары и провести скрещивания; определить ОКС и СКС родительских форм и эффект гетерозиса у гибридных комбинаций;
Определить и проанализировать последовательности генов глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у перца, выявить уровень полиморфизма и аллельные варианты.
Научная новизна. Впервые с помощью молекулярных методов маркирования (SSR, AFLP) генома охарактеризовано генетическое разнообразие сортов Capsicum аппиит отечественной селекции, а также образцов родственных видов. С
использованием отобранных SSR маркеров разработана система (минимальный набор локусов) для идентификации сортов перца и анализа гибридных комбинаций. Для каждого сортообразца получены индивидуальные SSR спектры, которые могут стать основой паспортизации сортов.
На основе систем AFLP и SSR маркирования впервые проведено молекулярное генотипирование сортов перца отечественной селекции.
Впервые были определены и проанализированы последовательности генов глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у перцев, определен уровень полиморфизма и аллельные варианты.
Практическая значимость. Результаты AFLP анализа позволяют обоснованно подходить к подбору родительских форм для скрещиваний, прогнозировать эффект гетерозиса и оптимизировать селекционный процесс за счет сокращения вовлекаемого в него селекционного материала.
Молекулярные микросателлитные маркеры и разработанные на их основе молекулярно-генетические паспорта сортов могут применяться для контроля сортовой чистоты и определения степени гибридности при получении коммерческих гибридов, а также обеспечивают защиту авторских прав селекционера.
Исследование вариабельности генов может быть использовано для выявления и маркирования аллельных вариантов ассоциированных с содержанием Сахаров в плодах и холодоустойчивостью.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на II Международной конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур» (Москва, 2010), III Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics III» (Moscow, 2012), 16th Evolutionary Biology meeting (France, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 - в рецензируемых научных журналах и 3 - в сборниках статей материалов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 печатных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 194 наименования. Работа содержит 33 таблицы и 27 рисунков.
Селекция на гетерозис
Обновленный список генов представляет собой детальное описание, включая характеристику, механизм действия, генетический фон мутантов и линий, взаимодействие генов, молекулярные маркеры и локализацию в хромосомах в тех случаях, когда это доступно. Он включает в себя 292 гена морфологических и физиологических признаков, мужскую стерильность, устойчивость к болезням, нематодам и гербицидам (Wang, Bosland, 2006).
Генетика такого признака, как высота растений была изучена при использовании мутантов и нормальных растений сортов, от которых эти мутанты были получены. У перца было выявлено девять генов, которые отвечают за высоту растения. Первыми были выявлены карликовые мутанты dw-\ и dw-2 в сорте перца Zlaten Medal, а позднее при использовании межвидовой гибридизации было получено ещё два карликовых мутанта, карликовость которых была обусловлена генами d\v- 3 и dw- 4. В. 1991 году при изучении местного итальянского сорта Triariello был выявлен новый карликовый мутант, который контролируется геном dw-5 и подходит для культивирования в защищенном грунте с высокой плотностью посадки. Также при изучении данного признака было обнаружено, что в межвидовых гибридах С.аппиит с C.chinense №3341, карликовость обусловливалась взаимодействием между ядерными генами dw-6 и dw-1 от С.аппиит и цитоплазмой C.chinense. Также был найден рецессивный ген dw-%, присутствующий в карликовом фенотипе, и рецессивный ген tal, отвечающий за высоту мутанта у С.аппиит cv. РС-1.
У румынского карлика С.аппиит сорт Buketon и болгарского сорта Gorogled 6 высота растения контролируется 2-3 генами. Проявление признака зависит от условий внешней среды, которая имеет более сильное влияние, чем генетические факторы (Wang, Bosland, 2006).
Окраска семядолей, листьев и стеблей были описаны Kormos, Kormos (1955) и Pahlen (1966). Zubrzycki и Pahlen (1974) сообщили о мутанте аиг с желтыми семядолями и листьями (Daskalov and Poulos, 1994). Daskalov (1974) описал мутант уа с желтыми пыльниками, но с фиолетовыми пятнами на стебле и плодах. Позднее Csillery (1980b, 1983) описал цветные мутанты семядоль, листьев, стеблей и показал, что они контролируются 9 рецессивными генами xanlha (ха-2 ... ха-10); 18 генов lutescens (hit -1 ... Iut-IH) -желто-зеленые мутанты; 3 гена (yt-l, yt-2, yt-З) определены как мутанты с желтой верхушкой; 52 гена (mos-l tomos-52) отвечают за мозаичность; 1 ген (Ism) light-sensitive mosaic, представляющий сверхчувствительную мозаичность и 8 рецессивных генов anthocyanin less (al-1 ... al-8), отвечающих за отсутствие антоциановой окраски (Wang, Bosland, 2006). Daskalov (1987) обнаружил один Flv ген, определяющий желто-зеленые листья (Daskalov and Poulos, 1994). He полностью доминантный ген А определяет антоциановую окраску стебля, листьев, цветков и незрелых плодов. Ген А эффективен в присутствии гена at. В АА генотипах действие гена усилено модификатором МоА (являющийся неэффективным в одиночку). Описаны также полимерные гены (R-1 и R-2) отвечающие за фиолетовую окраску цветка, пестика (As), пестика и тычиночных нитей (Asj), и незрелых плодов . Odland (1960) обнаружил, что окраска цветка контролируется 3 генами (S, W, и А).
Увеличенное число цветков в каждом узле контролируется 3 главными генами: Mf-1, Mf-2, и Mf-3 (Shuh and Fontenot, 1990). Идентифицированы шесть генов, отвечающие за характеристики формы плода. Deshpande (1933) описал доминирующий ген Р, контролирующий острую вершину плода, рецессивный ген fb -невыпуклое основание плода, и ген се - чашечка охватывает основание плода (Daskalov и Poulos, 1994). Круглая форма плода управляется главным доминирующим геном О и другими модификаторами (Peterson, 1959), и недавние молекулярные изучения картографии подтверждает существование главных генов, которые управляют этими признаками (Chaim et al., 2001, 2003; Rao and Paran, 2003). Вверхторчащий плод контролируется двумя рецессивными генами — ир-1, и ир-2, которые показывают определенный доминантный и рецессивный эпистаз (Lippert et al., 1965). Csillery (1983) идентифицировал рецессивный ген су, ответственный за образование мелких трещин на перикарпе в биологической спелости плода. Ishi-kawa с коллегами (1998) сообщили о доминантных генах Ар и Fed, контролирующих заостренную форму вершины плода. Аллелизм между Ар и Fed неизвестен. Партенокарпический плод контролируется геном р/, выделен из сорта Kalyanpur Chaman (Pathak et al., 1983b).
Незрелая окраска плода обусловлена рядом аллелей (Odland and Porter, 1938). Зеленовато белая (sw-J ... swn) оказывает влияние на различные белые и зеленые оттенки плода. Салатная и желтовато-зеленая окраска sw-2 является доминирующей по отношению к зеленовато-белой sw-І, рецессивной по отношению к кедрово-зеленой, а кедрово-зеленая - доминантной по отношению к зеленовато-белой.
Установлена группа сцепления генов A-0-sw-l (антоциановая окраска-томатовидная форма плода - зеленовато-белая окраска плодов в технической спелости).
Boswell (1937) показал, что желтая окраска плода перца является рецессивной по отношению к красной окраске и контролируется 1 геном у (yellow). Smith (1950) описал коричневую окраску, что явилось результатом комбинации красного пигмента и неразрушенного хлорофилла. Коричневая окраска обусловлена 2 генами: do пределяющая содержание хлорофилла в зрелых плодах в комбинации с Yredcolor. Гибридизация сортов с красными и белыми плодами показала, что окраска зрелого плода контролируется 3 генами: с-1, с-2 и у (Hurtado-Hernandez and Smith, 1985). Ген с-1 влияет на количество, а не тип присутствующих каротиноидов, ген с-2 оказывает существенное влияние на общий уровень накопления каротиноидов в плодах. Гены с-1, с-2 ослабляют пигментацию путем ингибирования бета-каротина. Кроме того, был найден ген im, проявляющий фиолетовую окраску в промежуточный период созревания, где первоначально незрелые плоды были не фиолетовые (Lippert et al., 1965). Отношение этого гена к генуЛ неизвестно.
Один из генов биосинтеза каротиноидов, определяющих окраску плодов перца, это ген Ccs, кодирующий фермент капсантин-капсорубинсинтазу. Обнаружено, что изменения в структуре этого гена приводит к нарушению синтеза капсантина и капсорубина, и как следствие к изменению окраски плодов перца. Делеция в гене Ccs обнаружена у растений перца с оранжевыми и желтыми плодами (Popovsky and Paran, 2000).
Кроме того, идентифицированы три гена В, t, и be, контролирующие высокое содержание Р-каротина в плодах. Chalukova с коллегами (1993) и Daska ч lov с сотрудниками (1995) описали мутантный сорт «Orangeva Каріа» получе-ный из «Pasardzhishka Каріа». Этот мутант имеет плоды зеленой окраски в технической спелости и оранжевые плоды - в биологической, содержащие в них р-каротина 2 - 2.5 раза больше, чем в красных. Высокое содержание р-каротина в этом мутанте определяется рецессивным геном be, который предотвращает гидролиз Р-каротина в р-криптоксантин.
Подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Capsicum
Гель, не давая ему заполимеризоваться, быстро заливается по всей поверхности между стеклами, пока он не выльется с другой стороны. Заливка геля производится на специальном наклонном столике, аккуратно, избегая образования пузырей. Вставляется гребенка. Гелю дают заполимеризоваться.
Удаляется гребенка. Из каждого образовавшегося кармана удаляется излишек мочевины путём промывания. Сандвич вставляется в аппарат электрофореза, в каждый резервуар приливается по 1 литру ТВЕ.
Нанесение ДНК проб в полиакршамидный (ПАА) гель. Электрофорез. Перед погружением полученных ПЦР продуктов в гель пробы смешиваются с равным объемом буфера для погружения (98% формамид, 0.25% бромфе-ноловый синий, 0.25% ксиленцианол и 1 ОмМ ЭДТА). Вместе с буфером для погружения ПЦР пробы денатурируют в течении 4-5 мин при температуре 95С и затем быстро охлаждают на льду.
После предфореза. Карман геля с помощью шприца или груши активно промывается буфером с целыо удаления излишков мочевины. В карман вставляется пластиковая гребенка типа - «акульи зубы» и закрепляется зажимами. Пробы в объеме 2.2-2.8 мкл наносят в лушси гребенки. Разделение амплифицированных фрагментов при установлении режима на 70 Вт на 30 минут, затем на 110 Вт на 2-3 часа. При достижении красите 53 ля нижней трети геля электрофорез останавливают. После окончания разобрать и охладить систему до комнатной температуры.
Для оценки размеров полученных фрагментов рекомендуется использовать маркер молекулярных масс - GeneRuler50 bp DNA Ladder ("Fermentas", США).
Визуализация спектров путем окрашивания геля нитратом серебра, его фиксация. Стекла осторожно разделяются (гель остается на стекле, смазанном bind-silane). Гель немедленно опускается в поднос с фиксирующим раствором (2 литра 10 % уксусной кислоты (200 мл уксусной кислоты + 1800 мл dH20)). Ставится на шейкер на 30 минут (можно оставить на всю ночь). Затем 2х кратно в течение 5 минут отмывать дейонизированной воды (на шейкере).
После промывки гель перекладывается в окрашивающий раствор (в 2 литрах дейонизированной воды 2г AgN03 + 3 мл 37% формальдегид). Окрашивание всегда производится на шейкере в течение 30 минут.
Приготовление проявителя: в 2х литрах дейонизированной воды 6г Na2C03, охладить до +4С (не больше +10 С), чем холоднее раствор, тем медленнее будет идти проявка. Непосредственно перед проявкой добавить в раствор Змл 37% формальдегида и 400 мкл тиосульфата натрия, размешать в течение 2 минут.
Подготавливаются 3 подноса (один поднос с дейонизированной воды). В два подноса наливается по 1 литру проявителя. Гель вынимается из красителя и опускается в поднос с водой на 2 минуты, затем его извлекают, дают стечь и переносят в поднос с проявителем, осторожно покачивая. Инкубируется до тех пор, пока ДНК фрагменты и маркер молекулярных масс не проявятся на геле (около 5 мин).
Реакция завершается добавлением фиксирующего раствора 10% уксусной кислоты непосредственно в проявитель, где находится гель. Инкубируется гель в течение 5 мин. Гель промывается в 2 литрах дейонизированной воды в течение 5 минут и оставляется на ночь высыхать. Фотодокументируется гель с помощью цифровой камеры с использованием светового столика и штатива для камеры.
Статистическая обработка SSR фрагментов, анализ полиморфизма. Для оценки полиморфизма SSR локусов использовали коэффициент РІС (ро-lymorphism information content): РІС = 1-р І, где р; - частота встречаемости і-го аллельного фенотипа в выборке. Выравнивание и анализ нуклеотидных последовательностей генома перца был проведен с использованием программ CLASTALX, версия 1.7 и MegAlign (DNA STAR. Inc.).
Методика проведения AFLP анализа. Метод основывается на селективной амплификации набора предварительно рестрицированных фрагментов геномной ДНК. Для получения ДНК матрицы геномная ДНК образцов предварительно рестрицируется с помощью двух эндонуклеаз рестрикции и лиги-руется с двуцепочечными адаптерами. Последовательности адаптеров и сайтов рестрикции используются в качестве сайтов связывания с парами стандартных AFLP-праймеров в двух последовательных раундах ПЦР: пред-амплификации и селективной амплификации.
Во время второго раунда (селективная амплификация) удлиненные праймеры с дополнительными селективными нуклеотидами на 3 -концах позволяют амплифицировать специфические наборы фрагментов ДНК, различной степени специфичности, в зависимости от числа и состава дополнительных нуклеотидов З -концов праймеров. В результате в ПЦР реакции амгош-фицируются только те рестрицированные фрагменты ДНК, в которых нук-леотиды фланкирующие сайты рестрикции соответствуют селективным нук-леотидам праймеров.
На конечном этапе наборы амплифицированные фрагменты анализируются посредством электрофореза в 6% денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Полученные AFLP спектры образцов будут характеризоваться, как одинаковыми, так различными по длине фрагментами ДНК. Эти отличия будут описываться как полиморфизм, а полиморфные AFLP фрагменты - как ДНК маркеры. Выявленный полиморфизм спектров обусловлен мутациями в сайтах рестрикции, а также инсерциями и делециями между сайтами рестрищии (Vos et al., 1995).
Подготовка первичной матрицы ДНК: реакции рестрикции и лигирования. Одним из наиболее существенных аспектов проведения AFLP генотипи-рования является качество ДНК, используемой в анализе. Очень часто получение некорректных результатов, связанных с появлением ложных ДНК фрагментов/маркеров связано с получением недорестрицированной ДНК из-за сильной загрязненности экстрагированных препаратов ДНК белками, полисахаридами и другими веществами, ингибиругощими ферменты рестрикции. Во избежание получения такого рода недорестриктов показатель чистоты (оптической плотности) экстрагированной ДНК должен находиться в пределах 1.6-1.9 OD260/OD280.
Рестрикция геномной ДНК и лигирование с адаптерами. Согласно методике (Vos at al., 1995)100-500 иг ДНК образцов инкубируется одновременно с двумя рекомендуемыми ферментами рестрикции (EcoRI/Trul) и Т4 ДНК ли-газой в течении 3 ч при температуре 37С с использованием 10 мкл буфера, 5 единиц каждой из рестриктаз, 2 единицами Т4 ДНК лигазы, 0.2 мМАТР ("Fermentas", США) и 0.1 MKMZJCORI адаптера, 1 мкМГпД адаптера, в общем объеме смеси 50 мкл. Использование буфера содержащего Tris.HAc, MgAc, КАс, DTT, BSA позволяет проведение одновременной реакций рестрищии и лигирования. Отсутствие фосфора на концах адаптеров предотвращает их взаимную сшивку. Образование сшивок между отдельными рестриктными фрагментами разрушается в присутствии рестриктаз. При этом рестрициро-ванные и лигированные с адаптерами фрагменты геномной ДНК не расщепляются, так как в местах лигирования изменяется сайт, узнавания рестрикта-зами. По истечении 3 ч (но не ранее) реакции должны быть приостановлены с помощью тепловой инактивации ферментов при 65С в течение 15 мин. Разведенный (10х) продукт рестрикции - лигирования подвергают двум последовательным раундам амплификации.
Микросателлитный анализ сортов перца С.аптшт, а также близкород ственных культурных видов Cfrutescens, C.chinense, Cbaccatum
По признаку «ранняя урожайность» лучшим комбинатором является линия Оранжевое чудо (бі = 1,3), в случае использования её в качестве материнского компонента скрещивания. По данному признаку также выделяются линии Мемфис и Желтый букет (табл.3.3.2). Но в случае с линией Мемфис, при использовании её в качестве материнского компонента, в 3 из 5 случаев гибридные комбинации дают лучшие показатели с эффектом гетерозиса и положительным сверхдоминированием. Тогда как гибридные комбинации с участием линии Желтый букет, как в качестве материнского, так и отцовского компонента скрещивания, проявляют степень выраженности показателя, значительно превосходящие средние ее значение родительских компонентов скрещивания (табл.3.3.3).
У линии Пирати при использовании её в качестве материнской формы, в комбинировании с линией Мемфис выявляется высокая варианса специфической комбинационной способности (СКС = 0,96). Данная гибридная комбинация (Fj Пирати х Мемфис) отличается высокой ранней урожайностью - 4,7 кг/м . Кроме этого линии Чаймс, Екатерина и Мадона также выделяются высокой СКС и гибридные комбинации с их участием отличаются высокой ранней урожайностью: РіМадона х Мемфис - 4,3 кг/м , Б адона х Желтый букет - 3,94 кг/м , БіЧаймс х Оранжевое чудо - 3,57 кг/м", Fj Екатерина х Оранжевое чудо - 3,93 кг/м .
Сравнительный анализ показателей эффекта и вариапс специфической комбинационной способности линий перца сладкого по признакам «общая урожайность» и «ранняя урожайность» показывает, что ранги генотипов значительно меняются (табл.3.3.4). Так лучший зффеїсг комбинационной способности со всеми линиями выявляет Мемфис (бі=2,91), за ним располагаются Оранжевое чудо и Пирати бі =1,65 и 1,21 соответсвенно (табл.3.3.4).
Высокой комбинационной способностью по признаку «общая урожайность» обладает линия Мемфис, при использовании её в качестве отцовского компонента. Высокой общей урожайностью выделяются гибридные комбинации с её участием - БіМадона х Мемфис - 10,84 кг/м2, БіЧаймс х Мемфис - 10,55 кг/м, БіПирати х Мемфис - 11,50 кг/м, Fi Желтый букет х Мемфис - 10,73 кг/м2. В зависимости от показателя общей урожайности конкретного родителя вариансы СКС родительских линий значительно различаются, но общая тенденция лучшего комбинатора сохраняется.
По признаку «общая урожайность» одной из лучших комбинаций является БіЧаймс х Желтый букет - 11,55 кг/м2. По результатам исследований видно, что линия Чаймс в качестве материнского компонента имела положительные значения СКС в четырех из пяти случаев и в трех из них наблюдался эффект гетерозиса с положительным сверхдоминированием - Нр 1. Также в трех из пяти комбинаций наблюдался эффект гетерозиса, при использовании данной линии в качестве отцовского компонента скрещивания.
Эффекты и вариансы специфической комбинационной способности по средней массе плода, в основном, носят промежуточный характер. Такое проявление данного признака вполне объяснимо, так как уровень урожайности определяется числом плодов на растении и масса плода при этом имеет незначительное влияние на общий результат.
По средней массе плода лучшие показатели были отмечены у гибридных комбинаций: РіМадона х Оранжевое чудо - 251 г, РіМадона х Пирати - 247г, ТіМадона х Мемфис — 237г, БіПирати х Оранжевое чудо - 226г и эффект гетерозиса наблюдался на уровне 2-10%.
По результатам проведенных исследований и анализа общей комбинационной способности мы не можем с уверенностью предсказать и оценить специфическую комбинационную способность конкретной линии. Однако существует достаточная вероятность, что родительские формы с очень высокой ОКС будут иметь в большинстве случаев и высокую СКС.
В многочисленных исследованиях указывается, что высокие положительные значения СКС часто наблюдаются при скрещивании родителей с высокой и низкой ОКС, что подтверждается и в наших исследованиях по таким признакам как «ранняя урожайность», «общая урожайность», «продолжительность периода всходы - биологическая спелость», «раннеспелость».
Эффект гетерозиса по основным хозяйственно ценным признакам Проведенное в 2012 году предварительное сортоиспытание гибридных комбинаций Fi перца сладкого в условиях малообъемной гидропоншси показало, что 15 (71%) комбинаций из 21 оказались ранними по продолжительности периода «всходы-биологическая спелость», чем родительские компоненты скрещивания. У этих гибридных комбинаций по признаку «всходы - биологическая спелость» эффект гетерозиса составил 0,4 - 9,6%. Беря в расчет тот факт, что сами родительские компоненты скрещивания являются раннеспелыми (продолжительность данного периода 115-126 суток), получение такого эффекта гетерозиса весьма положительно скажется на селекционном процессе. По продолжительности периода «всходы - биологическая спелость» самыми лучшими гибридными комбинациями стали Fi Екатерина х Мемфис - 113 суток (эффект гетерозиса 9,6%), РіЧаймс х Желтый букет - 111 суток (эффект гетерозиса 2,8%) и FL Желтый букет х Оранжевое чудо - 109 суток (4,6%) (табл.3.3.6).
Применение исследованных микросателлитных локусов для паспортизации сортов перца С.аптшт и видов Cfrutescens, C.chinense, Cbaccatum
Гибридная комбинация \ Мадона х Желтый букет Анализаруя данные молекулярно-генетического анализа линий Мадона и Желтый букет, являющихся родительскими формами данного гибрида, можно сделать вывод, что это связано не только с тем, что они находятся в разных кластерных группах, выявляемых с помощью AFLP-маркирования, но и обладают различными комбинациями аллельных вариантов 4-х микросателлитных (SSR) локусов (Мадона - С1ас,СЗв,С5А,С9аА, Желтый букет - С1ав,СЗА,С5А,С9ав), что свидетельствует об относительно высоком уровне полиморфизма данных образцов и их генетической удаленности.
Таким образом, показана возможность использования данных молекулярного анализа при подборе пар для получения гибридов с высоким эффектом гетерозиса и выделены перспективные гетерозисные гибридные комбинации перца сладкого в условиях малообъемной гидропоники по ранней и общей урожайности с комплексом хозяйственно-ценных признаков, в том числе раннеспелость, масса плода, содержание витамина С, содержание Сахаров и сухого вещества. Основываясь на полученные экспериментальные данные, определена степень доминантности вышеназванных признаков и установлена закономерность характера наследования признаков в гибридных комбинациях Fi.
В последнее десятилетие изучение генома перца связано с развитием современных молекулярных методов (Рыжова и др., 2010; Kochieva et al., 2004). Проводятся исследования по маркированию локусов некоторых количественных признаков и устойчивости к абиотическим факторам, однако основная часть хозяйственно ценных признаков, обуславливающих экономическую составляющую выращивания перца и так необходимых селекционеру, пока остаются вне изучения.
Одними из таких генов являются гены углеводного метаболизма, такие как, например, глюканфосфорилаза, сахарозосинтаза и инвертаза, определяющие такие важные хозяйственные признаки как, содержание Сахаров и крахмала и также они вовлечены в формирование устойчивости растений к холоду.
Исходя из этого поиск потенциальных источников новых генов и их аллельных вариантов, вовлеченных в метаболизм Сахаров и крахмала, и которые можно ввести в селекционный процесс, является одним из наиболее перспективных направлений в современных исследованиях.
Поэтому целью работы являлся анализ полиморфизма генов углеводного обмена. Для анализа были выбраны три ключевых гена метаболизма Сахаров и крахмала, которые ассоциированы с устойчивостью к абиотическим факторам, таким как холодовой стресс. Для анализа были выбраны названые ранее гены альфа-глюканфосфорилаза, сахарозосинтаза и инвертаза.
Данное исследование представляет собой часть работы по идентификации новых полноразмерных генов Stp23, Sus4 и Pain-1 семейства Solanaceae.
Фермент альфа-глюканфосфорилаза приводит к фосфоролитической деградации крахмала, катализируя обратимую реакцию, в результате которой а(1- 4) глюкозидная связь на нередуцирующем конце боковой цепи глюканов претерпевает фосфоролиз: от цепи отщепляется концевой остаток глюкозы.
Для анализа полиморфизма нами был выбраны участок гена, включающий основной функциональный глюканфосфорилазный домен, кодируемый последовательностью экзон II- IV (рис.3.4.1.).
Помимо выбора именно функциональных последовательностей гена, выбор для анализа именно этих фрагментов основывался также на том, что ранее по этим последовательностям был выявлен полиморфизм у сортов картофеля S. tuberosum (Li, 2008). Из этого следует высокая вероятность вариабельности данного участка гена и у представителей видов рода Capsicum.
Для анализа были выбраны семь сортов С.аппиит (RS 87001, Пурпурная красавица, Pirati, Memphis, Здоровье, Сирень и Маяк), также два диких образца С.аппиит (924890, 924354). Культурные виды также были представлены тремя образцами C.frutescens (сорт Tabasco, 924528, 924278), тремя образцами C.chinense (17220, 924933, 924239) и образцами C.baccatum и С. pubescens. Из дикорастущих видов в коллекцию входили C.galapagoense, C.eximium, C.cardenasii, C.chacoense, C.praetermisswn и C.tovarii.
Амплификация фрагментов гена Stp23 с разработанными праймерами. Так как последовательность гена Stp23 для перца неизвестна, то основываясь на последовательности гена у томата и картофеля (Слугина М.А., личное сообщение) были разработаны праймеры.
Со всеми образцами из собранной коллекции ДНК были поставлены реакции амплификации с использованием разработанных праймерных пар.
Для гена Stp23 экзон II-IV были получены амгашфикаты для сортов С.аппиит - RS 87001, Пурпурная красавица, Pirati, Memphis, Здоровье, Сирень и Маяк и для видов C.frulescens (образец 924278), C.chinense (образец 924239), C.baccatum, C.pubescens, C.galapagoense, C.eximium, C.chacoense, C.tovarii.
Получение первичных нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Stp23. Для определения первичных нуклеотидных последовательностей гена Stp23 полученные ГЩР фрагменты были секвенированы с 5 - и 3 -концов с использованием тех же праймеров, что использовались для амплификации. Таким образом, были получены первичные нуклеотидные последовательности 15 образцов гена Stp23 включающего фрагмент экзон II -IV.
Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемого участка гена Stp23 составила 696-705п.н.. При этом суммарная длина анализируемых интронов составила 392-401 п.н.. Суммарная длина экзонов составляла 304 п.н..
В последовательностях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектировано 18 сайтов единичных нуклеотидных замен (SNP) и 4 индели различной длины и локализации (табл.3.4.1).
Как и ожидалось, у анализируемых последовательностей гена Stp23 наиболее консервативными были экзоны. В последовательностях экзонов II, III и IV было детектировано 5 SNP против 13 SNP - в интронах. Наибольшее число замен локализовалось в области экзонов II и III (таблица 3.4.1).
На участке экзона II доступном для анализа выявлен один вариабельный сайт. Уровень его полиморфизма составляет 5,6 %. В составе экзона III, помимо единичных нуклеотидных замен (2 SNP), нет никаких инсерций и делеций, что как правило характерно для экзонов. В проанализированной последовательности, относящейся к экзону IV выявлено две единичных нуклеотидных замены. Как и ожидалось, большая часть замен была локализована в интронных последовательностях (13 SNP). Степень полиморфизма в интронах составила 72,2 %.
