Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Устройство и классификация иммуносенсоров 9
1.1. Принципы и виды иммуноанализа 9
1.2. Устройство иммуносенсоров 11
1.3. Классификация иммуносенсоров 13
Глава 2. Электрохимические иммуносенсоры 24
2.1. Полевые транзисторы как преобразователи иммуносенсоров 24
2.1.1. Устройство полевого транзистора 24
2.1.2. Схемы измерения сигналов 26
2.1.3. Иммуносенсоры на основе полевых транзисторов 28
2.2. Амперометрические преобразователи иммуносенсоров 33
2.2.1. Устройство и функционирование амперометрических сенсоров 33
2.2.2. Иммуносенсоры на основе электродов, полученных трафаретной печатью.. 36
Заключение по обзору литературы 38
Глава 3. Материалы и методы исследования 41
3.1. Реагент 41
3.2. Преобразователи сигналов 43
3.2.1. рН-чувствительныи нолевой транзистор 43
3.2.2. Электроды, полученные трафаретной печатью 44
3.2.3. Анализатор для проведения поляризационного флуороиммуноанализа 44
3.3. Методы 45
3.3.1.Определение химической чувствительности полевого транзистора 45
3.3.2. Оценка диффузионной проницаемости мембран 47
3.3.3. Иммобилизация ферментов на мембрану 47
3.3.4. Оценка активности ферментов с помощью полевого транзистора 47
3.3.5. Оценка активности ферментов с помощью оптической регистрации 48
3.3.6. Иммуноанализ с полиэлектролитным разделением реагентов и детекцией сигнала при помощи полевого транзистора 49
3.3.7. Безразделительный иммуноанализ с помощью электродов, полученных трафаретной печатью 50
3.3.8. Поляризационный флуороиммуноанализ 51
Глава 4 53
4.1. Электрохимический иммуносенсор на основе полиэлектролитных взаимодействий для определения гербицидов 53
4.1.1. Сравнительная оценка ферментов, типов мембран и субстратов, применяемых в иммуноанализе с помощью рН-чувствительного полевого транзистора 54
4.1.2. Характеристика электрохимического иммуносенсора на основе полиэлектролитных взаимодействий для определения симазина и атразина 78
4.2. Иммуносенсор для безразделительного анализа хлорсульфурона 88
4.2.1. Оценка чувствительности системы к пероксиду водорода 90
4.2.3. Определение активности глкжозооксидазы с помощью электродов, полученных трафаретной печатью 92
4.2.4. Анализ мембран для иммобилизации антител 93
4.2.5. Оценка специфичности связывания конъюгатов хлорсульфурон — глюкозоксидаза и выбор концентрации антител 94
4.2.6. Характеристика безразделительного анализа хлорсульфурона 95
4.3. Поляризационный флюороиммуноанализ изопротурона 99
4.3.1. Синтез маркера и выбор сыворотки для анализа 99
4.3.2. Характеристики поляризационного флуороиммуноанализа изопротурона. 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
ВЫВОДЫ 111
ЛИТЕРАТУРА 112
ПРИЛОЖЕНИЕ 129
Введение к работе
Актуальность исследований.
Широкое применение гербицидов, относящихся к классам триазинов, сульфонилмоче-вин и фенилмочевин, обладающих различной степенью токсичности, длительным послс-дейсівием, способностью аккумулироваться в окружающей среде, требует постоянного контроля за их содержанием в почве и растениях. В связи с этим разработка высокочувствительных, экспрессных, селективных и простых по конструкции аналитических усгройств, таких как биосенсоры, для определения этих соединений является актуальной задачей.
По определению, приведенному в журнале "Biosensors & Bioelectronics", биосенсор является аналитическим устройством, содержащим биологический материал (ткани, клетки микроорганизмов, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, иммуноактивные компоненты, нуклеиновые кислоты и т.д.), находящийся в непосредственном контакте с физико-химическим преобразователем или преобразующей микросистемой, представленными оптическим, электрохимическим, термометрическим, пьезоэлектрическим или магнитометрическим устройствами. Преобразователь вырабатывает периодические либо непрерывные аналоговые/цифровые сигналы, которые пропорциональны концентрации одиночного или группы анализируемых соединений. Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела и др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем злекірохимического, оптического или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде. Биосенсорная техника сочетает высокую чувствительность с простой методикой подготовки и анализа образцов, что и обусловило ее интенсивное применение для детекции веществ и объектов различной природы.
Одним из успешно развивающихся направлений анализа является разработка электрохимических иммуносенсоров [Богдановская, Тарассвич, 1997]. Иммуносенсоры являются классом биосенсоров, в которых роль биоспецифического компонента играет антиген или антитело [Aizawa, 1987; Morgan et al., 1996]. Для этого вида аналитических устройств характерны высокие чувствительность и селективность, связанные с использованием иммуно-реагентов в качестве распознающих молекул, а применение простой портативной регистрирующей аппаратуры позволяет использовать иммуносенсоры в небольших лабораториях и в полевых условиях.
Факторами, которые в настоящее время определяют перспективность разработки имму-носенсора для определения того или иного вещества, являются:
-наличие методов высокочувствительной детекции сигнала,
-малое влияние компонентов пробы на специфическое взаимодействие и индуцируемый им электрохимический процесс,
-экспрессность системы, в которой сведены к минимуму диффузионные затруднения, обусловленные гетерогенным характером взаимодействий на поверхности электрода.
Основные направления, по которым ведется разработка иммуносенсоров, это сокращение времени анализа, миниатюризация, прямое определение нммунореакции (без последовательного добавления иммунореагентов, без предварительной подготовки проб при анализе многокомпонентных образцов, таких как кровь, пища, сточные воды и т.д.). В качестве электрохимических преобразователей сигналов иммуносенсоров используют потенциомет-рические рН-чувствительные полевые транзисторы (ПТ) и амперометрические электроды, полученные трафаретной печатью (screen-printed electrodes, далее ЭТП). Интерес к этим видам преобразователей связан с рядом достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью. В рамках данной работы основное внимание уделялось созданию иммуносенсоров на основе ПТ и ЭТП для определения гербицидов, в которых быстрота анализа обуславливалась развитием экспрессных методик иммуноанали-за при формировании рецепторного элемента сенсора и использованием методик, позволяющих избежать регенерации поверхности сенсора (сменные рецепторпые элементы; одноразовые сенсоры).
Большинство методов иммуноферментного анализа включают стадии разделения иммунореагентов, а затем отмывки непрореагировавших иммунокомпонент. Анализ без отделения свободных антигенов (Аг) от связанных с антителами (Ат) позволяет значительно сократить время его проведения. Одним из широко распространенных методов анализа, не требующих шагов разделения, является поляризационный флуоресцентный иммуиоанализ (ПФИА), методики которого просты, а для получения результата достаточно 2-5 минут. Довольно большое число веществ, представляюпдгх интерес для служб экологического мониторинга или в исследовательской работе, рациональнее определять с помощью простого и быстрого ПФИА, поэтому представлялось целесообразным в рамках данной работы сравнить этот метод с электрохимическим иммуносенсорным анализом. Цель и задачи исследования.
Целью исследования являлось создание экспрессных методов анализа гербицидов на основе иммуносенсоров электрохимического типа. Для достижения поставленной цели в работе решали следующие задачи:
Проведение скрининга мембранных носителей, ферментных меток и их субстрагов для разработки иммуносенсоров на основе рН-чувствительного полевого транзистора и выбор оптимального сочетания указанных параметров;
Разработка иммуносенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора для детекции гербицидов (использование стехиомегрических полиэлектролитных комплексов для экспресс-разделения иммунокомпонент) на примере атразина и симазина (представители симм-триазинов);
Разработка и оптимизация условий функционирования иммуносенсора для безразделительного анализа гербицидов с использованием трафаретных электродов на примере хлорсульфурона (представитель сульфонилмочевин);
Сравнительная оценка эффективности поляризационного флюороиммуноанализа как альтернативного метода определения гербицидов на примере изопротурона (представитель класса фенилмочевин) и разработанных электрохимических методов; оптимизация реагентов и условий поляризационного флюороиммуноанализа изопротурона.
Научная новизна.
Выполнена оценка диффузионной проницаемости протонов для ряда мембранных носителей (стекловолокно, нитроцеллюлозные и капроновые мембраны) и каталитической активности ферментных меток (пероксидаза хрена, глюкозооксидаза, уреаза), связанной с генерацией сигнала в иммуносенсорах на основе рН-чувствительного полевого транзистора. Впервые показана принципиальная возможность объединения методов иммуноферментного анализа на основе полиэлектролитных взаимодействий для разделения иммунокомпонент с электрохимической детекцией ферментной метки рН-чувствительным полевым транзистором. Разработан потенциометрический иммуносенсор для детекции гербицидов симазина и атразина. Показана возможность расширения спек гра определяемых соединений и применимость этого сенсора для определения другого класса веществ - гормона тестостерона. Разработана и оптимизирована аналитическая трехферментная система иммуноанализа гербицида хлорсульфурона. Практическая значимость работы.
Разработаны два типа иммуносенсоров с электрохимической детекцией сигнала. Условия функционирования сенсоров оптимизированы для определения гербицидов симазина, атразина и хлорсульфурона. Наибольшей чувствительностью обладал сенсор на основе электродов, полученных трафаретной печатью (амперометричсский преобразователь): нижний предел детекции таким иммуносенсором для хлорсульфурона составил 0,01 нг/мл. Иммуносенсор на основе полевого транзистора (потенциометрический преобразователь) был
адаптирован также для определения гормона тестостерона (нижний предел определения составил 7 нг/мл).
Оптимизирована методика поляризационного флуороиммуноанализа гербицида изопро-турона (нижний предел определения составил 6 нг/мл) и произведена оценка его эффективности как альтернативного метода определения гербицидов по сравнению с электрохимическими методами.
Получен патент на полезную модель "Иммуносенсор для определения симазина".
Разработанные иммуносенсоры можно рассматривать как прототипы для создания промышленных высокочувствительных и надежных биосенсорных систем для эффективного использования в биотехнологии, службах экологического мониторинга и медицине. Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: V международном конгрессе по биосенсорам (Германия, 1998), Европейской конференции по тонким организованным пленкам (Германия. 1998; и Италия, 2001), IV симпозиуме по биосенсорам и биологическим методам анализа окружающей среды (Испания, 1999), международной конференции "Биокагализ-2000" (Москва, 2000), всероссийской конференции "Сенсор 2000" (Санкт-Петербург, 2000); 111 Международной молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва. 2007); Юбилейном Х1-й Московском международном Салоне промышленной собс і венности «Архимед» (Москва, 2008 г.). Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 8 статей (в том числе 3 статьи в научных журналах из перечня, рекомендованного ВАК), 7 сообщений в тезисной форме. 1 Методические рекомендации, 1 патент на полезную модель. Структура и объем диссер гации.
Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 194 ссылки. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 64 рисунка, приложение.
Принципы и виды иммуноанализа
При фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией исследуемого вещества. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа [Тернер и др. 1992].
В настоящее время существует большое количество разнообразных методик иммуноанализа и, соответственно, способов их классификации. В монографии [Коллинз, 1991] указаны основные факторы, которые принимаются во внимание при оценке возможностей и отнесении того или иного метода иммуноанализа к определенному типу:
1) основной принцип;
2) стандартные препараты и матрикс;
3) характеристики используемых антител;
4) система разделения (может включать твердый носитель для одного из реагентов);
5) тип метки, применяемой для контроля реакции связывания;
6) тип реакции и система детектирования.
В соответствии с лежащими в их основе принципами автор подразделяет методы иммуноанализа на три основные группы:
1) конкурентное связывание: при этом достаточно одной антигенной детерминанты на определяемом веществе, анализ выполняется в условиях ограниченных количеств реагента;
2) неконкурентное связывание: на определяемом веществе должны быть две неперекрывающиеся антигенные детерминанты, анализ выполняется в условиях избытка реагента;
3) неравновесный режим: используются одна антигенная детерминанта и строго контролируемый избыток реагента. Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка). Однако для визуальной регистрации этого процесса необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно интерпретировать однозначно и в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гаптенов), таких как гормоны, лекарственные соединения, эти методы непригодны.
Индикация образовавшегося комплекса антиген — антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом [Егоров и др., 1991]. В качестве метки для антитела или антигена можно использовать различные "метящие" агенты, такие как радионуклиды, ферменты, эритроциты, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. От типа метки зависит название анализа: радиоиммунологический, флуоресцентный, иммунокофакторный. иммунофер-ментный и т.д. Использование меток дало возможность увеличить чувствительность имму-нохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Кроме того, методы иммуноанализа можно классифицировать по способу осуществления:
1) жидкофазные или твердофазные;
2) ручные, полуавтоматические или автоматические;
3) с разделением (гетерогенные) или без разделения (гомогенные);
4) с экстракцией или без экстракции.
Методы иммуноанализа находятся в постоянном развитии. Расширяется число объектов исследования, углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов.
На ранних этапах развития иммуноанализа предпочтение отдавалось жидкофазным методикам, в которых связавшиеся Ат осаждали (например, с помощью вторичных Ат) или несвязавшийся Аг удаляли адсорбцией с помощью активированного угля, покрытого декст-раном (твердофазный реагент). В настоящее время наиболее распространены твердофазные методики, поскольку они позволяют существенно упростить проведение анализа и уменьшить фоновый сигнал. В таких методах молекулы рецептора (Аг или Ат) иммобилизуют на твердой поверхности и затем регистрируют результат формирования комплекса Ат-Аг. Это дало развитие биосепсорике, где рецепторы также иммобилизуют на твердой поверхности (поверхность преобразователя), и формирование комплекса можно измерить. Привлекательность иммуиосенсоров заключается в том, что при сохранении высокой чувствительности и селективности, свойственных иммуноанализу, возможно проведение исследований с помощью миниатюрных и портативных систем. Кроме того, появляется возможность непрерывного и полностью автоматического in vivo и in vitro мониторинга метаболитов, лекарственных препаратов и белков для клинической диагностики. Также миниатюрность и простота таких устройств позволяет производить анализы окружающей среды в полевых условиях (без привлечения дорогостоящего и сложного оборудования и высококвалифицированного персонала), а клинические анализы на дому.
Устройство полевого транзистора
Ион-селективные полевые транзисторы (ИСПТ) относятся к полупроводниковым по-тенциометрическим преобразователям, широко используемым для создания биосенсоров. Интерес к ПТ обусловлен рядом их достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью при массовом производстве. Немаловажным является тот факт, что транзисторы относятся к твердотельным электродам, которые обладают высокой стабильностью параметров и повышенной механической прочностью. Возможность загрязнения продукта битым стеклом исключена, и сенсоры могут быть помещены в такие образцы как мясо, фрукты и овощи. Кроме того ПТ могу г храниться в сухом виде и требуют минимального рутинного обслуживания. Они могут использоваться в очень широком диапазоне температур и выдерживают стерилизацию, необходимую в биологическом, медицинском и фармацевтическом производствах.
Кроме того, ПТ обладают быстрым ответом, высокой чувствительностью, возможностью пакетной обработки, микроразмерами и потенциалом для встраивания в интегрированные схемы. ПТ могут быть использованы для измерений многокомпонентных смесей. Полевые транзисторы предпочтительны в качестве преобразователей биосенсоров, так как поверхность (ЭЮг) содержит активные группы SiOH, которые могут использоваться для ко-валентной пришивки органических молекул и полимеров [Yuqing et al., 2003].
Наиболее часто для создания биосенсоров используют рН-чувствнтельные ПТ (рН-ПТ). На основе таких приборов созданы биосенсоры, в рецепторной части которых находится биоматериал, катализирующий реакции сопровождающиеся изменением рН. Применением ПТ в биосенсорной практике занимаются многие лаборатории мира, вместе с тем пионерские работы в этой области и неоспоримое первенсгво в исследованиях принадлежит Питу Бергвельду (Piet Bergveld), исследователю из Нидерландов [Bergveld, 2003]. Его первые работы в этом направлении появились в начале 70-х годов двадцатого столетия. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в создании полевых транзисторов, чувствительных к ионам различного типа; при этом все же основное внимание уделяется рН-чувствительным ПТ.
Несмотря на значительное количество публикаций, представляющих биосенсоры на основе ПТ, потенциал этого типа преобразователей к настоящему времени полностью не использован. Химическая чувствительность полевых транзисторов обеспечивается за счет химически чувствительной мембраны, являющейся составной частью транзистора. В присутствии определенного типа ионов в водной среде на мембране возникает электрический потенциал, что приводит к изменению тока. В связи с этим такие транзисторы названы ион-чувствительными или ион-селективными (ИСПТ). Впервые ИСПТ был описан Бергвельдом в 1970 г. как датчик, с помощью которого предполагалось произвести измерение ионных потоков в мембранах нервных клеток (Bergveld, 1970).
ИСПТ состоит из полупроводниковой подложки, стока и истока (рис. 4, взят из Тернер и др., 1992). Подложка покрыта слоем оксида (как правило, используется SiCb), играющего роль изолятора. На поверхности оксида формируют второй слой диэлектрика, который обладает химической (ионной) чувствительностью и обеспечивает свойство транзистора измерять концентрацию данного типа иона в растворе. Изоляция электрических контактов транзистора полимерными соединениями позволяет погружать ПТ в растворы электролитов и выполнять измерения; при этом химически чувствительная мембрана находиться в непосредственном контакте с измеряемым раствором. ИСПТ превращается в биосенсорный электрод при иммобилизации биоматериала на поверхности химически чувствительной мембраны транзистора. На электрод сравнения относительно заземленных кремниевой подложки и истока подается потенциал затвора Цз, на электрод стока - потенциал стока Uc. Параметрами транзистора, определяющими его функционирование, являются длина канала L, его ширина W, толщина d и диэлектрическая постоянная диэлектрика, а также проводимость канала.
Реагент
Стандартные образцы хлорсульфурона и других гербицидов - изопротурона, фенурона, дикурана, которана, пропанида - были получены и атгестованы во ВНИИ химических средств защиты растений, Москва, Россия. Карбоксильное производное хлорсульфурона (1-[(2-хлоро)-фенилсульфонил]-моноамидоянтарная кислота) было любезно предоставлено д-ром Ереминым С.А. и Поповой В.А., МГУ, Россия.
Конъюгаты производных симазина, атразина и тестостерона с пероксидазой хрена, а также конъюгат белка A Staphylococcus aureus с полиметакриловой кислотой были любезно предоставлены проф. Дзантиевым Б.Б. (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва. Россия). Их получение описано в работах Yazynina et al., 1999; Rukavishnikova et al., 1991. Конъюгаты хлорсульфурона с глюкозооксидазой предоставлены также проф. Дзантиевым Б.Б., их получение описано в [Wittmann, Hock, 1991].
Антисыворотка к изопротурону была любезно предоставлена д-ром R. Abuknesha (King s College University of London, UK).
Антитела против остальных гербицидов и тестостерона предоставлены проф. Дзантиевым Б.Б. (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва. Россия). Получение антисывороток описаны в работах: против хлорсульфурона, атразина и симазина в Dzantiev et al., 1996; против тестостерона в Dzantiev et al., 1993.
Константы связывания соответствующих антител с антигенами следующие: Ка =1,8x10 М"1 (для симазина), Ка=2,2х108 М"1 (для атразина), Ка=8х109 М"1 (для хлорсульфурона).
В экспериментах использовали хроматографическую стеклобумагу GF/A (Wliatman, Великобритания), капроновую мембрану PALL (Pall, размер пор 0.45 мкм), и следующие типы нитроцеллюлозных мембран: Hybond-N, Hybond-N+, Hybond-C (Amersham, Великобритания, размер пор 0.45 мкм); Millipore (Sigma, США, размер пор 0.22 мкм); Владипор (Поли-мерсинтез, размер пор 0.45 мкм), Biodyne A, Biodyne С, Ultrabind (Pall-Gelman, США, размер пор 0.45 мкм); MFS (Advantec, США, размер пор 0.45 мкм), BIO-RAD (Bio-Rad, США, размер пор 0.45 мкм), S&S (Shleicher & Schuell, Aldrich, США, размер пор в пределах 0,2-3 мкм).
Для проведения ИФА использовали планшеты из оптически прозрачного полистирола производства фирмы "Costar", США.
Для выделения фракций трейсеров использовали пластинки с силикагелем для тонкослойной хроматографии (Merck, Germany).
В работе использовали ПТ, изготовленные на НПО "Позитрон", г. Санкт-Петербург. рН-чувствительной мембраной являлся слой пятнокиси тантала (толщина 60-80 нм), который создавался термическим окислением пленки тантала, предварительно сформированной на затворной области ПТ. Химическая защита структуры обеспечивалась высокой химической стойкостью пленки Та2С 5, покрывающей всю поверхность кристалла ПТ вплоть до контактных площадок, а также применением для герметизации краев кристалла эпоксидного компаунда ЭК-23 и лака ЭП 730. Канал ПТ был выполнен в виде меандра, вписанного в окружность диаметром 1 мм. Химическая чувствительность ПТ составляла 45-56 мВ/рН, токи утечки "подложка-электролит" не превышали 10 нА. Дрейф выходного напряжения был в пределах 5-10 мВ/час (0,1-0,2 рН/час). Измерения производили в режиме фиксированного потенциала затвора (рис. 5); ток стока для рабочего режима измерений задавали на линейном участке вольтамперной характеристики в пределах 200-700 мкА; сопротивление нагрузки было равно 1 кОм, типичная величина сопротивления капала в указанном диапазоне токов составляла 1,0-1,5 кОм. Крутизна вольтамперной характеристики транзистора в рабочей точке была не ниже 1 мА/мВ. После усиления сигнал поступал на двух-координатный регистратор и параллельно на компьютер для регистрации и обработки данных. Выходной сигнал биосенсоров выражали в единицах напряжения (мВ), соответствующих изменению напряжения на выходе ПТ, либо в единицах рН, соответствующих эквивалентному закисленню или защелачиванию затворной зоны. Измеряемыми параметрами являлись начальная скорость изменения сигнала после введения детектируемого соединения и/или амплитуда, которую оценивали по разнице исходного и конечного уровней сигнала ПТ. Измерения выполняли в кювете объемом 2,0 мл при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Исследуемые соединения вводили в кювету после стабилизации выходного сигнала транзистора. В качестве измерительной среды использовали 1мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 15 мМ NaCI, рН 6.8. Рецепторный элемент сенсора закрепляли на затворной области транзистора с помощью специального микродержателя (рис. 8).
