Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Инсерционный мутагенез ...11
1.1.1. Мутационный процесс 11
1.1.2. Открытие мэ 12
1.1.3. Влияние мэна нестабильность генома 13
1.1.3.1. Классификация МЭ 13
1.1.3.2. Структурная организация транспозонов Р и hobo 17
1.1.3.3. Свойства МЭ 18
1.1.3.4. МЭ в системе гибридного дисгенеза 21
1.1.3.5. Механизмы перемещения МЭ 24
1.1.3.6. Регуляция транспозиций и количества МЭ в Р-М и Н-Е системах гибридного дисгенеза 26
1.1.4. Влияние различных факторов на перемещение мэ 28
1.2. Мэ в природных популяциях 32
1.3. Генетическая нестабильность в линиях из природы 36
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Линии мух 41
2.2. Методы 42
2.2.1. Процедура получения производных линий 42
2.2.2. Метод Мёллер-5 или РЦПЛМ для обнаружения и учета рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме 42
2.2.3. Тест на соматические мутации и рекомбинации (SMART) 44
2.2.4. Облучение мух 46
2.2.5. Методика приготовления давленых препаратов слюнных желез личинок D. melanogaster 46
2.2.6. Мечение ДНК зондов 47
2.2.7. Флуоресцентная in ^//«-гибридизация 47
2.2.8. Выделение ДНК 49
2.2.9. ПЦР-анализ 49
2.2.10. Статистическая обработка данных 50
ГЛАВА 3. Результаты 52
3.1. Анализ популяции D. melanogaster Умани на наличие/отсутствие hobo- и Р-элементов 52
3.2. Оценка линии у2'717 с помощью теста РСПЛМ 56
3.3. Анализ распределения hobo- и Р-элементов в Х-хромосомах линии у2'717 и ее производных 57
3.4. Анализ линий D. melanogaster на активность /го&о-элемента в клетках соматических тканей 71
3.5. Исследование влияния радиации на карину распределения /гобо-элементов в хромосомах линии у2'717 80
ГЛАВА 4. Обсуждение 85
4.1. hobo- и Р-элементы в популяции D. melanogaster Умани 85
4.2. Рецессивные'летальные мутации в;/"7/7-Х-хромосоме 89
4.3. Распределение hobo- и Р-элементов в Х-хромосомах D. melanogaster 89
4.4. Активность hobo-эпеиета в клетках
соматических тканей D. melanogaster 93
4.5. Воздействие радиации на поведение hobo-элемента в линину2'717 95
Выводы 98
Список литературы
- Мутационный процесс
- Процедура получения производных линий
- Анализ распределения hobo- и Р-элементов в Х-хромосомах линии у2'717 и ее производных
- Рецессивные'летальные мутации в;/"7/7-Х-хромосоме
Введение к работе
Актуальность >
Мобильные элементы являются необычайно интересными и важными объектами исследования современной генетики. МЭ распространены повсеместно и составляют существенную часть геномной ДНК многих изученных организмов. Так, геном кукурузы на 50% состоит из транспозонов, а в геноме человека, при их общем уровне содержания 30% насчитывается свыше 4 млн. отдельных копий (Kidwell, Lisch, 1997). Транспозиционная активность МЭ вызывает до 80% спонтанных мутаций и является основной причиной их возникновения (Хесин, 1984).
МЭ имеют определенную структурную организацию, благодаря которой могут перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. МЭ имеют способность увеличивать число копий в геноме хозяина, вызывать мутации, встраиваясь в гены или окрестности генов, служить причиной хромосомных перестроек, влиять на фертильность особей и даже приводить организм к гибели. Достаточно неожиданной оказалась способность мобильных элементов изменять - как понижать, так и повышать - уровень активности близлежащих генов. Изучение первичной последовательности МЭ выявило, что в их структуре есть большое количество регуляторных сайтов и сигнальных последовательностей, а это означает, что МЭ могут очень интенсивно воздействовать на работу гена, не разрушая сам ген (Гвоздев, 19986). Возникающие мутации могут не сказываться на жизнеспособности организма, если они возникли в гене, который отвечает, например, за формирование фенотипического признака. В редких случаях мутационные изменения могут иметь адаптивное значение и особи с такими мутациями получают преимущество перед другими сородичами для выживания и оставления потомства. Однако, чаще всего, мутации вредны для организма и приводят к стерильности или гибели особи.
Вопрос о том, какова роль МЭ, являются ли они паразитами или выполняют ряд важнейших функций в геноме, до сих пор не решен. Мобильные элементы долгое время рассматривались как представители так называемой эгоистичной ДНК, перед которой стоит единственная цель - размножиться в геноме и
7 паразитировать на нем. Эта точка зрения предполагает, что геном вынужден бороться с эгоистичной ДНК и ограничивать ее размножение.
В то же время не лишены основания представления о том, что естественному отбору подвергаются не только хозяйские гены, но и эгоистичная ДНК. Нельзя исключить, что в результате естественного отбора представители паразитической ДНК будут использованы для нужд генома,' если появятся полезные функции этих эгоистичных фрагментов ДНК. Такое предположение начинает получать подтверждения. Показано, что МЭ могут выполнять ряд полезных функций в геноме хозяйской клетки. МЭ незаменимы при выполнении таких функций как V(D)J рекомбинация в клетках иммунной системы млекопитающих, в поддержании теломер у дрозофилы и в процессе репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей (Kidwell, Lisch, 1997). Ряд исследований показал, что МЭ участвуют в реакции на стрессовые воздействия (Strand, McDonald, 1985; Junakovic et al, 1986; Ратнер и др., 1992; Аникеева и др., 1994; Забанов и др., 1995; Ратнер, Васильева 1996; Васильева и др., 1997; Шоханов и др., 1997; Handler, Gomez, 1997; Ратнер и др., 2001; Бубенщикова и др., 2002; Журавель, Борейко, 2002; Васильева и др., 2003). Исходя из этого, можно предположить, что МЭ играют важную роль в геноме как контролирующие элементы. Из стрессовых воздействий наиболее мощное влияние на индукцию транспозиций оказывают внутригеномные процессы: изогенизация, аутбридинг, гибридный дисгенез.
hobo-элемет относится к классу транспозонов. Он является одним из трех мобильных элементов, наряду сР-и /-элементами, обусловливающих гибридный дисгенез у D. melanogaster (Bingham, 1982; Blackman et al, 1987; Yannopoulos et al., 1987; Bucheton, 1990). Перемещения МЭ при гибридном дисгенезе у дрозофилы происходят преимущественно в клетках зародышевого пути. Причина различной активности МЭ в клетках соматических и генеративных тканей подробно изучена у Р-элемента и заключается в особенностях тканеспецифичного сплайсинга транспозазной пре-м-РНК (Laski et al, 1986; Siebel, Rio, 1990). Однако в ряде работ были описаны случаи перемещения ретротранспозонов в соматических клетках у высших организмов (Georgiev et al, 1990; Kim, Belyaeva, 1991; Driver, McKechnie, 1992). Что касается транспозонов, существуют единичные данные, прямо или косвенно свидетельствующие о соматической активности этих элементов (Lim, 1981;
8 Yannopoulos et al, 1983; Geyz, van Schaik, 1991; Ким, Беляева, 1991), однако, в целом, вопрос об активности транспозонов в соматических клетках у Drosophila melanogaster остается открытым. Выявление возможности и изучение особенностей транспозиций МЭ в соматических клетках имеет большое значение, поскольку в ряде работ описан повреждающий эффект соматических перемещений Р-элемента (Engels et. al, 1987; Woodruff, 1992). Более того, соматические мутации представляют собой потенциальную угрозу малигнизации клеток.
Таким образом, изучение особенностей поведения в геномах разных линий D. melanogaster широко распространенного в природных популяциях /гобо-элемента является актуальным, поскольку МЭ имеют существенное значение в формировании генетической изменчивости.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является исследование транспозиционной активности /гобо-элемента в клетках генеративных и соматических тканей в линиях Drosophila melanogaster, выделенных из природной популяции Умани в период вспышки мутаций по гену yellow.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Описать распределение полноразмерных и делегированных копий hobo-элементов в геноме D. melanogaster в природной популяции Умани в динамике за период 1979-2004 гг.
Оценить уровень нестабильности генов в Х-хромосомах линии у2'7'7 D. melanogaster Умани, используя метод рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций.
Провести исследование транспозиционной активности /гобо-элементов в ряду последовательных поколений в линии у' D. melanogaster и у производных этой линии на основе анализа паттерна сайтов локализации hobo в Х-хромосомах самцов.
Выявить наличие/отсутствие транспозиционной активности hobo в клетках соматических тканей /zofo-содержащих линий D. melanogaster с использованием методов (1) соматических мутаций и рекомбинаций на клетках крыла и
9 (2) флуоресцентной in .я/м-гибридизации на политенных хромосомах клеток слюнных желез.
5. Изучить влияние радиации, как внешнего мутагенного фактора, на картину распределения /гобо-элементов в политенных хромосомах в линии у2'117 D. melanogaster.
Научная новизна работы.
Для генетически нестабильных линий Drosophila melanogaster, выделенных из природной популяции Умани, впервые получены цитогенетические данные о распределении и транспозиционной активности /гобо-элемента в гене yellow и других локусах Х-хромосомы, которые дополняют проведенные ранее молекулярно-генетические исследования локусспецифической нестабильности гена yellow.
7 7/7
Показано, что нестабильность гена yellow исследованных у" -производных, вызванная активностью /гобоэлемента, является маркером активности hobo- и Р-элементов в других локусах Х-хромосомы.
7 7/7
Впервые описано, что в у' -Х-хромосоме при проведении скрещиваний с самками со сцепленными Х-хромосомами 0/"7;7-Х-хромосома наследуется патрилинейно), наряду с межаллельными переходами в локусе yellow наблюдается увеличение числа копий hobo. В ряду /"^-производных, отмечена особенность в поведении /го&о-элементов - преобладание частоты инсерций над частотой эксцизий hobo в Х-хромосомах.
В выделенной из природной популяции Drosophila melanogaster /"^-линии, не подвергавшейся воздействиям, индуцирующим транспозиции МЭ, обнаружена способность hobo к перемещениям в клетках соматических тканей.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные результаты развивают теоретическое представление о закономерностях поведения hobo в геноме дрозофилы, а также дополняют картину происходящих с /юбо-элементом процессов в локусе yellow и в геноме линий уманской популяции Drosophila melanogaster.
В работе получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что /го&оэлемент способен проявлять транспозиционную активность в клетках соматических тканей Drosophila melanogaster, выделенных из природной популяции.
Полученные результаты вносят вклад в представления об особенностях поведения транспозонов в соматических и генеративных тканях Drosophila melanogaster. Результаты работы следует учитывать в исследованиях, посвященных изучению активности МЭ у дрозофилы.
Результаты используются в курсе "Эволюционное учение" ФЕН НГУ. Структура и объем работы Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 116 страницах, включает 27 рисунков и 11 таблиц.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 2-й международной научно-практической конференции по вопросам медицинских и экологических эффектов ионизирующего излучения (Северск-Томск, 2003), на 3-м съезде ВОГиС (Москва, 2004), на Кейстоунском симпозиуме «Геномная нестабильность и репарация» (Таос, США, 2005), на отчетной конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005) и на отчётных сессиях ИЦиГ СО РАН 2003 и 2006 гг. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Мутационный процесс
В основе современной классификации МЭ лежат способы их перемещения в геноме. Класс I составляют ретровирусоподобные элементы, которые при перемещении используют обратную транскриптазу и механизм по схеме ДНК-РНК-ДНК (Finnegan, 1989; Сару et al, 1998) (рис. 1). Все они содержат гены gag и рої, которые кодируют белки вирусного капсида - GAG, обратную транскриптазу, рибонуклеазу Н и интегразу, необходимые для активности ферментов для производства кДНК из РНК и включения в геном (Kazazian, 2004). Данный класс МЭ включает два подкласса. Элементы первого подкласса - это ретротранспозоны с длинными (размером несколько сотен нукл отидных пар) терминальными повторами с обоих концов, благодаря чему получили название LTR-ретротранспозоны (Сару et al, 1998). Эти элементы по своей структуре очень напоминают ретровирусы (Kidwell, Lisch, 1997; Kazazian, 2004). Ко второму подклассу относятся LINEs (long interspersed nuclear elements) и SINEs (short interspersed nuclear elements) (Capy et al, 1998). LINEs содержат ORF, кодирующую обратную транскриптазу. SINEs не содержат рабочих ORF и имеют очень маленький размер (менее 500 пар оснований). Обе эти группы имеют на 3 -конце несколько повторов ТАА, расположенных тандемно (Гришаева, Иващенко, 1997).
Класс II включает в себя ДНК-транспозоны, или классические транспозоны (рис. 1). Они перемещаются с помощью фермента транспозазы, которая узнает элементы и обеспечивает вырезание их из одного локуса и встраивание в другой (ДНК-ДНК-механизм). Элементы этого класса имеют инвертированные терминальные повторы (Сару et al, 1998). Инвертированные повторы необходимы для перемещения элемента, которое осуществляется благодаря их сближению друг с другом и узнаванию транспозазами. Инвертированные повторы сближаются и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина (рис. 2) (Гвоздев, 1998а).
Все транспозоны имеют, по крайней мере, один ген, кодирующий транспозазу, и часто имеют дополнительные последовательности. При инсерции транспозонов в геном образуется дупликация сайта встраивания. Размер дупликации часто специфичен для транспозонов (Kazazian, 2004).
Элементы III класса - с длинными концевыми инвертированными повторами мало изучены, механизмы их перемещения не известны (Сару et ah, 1998) (рис. 1). hobo-эяемект принадлежит к семейству hobo-Activator-ТатЗ (hAT), Р-элемент выделяется в отдельное семейство (Calvi et al.y 1991). Р-элемент является одним из наиболее изученных транспозонов у Drosophila melanogaster. Несмотря на то, что Р- и hobo-элемент относятся к разным семействам, по некоторым структурным характеристикам Р-элемент подобен /zofo-элементу (McGinnis, 1983; Streck et ai, 1986). Полные автономные копии элементов hobo и Р имеют размеры 3,0 и 2,9 т.п.н., соответственно, hobo- и Р-элементы имеют короткие (12 и 31 пн) концевые инвертированные повторы, образуют дупликацию в месте инсерции из 8 пн и существуют как в виде полноразмерных, так и в виде делегированных производных (рис. 3). Дефектные Р- и hobo-элемент не способны к синтезу транспозазы, но благодаря сохранению терминальных и субтерминальных последовательностей, они могут перемещаться с использованием транспозазы полноразмерных элементов. Ген транспозазы /гобо-элемента состоит из 1 ORF, а Р-элемента - из 4 ORF, т.е. из 3 интронов и 4 экзонов (McGinnis, 1983; O Hare, Rubin, 1983; Streck et al, 1986) (рис. 3). У -элемента обнаружены повторы в 11 пн, которые располагаются на расстоянии 125 пн от конца элемента. Внутренняя часть Р-элемента содержит инвертированный повтор в 17 пн, разделенный 29 неповторяющимися нуклеотидами а так же небольшой инвертированный повтор, который, как показано для рядя белков, связывающихся с ДНК, влияет на специфическое белок-белковое взаимодействие (Rio, 1991). У йо&о-элемента в дополнение к концевым повторам имеется внутренний повтор Ті, являющийся усеченной копией концевого повтора и расположенный примерно в 240 нуклеотидах от правого конца hobo. Ближе к центру /гобо-элемента обнаружен S-сайт, содержащий короткие "Short" повторы или ТРЕ-повторы: несколько копий последовательности из 9 нуклеотидов фланкированы укороченными последовательностями (Streck et al.y 1986). Особенностью этого района является высокая скорость мутация в отличие от других консервативных частей hobo-элемента. К настоящему времени найдено большое разнообразие /шбо-элементов по количеству ТРЕ-повторов в S-регионе (Bonnivard et al, 2002). Третий повтор,
Тонкая структура мобильных элементов: Р (а), его делегированных производных первого (б) и второго или КР (в) типов, а так же элемента hobo (г). Черными треугольниками отмечены внутренние повторы. ORF - открытые рамки считывания, TL И TR - левый и правый концевые инвертированные повторы, Ж -внутренний инвертированный повтор, ZIP - область лейциновой «молнии», ТІ -усеченная копия концевого повтора, S - 15 копий короткого повтора, L - 2 копии длинного повтора (Гришаева, Иващенко, 1997). который был найден внутри hobo, состоит из 20 нуклеотидов, "Long" повтор. Две тандемных копии этого повтора располагаются выше ORF1 (рис. 3) (Streck et al., 1986).
МЭ обладают рядом свойств, таких как их способность к перемещению, встраиванию в гены, изменению активности генов, способность вызывать перестройки генов и хромосом. Вследствие этого, МЭ играют важную роль в жизнеспособности и эволюционной адаптации, как отдельных индивидуумов, так и целых популяций. Исследования природы мутаций Drosophila показало, что большинство этих мутаций вызвано инсерциями МЭ в гены. Последствия внедрения МЭ определяются как природой гена (какую функцию выполняет ген, какого его интроцно-экзонное устройство) так и природой МЭ, который внедрился в данный ген. Сами МЭ несут в себе множество знаков инициации и терминации транскрипции, собственные гены с интронами и экзонами, следовательно, способны влиять на регуляцию экспрессии генов (Гвоздев, 19986).
При встраивании МЭ в ген возможно несколько сценариев событий. Внедряясь в ген, МЭ может повредить экзон, разорвав его, и тогда ген будет лишен возможности кодировать полноценный белок. Так, например, одна из спонтанных мутаций гена rudimentary - r p Drosophila связана с инсерцией ретротранспозона mdg3 в шестой экзон данного гена (Zerges et al, 1992). Нарушение работы гена vermilion и появление мутантных аллелей (vy, v2 и v ) имеет место в случае инсерции Dm412 B первый экзон этого гена (Fridell et al., 1990; Searles et al, 1990). При попадании МЭ в область экзона, может иметь место преждевременная терминация транскрипции гена, что так же приведет к нарушению его функционирования (Karlik, Fyrberg, 1985). Попадая в район промоторов или энхансеров, МЭ может повредить регуляторную зону гена, что, в свою очередь, приведет к изменению уровня экспрессии гена. В качестве примера можно привести инсерцию gypsy выше точки инициации транскрипции гена yellow дрозофилы, что вызывает потерю экспрессии этого гена в специфичных тканях (Corces, Geyer, 1991). Также у кукурузы инсерция Ми {Mutator) в ТАТА-домен гена Adhl вызывает изменения в тканеспецифичной экспрессии РНК (Kloeckener-Gruissem et al, 1992), причем эксцизия этого элемента вызывает серию сложных дупликаций и инверсий, что приводит к дополнительным изменениям в тканеспецифичной экспрессии (Kloeckener-Gruissem, Freeling, 1995). Инсерция ретротранспозона torn в локус От приводит к тканеспецифичной индукции экспрессии этого гена и изменению в морфологии глазу дрозофилы (Tanda, Corces, 1991).
Процедура получения производных линий
Начало цепочке производных дала природная линия у2 717 из Умани. В одной из семей этой линии выщепился у+-самец, которого скрестили с самками C(I)DX,ywf/Y и основали производную линию у"717а. Остальных братьев у+-самца из той же семьи у2 717 скрестили с самками C(I)DX,ywf/Y и получили линию у2-7,7( 3). Среди потомков линии у"711а обнаружили мутантного у2-самца, его скрестили с самками C(I)DX,ywf/Y и получили линию у2-717а1% Нормальный у+-самец, выщепившийся среди потомков линии у2 717а1 при скрещивании с самками C(I)DX,ywf/Y дал начало линии у+ 7,7а1кг где был обнаружен самец с фенотипом средним между у1 и у2, который дал начало линии у"-717а,кз-2ш Позже в потомстве линииуг-717а1к нашли несколько мутантных самцов. Один из них дал начало линии у2-7,7а,К\ Таким образом, самцы всех производных линий имеют одну и ту же X-хромосому, ведущую свое происхождение от исходного самца линии у2 717 (производные линии были получены М.А. Волошиной).
В этом тесте используется Х-хромосома Мёллер-5, которая характеризуется наличием в ней двух инверсий In (1) scS12 sc8R+s, scSI sc8 wa В, за счет которых в этой хромосоме подавлен кроссинговер. Хромосома маркирована мутациями В и wa, что позволяет без наркотизирования мух проводить оценку наличия или отсутствия интересующего фенотипа непосредственно через стекло пробирки. Инверсии не связаны с рециссивным летальным действием, поэтому самцы и гомозиготные самки жизнеспособны и фертильны. В качестве контроля использовались самцы линии Canton S, в качестве опыта- самцы линии У 777.
Девственных самок Мёллер-5 скрещивали с самцами контрольной (Canton S) и опытной (у2 717) линий (рис. 6). Нормальных фенотипически самок F гетерозиготных по Х-хромосоме, индивидуально скрещивали с братьями Мёллер-5.
Если в Х-хромосоме самца-родителя летальная мутация не возникала, то в F2 в каждой семье должны быть представлены все 4 класса потомков в соотношении 1:1:1:1. Если же самка из F1 несла летальную мутацию, то в данной семье в F2 нормальные самцы отсутствовали.
Метод соматических мозаиков - somatic mutation and recombination test (SMART) (Lawrence et al., 1986) был разработан для оценки мутагенного и канцерогенного воздействия различных химических соединений. SMART на клетках крыла Drosophila melanogaster оказался наиболее удобным для практического использования (Graf etal, 1989; Krogulski, 1994).
В тесте используются линии Drosophila melanogaster, несущие рецессивные мутации mwh и fir. У мутантной мухи mwh/mwh вместо одной ворсинки каждая клетка содержит несколько ворсинок разной длины. Мутация jlr проявляется как деформированная ворсинка, имеющая форму пламени.
С помощью этого теста можно оценить частоту рекомбинационных событий, происходящих в ЗЬ-хромосоме. Поскольку маркерная мутация multi wing hairs (mwh; З - 0,3) располагается на самом конце ЗЬ-хромосомы, то любые одиночные рекомбинации, происходящие в этом плече, можно выявить при анализе количества щетинок на клетках крыла имаго (рис. 7).
Мух выращивали в стандартных условиях, при 25 С на дрожжевом корме. Препараты делали из крыльев мух F\, полученных при скрещивании виргинных самок линии mwh с самцами анализируемых линий. В скрещивании типа mwh х в анализ брали крылья потомков с генотипом mwh/flr3, т.е. с нормальной формой крыльев. Орган-мишень - имагинальный крыловой диск, на стадии предкуколки имеет размер 24400 клеток (Roberts, 1986). Когда деление клеток в крыловом имагинальном диске прекращается, орган перестает быть чувствительным к какому-либо повреждающему воздействию. Чем раньше произойдет мутационное событие, тем больше будет размер мутантного пятна (Ashburner, 1989; Graf, 1995).
Приготовление препаратов из крыльев мух для микроскопического анализа: на предметное стекло в каплю дистиллированной воды помещали несколько мух из 70% этанола. Пинцетом с острыми браншами отрывали крыло у самого основания, придерживая муху препаровальной иглой. Отделенное крыло переносили в каплю раствора Фора на другое предметное стекло. После того, как в каплю раствора было перенесено 10-15 крыльев, ее накрывали покровным стеклом. Придавливать покровное стекло не рекомендуется, так как нарушается естественный рисунок расположения ворсинок на крыле и на жилках. После того, как препараты подсохли, их проанализировали.
Микроскопический анализ крыльев: проводили на световом микроскопе при увеличении х400 (Graf, 1992). Анализ начинали всегда с одного и того же участка крыла и сканировали крыло в одном и том же направлении, учитывая, что крыло состоит из 2-х слоев клеток, расположенных в разных плоскостях (непрерывно работая микровинтом). Мутации подразделяли на классы по размеру клеточных клонов на одиночные пятна, являющиеся результатом одного мутационного события, малые пятна, состоящие из 2 клеток и большие пятна - клоны, включающие более 2 мутантных клеток.
Состав и приготовление раствора Фора (Wieshaus, Nusslein-Volhard, 1986). Смесь компонентов (гуммиарабик - 6 г, глицерин - 4 мл, хлоралгидрат - 10 г, вода дистиллированная - 10 мл) оставили на ночь до растворения, затем отцентрифугировали до просветления раствора.
Анализ распределения hobo- и Р-элементов в Х-хромосомах линии у2'717 и ее производных
С помощью флуоресцентной гибридизации in situ выявляли картину распределения и оценивали частоту транспозиций hobo- и Р-элементов на X-хромосомах линии у2 717 и фенотипически нормальных и мутантных производных, полученных в результате серий скрещиваний исследуемых самцов с самками
FISH-анализ Х-хромосом самцов линии у2 717 и ее производных на распределение hobo- и Р-элементов Исследование распределения hobo- и Р-элементов на Х-хромосомах самцов 2-717 линии у и ее производных показало, что каждая новая производная линия отличается от предыдущей по количеству и распределению /гобо-элементов в X-хромосомах. Первая в ряду производных, линия у+ 717а, была получена от самца с г 7 7/7 фенотипом у, выщепившегося в исходной линии у (рис. 10). Каждая последующая производная линия была получена из предыдущей и брала начало от вновь возникающего фенотипически мутантного/нормального по гену yellow самца путем последующего скрещивания с самками со сцепленными Х-хромосомами. Таким образом, самцы всех производных линий имеют одну и ту же Х-хромосому, ведущую свое происхождение от исходного самца линии у
Количество копий hobo на Х-хромосоме у каждой новой производной линии увеличивается (табл. 3, рис. 11). Например, если на У"7;7-Х-хромосомах 9 сайтов гибридизации /г ?6о-элемента, то на Х-хромосомах производной линии уи-717а1к3-2 у которая появилась примерно через пятнадцать поколений от момента получения первой производной, число сайтов гибридизации hobo увеличилось в 3 раза (табл. 3, рис. 11).
При сравнении картины распределения сайтов гибридизации hobo на X-хромосомах производных линий и исходной линии у2"717, частота перемещения hobo увеличивается с 4,7х10 3 в производной линии у2 717(15) до 1,2х10 2 на сайт, на Х-хромосому, за поколение в линии у2-717а1к3 (рис. 12). Это минимальная оценка частоты регистрируемых транспозиций, поскольку при расчете мы исходим из того, что для разных линий от момента получения до момента их анализа прошло 60-80 поколений. Подавляющее большинство перемещений, вероятнее всего, здесь и в табл. 4 и 5 пустая ячейка означает отсутствие гибридизации в соответствующем районе, а число знаков "+" отражает число сайтов гибридизации в данном районе. В скобках указано количество проанализированных личинок (данные действительны также для таблицы 5). произошло за первые несколько поколений после индукции транспозиций в ходе скрещиваний. После получения все линии сохранялись в лаборатории на протяжении 6 лет, поэтому, реальная частота транспозиций после индукции могла быть выше. При сравнении паттерна /гобо-элементов на Х-хромосоме каждой производной линии с предыдущей наблюдается тенденция постепенного увеличения частоты перемещений hobo. И в общем случае, чем дальше от исходной линии в ряду мутантных производных, тем выше число и частота перемещений hobo.
Из 9 «старых» сайтов гибридизации hobo, присутствующих на у2 717-Х-хромосоме, 8 сайтов сохраняются у всех проанализированных производных (табл. 3). Таким образом, исходные сайты проявляют высокую консервативность, при росте числа /ю&о-инсерций у производных. Частота инсерций в четырех линиях из пяти с высокой достоверностью превышает частоту эксцизий при сравнении паттернов hobo на Х-хромосомах самцов производных линий с исходной линии у2 7/7 (рис. 12). Если же сравнивать рисунки распределения hobo на Х-хромосомах каждой производной линии с предыдущей, сохраняется та же закономерность в поведении внедрившихся /го&о-элементов, а именно, /юбо-инсерции преобладают над /юбо-эксцизиями в трех из пяти производных (рис. 13).
Рецессивные'летальные мутации в;/"7/7-Х-хромосоме
Метод РСПЛМ позволяет не только выявить наличие рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме, но и дать количественную оценку частоты их возникновения. Если hobo активен, то при перемещении он может индуцировать микроделеции или встраиваться в жизненно важные гены и вызывать летальные мутации, что и позволяет оценить тест РСПЛМ. Активность МЭ с помощью такого теста уже изучали в работе (Юрченко и др., 1995). Авторы анализировали частоту возникновения рецессивных летальных мутаций в мутантных производных от Xz-хромосомы линиях, содержащих одну или несколько нестабильных видимых мутаций, показано увеличение частоты возникновения летальных мутаций у Drosophila melanogaster при отборе в направлении увеличения содержания в геноме мутаций с видимым фенотипическим эффектом и последующая элиминация такой хромосомы. Горячие точки летального мутагенеза авторы связывают с сайтами вырезания и встраивания МЭ (Юрченко и др., 1995). Мы изучали на предмет РСПЛМ нестабильную по гену yellow линию у2 717. Достоверной разницы между числом возникновения летальных мутаций в контроле и опыте не было обнаружено (табл. 6). Это свидетельствует о том, что, либо hobo-элемент не активен в этой линии, либо его перемещения не зарегистрированы, поскольку не затрагивают важных генов. Таким образом, нам не удалось подтвердить наличие активности hobo в линии
Распределение hobo- и Р-элементов в Х-хромосомах D. melanogaster
Анализ нестабильной У 7/7-Х-хромосомы из уманской популяции D. melanogaster в процессе последовательных скрещиваний линий показал, что hobo-обусловленная нестабильность гена yellow изученных уманских производных сопровождается повышенной активностью hobo- и Р-элементов не только в локусе yellow, но и во многих других локусах Х-хромосомы. Непостоянными оказались как hobo-, так и Р-сайты гибридизации (рис. 12, 17). Нестабильность hobo в исследуемых нами линиях после проведенных скрещиваний сохраняется на протяжении нескольких лет. Согласно литературным данным, признаки гибридного дисгенеза проявляются либо у Fl (Kidwell et al., 1977; Kidwell, 1979;
Bregliano et a/., 1980), либо у Fl и F2 (Гришаева, Иващенко, 1997). Подобная нашей, система нестабильности описана для МЭ Stalker, которая остается активной в течение десятков поколений (Georgiev et al, 1990). Однако, может ли являться наблюдаемое в изученных нами производных линиях увеличение скоростей транспозиций hobo и Р результатом дисгенеза? Методом ПЦР-анализа мы выявили наличие полноразмерного /гобо-элемента в геноме самок маркерной линии C(I)DX,ywf/Y, в то время как самцы исходной линии у2 717 и её производных не имеют полноразмерного hobo (рис. 19,20). Поскольку генетический состав аутосом у самок и самцов общий, полноразмерная копия/копии hobo-элементов должны быть в составе C(I)DX,ywf-xpouocoM, которые наследуются только самками. Исходя из имеющихся представлений, для перемещения транспозонов необходимым условием является наличие транспозазы, которую кодирует полноразмерная копия соответствующего МЭ. Возможно, в цитоплазме яиц самок присутствует транспозаза в виде готового продукта и, в этом случае, можно объяснить индукцию транспозиций hobo у самцов. Есть данные, что для системы Н-Е, в отличие от Р-М системы гибридного дисгенеза, направление скрещивания не имеет значения (Blackman et al, 1987; Lim, 1988, Bazin, Higuet, 1996; Гришаева, Иващенко, 1997; О Hare et al, 1998). Соответственно, //о&о-гибридный дисгенез может иметь место у производных. Объяснить высокую частоту транспозиций Р 2 717 элемента сложнее, так как самцы исходной линии у и её производных линий и самки линии C(I)DX,ywf/Y полноразмерного Р-элемента не содержат (рис. 21). Можно предположить, что делегированные Р-последовательности способны каким-то образом компенсировать друг друга и могут восстанавливать способность к продуцированию транспозазы - но это мало вероятно, или же возможна кросс-индукция Р-транспозиций транспозазой какого-либо другого МЭ. О возможности кроссмобилизации сообщалось а работе (Sundararajan et al, 1999). Авторы исследовали способность элементов /ЫГ-семейства - hobo и Hermes влиять друг на друга и вызывать кроссмобилизацию. Было обнаружено, что /шбо-транспозаза способна взаимодействовать с терминальными последовательностями не только hobo-элемекта. но и Яотиея-элемента. Хотя для Р-элемента данных по кроссмобилизации не приводилось, такую возможность нельзя исключить. hobo относится к транспозонам, перемещение которых происходит по механизму "вырезание-встраивание". В исследуемых же линиях поведение hobo больше походит на поведение ретротранспозона: "старые" сайты hobo, присутствовавшие в исходной У 7/7-Х-хромосоме, остаются на прежнем месте локализации, и появляется множество новых сайтов (табл. 3, рис. 11). Почему "старые" сайты hobo остаются? Возможно, они теряют свои терминальные инвертированные повторы и неспособны к эксцизиям. Сохранение старых сайтов и появление новых сайтов hobo может идти согласно модели увеличения общего числа копий МЭ, суть которой напоминает модель рекомбинации с репарацией двунитевого разрыва (Гришаева, Иващенко, 1997; Гвоздев, 1998а). При этом одна копия транспозона перемещается, а гомолог (с МЭ) используется как матрица для репарационного синтеза ДНК, что приводит к транспозиционному событию и восстанавливает донорский сайт в первоначальном виде. Похожие результаты описаны в работе (Буфф и др., 1993) где так же показаны транспозиции hobo и Stalker при сохранении родительских сайтов. Появляющиеся у производных новые сайты локализации hobo так же обладают высокой устойчивостью, что при подсчете выражается как преобладание инсерций над эксцизиями (рис. 12, 13). Несмотря на то, что иР-и /гобо-элементы имеют сходный механизм перемещения, в большинстве исследованных линий разницы между частотой Р-эксцизий и Р инсерций не обнаружено (рис. 17, 18). Показано, что Stalker способен к инсерциям и эксцизиям, хотя эксцизии происходят намного реже, что согласуется с нашими данными для Аобо-элемента (Georgiev et al, 1990). Заметим, что Stalker ретротранспозон, аРи hobo - транспозоны, поэтому можно предположить, что механизм перемещения не играет определяющей роли в образовании инсерций и эксцизии МЭ.
