Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов Щербо Сергей Николаевич

Введение к работе

Актуальность проблемы

В ряду современных генетических технологий особое место занимают методы генодиагностики, среди которых выделяются гибридизационный анализ (ГА) нуклеиновых кислот (НК) и амплифи- кационные методы, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выяснение закономерностей организации геномов микроорганизмов необходимо как для понимания природы и течения инфекционных процессов, так и создания лекарств нового поколения, действие которых направлено на специфические, определяющие патогенность мишени. В мире отмечается не только рост урогенитапьных инфекций, микозов и других, но и возникновение новых, ранее не известных, что требует совершенствования подходов для быстрой разработки наборов реактивов для молекулярного анализа геномов (МАГ) микроорганизмов, прямого выявления возбудителя и правильной постановки диагноза. Разнообразие амплификационных подходов в генодиагностике делает актуальной задачу исследования оптимального состава компонентов наборов реагентов для МАГ с целью выявления микроорганизмов.

Существенным преимуществом молекулярно-генетических методов проведения анализа является возможность одновременной и независимой детекции нескольких различных нерадиоизотопных гибридизационных меток или проведение мультипраймерной ПЦР. Развитие методов ГА и амплификации НК потребовало поиска новых, эффективных и доступных нерадиоизотопных меток, способов их введения в ДНК-зонды и праймеры, а также систем детекции образовавшихся продуктов.

Для успешного применения и правильной интерпретации результатов молекулярно-генетических методов в клинической лабораторной диагностике решающее значение имеет разработка оптимальных схем анализа клинического материала.

Таким образом, выяснение возможностей, преимуществ и ограничений в практическом применении гибридизационных и ПЦР технологий и необходимость повышения их информативности в множественном МАГ микроорганизмов представляет актуальную проблему.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилась разработка, создание, внедрение и повышение информативности методов множественного

нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.

Задачи работы:

1. Создание способов модификации ДНК различными гаптенами, используя химические и фотохимические реакции, исследование спектрально-люминесцентных и фотохимических свойств предложенных биотинилирующих агентов, с целью повышения чувствительности ДНК- зондов в нерадиоизотопном гибридизационном анализе.

2. Разработка эффективных нерадиоизотопных методов детекции гибридизационных ДНК-зондов не уступающихся по чувствительности радиоизотопным, исследование механизмов образования межмолекулярных ассоциатов и коллоидных частиц красителей с целью внедрения указанных подходов в диагностическую практику.

3. Создание новых теоретических и практических подходов в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.

4. Внедрение оптимальных схем применения молекулярно-генети- ческих технологий на основе сравнительной оценки эффективности нерадиоизотопного гибридизационного анализа, ПЦР и других методов в клинической лабораторной диагностике. Разработка новых приемов пробоподготовки различных клинических образцов, содержащих грибы, микроорганизмы, бактерии, вирусы.

5. Исследование оптимального состава компонентов, унификация и стандартизация подхода к способу формирования наборов для оценки структурно-функционального состояния геномов микроорганизмов.

Научная новизна работы

5. 1. Созданы новые способы модификации ДНК различными гаптенами с использованием химических и фотохимических реакций. Разработаны эффективные и чувствительные методы детекции нерадиоизотопных гибридизационных ДНК-зондов, сопоставимые с радиоизотопными, с целью внедрения указанных подходов в диагностическую практику.

   2. Разработаны теоретические и практические подходы в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов

   3. Выявлена роль нерадиоизотопного гибридизационного и ПЦР анализов в системе методов клинической лабораторной диагностики, определена их информативность и эффективность в молекулярном анализе геномов микроорганизмов, грибов и вирусов.

   4. Впервые сформулирован унифицированный подход к способу создания наборов реагентов для молекулярного анализа геномов микроорганизмов на основе информационных технологий и формирования биотехнологической структуры.

   Практическая значимость полученных результатов

   5. 4. 1. Разработаны, созданы, утверждены и внедрены в практику здравоохранения России и Украины наборы реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей хламидия трахоматис, микоплазма гоминис, микоплазма гетниталиум, уреаплазма уреалитикум, нейссерия гонорея, вируса простого герпеса, цитомегаловируса, трихомонас вагиналис, кандида альбиканс, гарднерелла вагиналис, вируса папилломы человека высокого риска, вируса папилломы человека низкого риска, гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита гепатита О, гепатита ТТ\/, лактобацилл и гарднереллы, микобактерий туберкулезного комплекса, боррелии, вируса Эпштейн-Барра, генотипов вируса гепатита С, вируса герпеса 6 типа методом полимеразной цепной реакции, а также набор реагентов для выделения ДНК из биологического материала для последующего анализа методом ПЦР (ДНК-АМ-ускоренная пробоподготовка). Указанные наборы реагентов внедрены в отечественную медицинскую практику впервые.

         2. Создан и сертифицирован (№ РОСС Яи. ИМ02.В07420) первый отечественный комплект лабораторных приборов для проведения ПЦР- анализа (программируемый термостат, термостат для температурной подготовки проб к проведению ПЦР-анализа, центрифуга-вортекс для осаждения и перемешивания биологических проб для ПЦР-анализа, прибор для электрофореза образцов ДНК при проведении ПЦР-анализа, столик с УФ-подсветкой для визуального контроля результатов гель- электрофореза при проведении ПЦР-анализа).

         3. Материалы исследования стали основой методических рекомендаций МЗ РФ № 95-106 "Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции".

         4. По материалам диссертационной работы в основное и постдипломное медицинское образование внедрены: учебное пособие «Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии», пособие для врачей «Папилломавирусная инфекция Клиника, диагностика, лечение».

         Основные положения, выносимые на защиту.

         Новый подход к применению нерадиоизотопных гибридизационных и ПЦР технологий для МАГ микроорганизмов, включая множественный нерадиоизотопный гибридизационный и мультипраймерный ПЦР методы, а также способ формирования наборов для МАГ, позволяет проводи (ь высокоспецифичную и высокочувствительную идентификацию различных возбудителей инфекционных заболеваний человека.

         1. Способы модификации ДНК различными гаптенами с использованием химических и фотохимических реакций, с целью наиболее эффективного применения (повышения чувствительности ДНК-зондов и ускорения проведения реакции) в нерадиоизотопном гибридизационом анализе геномов.

         5. 4. 4. 1. Чувствительные и эффективные методы детекции нерадиоизотоп- ных гибридизационных ДНК-зондов, сравнимые по чувствительности с радиоизотопными, с целью их внедрения в клиническую диагностическую практику.

                  2. Новые теоретические и практические подходы в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.

                  3. Оптимальные схемы применения молекулярно-генетических методов и результаты сравнительной оценки эффективности нерадиоизотопного гибридизационного, ПЦР-анализа в клинической лабораторной диагностике. Изучение наиболее рациональных подходов к пробоподготовке и проведению ПЦР для различных клинических образцов, содержащих грибы, микроорганизмы, бактерии, вирусы.

                  4. Оптимальный состав компонентов наборов реагентов для унификации и стандартизации подхода к способу формирования набора для оценки структурно-функционального состояния геномов микроорганизмов.

                  Апробация работы

                  Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1 -ой, 2-ой и 3-ей Всероссийских научно-практических конференциях "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (1996, 1998, 2000 гг.) в г. Сочи и Москве, 20^th Meeting of FEBS, Budapest (1990), IX Всесоюзном съезде дерматовенерологов (1991), 2-ой конференции "Геном человека", Переяславль-Залесский (1992), 4* International Symposium on Analytical Methods Systems and Stratequies in Academic and Industrial Biotechnology. Anabiotech 92, Amsterdam (1992), 3- ой конференции "Геном человека" Черноголовка (1993), III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва (1996), IV Российском съезде дерматологов и венерологов, Казань (1996), IV Национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва (1997), 1-й Всероссийской конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" Саратов (2000), 1-ом, 2-ом и 3-ем Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва (2002, 2004, 2005 гг.), Конференции «Лабораторные исследования в хирургии, акушерстве и травматологии», Саратов (2002), 4-ой и 5-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" Москва (2002, 2004), Всесоюзной конференции дерматовенерологов Нижний Новгород (2004), 4-ой научной конференции «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии и косметологии» Москва (2004).

                  Публикации

                  По теме диссертации опубликовано 43 печатных работы. В 1995 году утверждены Методические рекомендации № 95-106. Министерством здравоохранения и медицинской промышленности РФ "Диагностика хламидийной, микоплазменных и герпесвирусных инфекций методом цепной полимеразной реакции". Получено авторское свидетельство 4652161/30-13/026980/ (положительное решение от 25.08.1989) " Способ проведения гибридизационного анализа".

                  Структура и объем диссертации

                  Диссертация изложена на страницах машинописного текста;

                  состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов. Иллюстрированный материал включает 15 таблиц и 55 рисунков. Список литературы содержит 385 библиографических источников.

                  Похожие диссертации на Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов

                  

                  Разработка технологии реконструкции и компьютерного анализа генных сетей и ее применение в биологических исследованияхАнанько Елена Анатольевна

                  

                  Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pHЮзбашев, Тигран Владимирович

                  

                  Разработка молекулярно-генетических подходов для оптимизации промышленно-важных характеристик фитазы Citrobacter freundiiГордеева, Татьяна Леонидовна

                  

                  Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазыЮзбашева, Евгения Юрьевна

                  

                  Разработка и применение методов полногеномного анализа генетических ассоциаций сложных признаковАульченко, Юрий Сергеевич

                  

                  Создание системы генетических маркеров твердой пшеницы (T. durum Desf.) и ее применение в научных исследованиях и практических разработкахКудрявцев Александр Михайлович

                  Технология получения стрессоустойчивого исходного материала томата на основе методов гаметной селекции и молекулярного анализаВедадеваге Сунила Прадипа Кумари

                  

                  Разработка иммуносенсоров для анализа гербицидов триазинового ряда и производных мочевиныПлеханова Юлия Викторовна

                  

                  Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходовИгнатов, Сергей Георгиевич

                  Разработка и применение экологических технологий, направленных на снижение негативного действия тяжелых металлов на агроценозыКартузова, Мария Николаевна