Введение к работе
Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды наряду с исчерпанием нефти ставит перед биотехнологией задачи разработки современных методов анализа токсичных продуктов и поиска возобновляемых источников энергии. Все процессы биотехнологии, химической технологии, мониторинга окружающей среды и многих пищевых технологий базируются на методах анализа хода процесса и качества конечного продукта. Эти проблемы во многом могут быть решены с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis.
Мониторинг среды, включающий контроль воздуха, сточных вод, пищевых продуктов, почвы и питьевой воды, приобретает все большее значение в программах улучшения условий жизни и питания человека. Среди множества методов все большее внимание уделяется новейшим биоаналитическим методам (Reshetilov et al., 2010; Троценко, Торгонская, 2011). В них используются высокоспецифичные ферменты, а также биосенсоры на основе ферментов, микробных клеток, либо иных биоэлементов. Для внедрения биосенсорных методов анализа в широкую практику необходимы исследования по конструированию биоэлементов с оптимальными параметрами, включая создание ферментных и микробных сенсорных элементов с необходимыми биоаналитическими характеристиками.
Современный этап развития цивилизации в значительной степени зависит от успешной разработки новых технологий производства биотоплива, особенно, топливного этанола из непищевыых источников. В настоящее время этанол производится в больших количествах (79 млрд. л в 2009 г.), причем около 75% этого вещества используется в качестве топлива для двигателей внутреннего сгорания и лишь 15% - для приготовления крепких спиртных напитков. Бензин в настоящее время зачастую используется в смесях с этанолом, который может быть получен из биомассы растений, причем в странах ЕС с 2010 г. введено требование, согласно которому бензин должен содержать не менее 5,5% этанола (Monique et al., 2003). Известно также положительное влияние биотехнологического производства этанола на глобальный парниковый эффект. Сжигание такого этанола не приводит к дополнительной эмиссии СО2 в атмосферу (Lynd, 1996). В настоящее время топливный этанол получают из пищевого и кормового сырья (крахмал, сахароза). Поэтому конструирование штаммов, способных к эффективной конверсии в этанол гидролизатов растительной биомассы, состоящих, в основном, из глюкозы и ксилозы, имеет первостепенное значение для увеличения производства этого биотоплива. Важной задачей является также усовершенствование методов анализа этанола.
Метанол играет важную роль в качестве исходного сырья для химического синтеза. Значительная его часть используется в процессе получения формальдегида, а также для производства синтетических смол и лавсана, биотоплива, а также в качестве добавки к бензину. Случайное потребление метанола приводит к слепоте, необратимым неврологическим нарушениям и даже к смерти (Medinsky еt al., 1997; Skrzydlewska, 1999). В связи с высокой токсичностью метанола (Skrzydlewska, Farbiszewski, 1997; Andrews et al., 1998) важное значение имеет определение его содержания в алкогольных напитках, биологических жидкостях, при контроле промышленных отходов.
Одна из крупнейших по масштабу химическая технология заключается в производстве различных пластмасс с применением формальдегида. Поэтому определение формальдегида и сопутствующего метанола очень важно для мониторинга окружающей среды и контроля многих промышленных товаров, медицинских препаратов, пищевых продуктов. Особенно высокий уровень формальдегида, как натурального метаболита, в ряде рыбных продуктов семейства тресковых (Sotelo et al., 1995), содержание которого в процессе хранения в замороженном состоянии его содержание может достигать от 210 до 780 мг на 1 кг сырой биомассы, что представляет собой серьезную токсикологическую проблему (Rehbein, 1995).
Большинство известных методов определения этанола, метанола и формальдегида недостаточно селективны и чувствительны, либо слишком дорогостоящие. Блдее перспективн энзиматические методы с использованием алкогольоксидазы, выделенной из штаммов-сверхпродуцентов H. polymorpha. Алкогольоксидаза, способная in vitro окислять метанол, алифатические спирты, включая этанол, имеет важное биотехнологическое значение. Другим ферментом H. рolymorpha, имеющим биоаналитичесое значение, является формальдегиддегидрогеназа. Этот фермент также использовался в диссертационной работе.
Для эффективного производства биоэтанола необходим поиск и генно-инженерное улучшение дрожжей, способных сбраживать до этилового спирта гидролизаты лигноцеллюлозы. Важнейшее значение имеет исследование метилотрофных дрожжей H. polymorpha, которые могут сбраживать как глюкозу, так и ксилозу, а также P. stipitis, дикие штаммы которых по характеристикам ферментации ксилозы не уступают лучшим рекомбинантным штаммам Saccharomyces cerevisiae. Такие дрожжи представляют интерес для разработки процесса одновременного энзиматического гидролиза лигноцеллюлозы с последующей ферментацией образуемых сахаров до этанола. Штаммы с улучшенными параметрами ферментации лигноцеллюлозного сырья могут сделать этот процесс более рентабельным (Дмитрук и др., 2010).
Цель и задачи исследования. Целью работы было использование нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha для разработки новых ферментативных и биосенсорных методов анализа формальдегида, метанола и этанола в окружающей среде, продуктах питания, сыворотках крови, а также конструирование штаммов H. polymorpha и Рichia stipitis с увеличенной продукцией этанола. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Использование высокоочищенного фермента алкогольоксидазы (АО), полученного из клеток бескаталазного штамма метилотрофных дрожжей H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) с нарушенной катаболитной глюкозной репрессией синтеза АО для разработки ферментных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида.
-
Анализ этанола в алкогольных и безалкогольных напитках и соках при помощи разработанного алкогольоксидазно-пероксидазного (АОП) метода.
-
Использование АОП-метода и препарата рекомбинантной формальдегиддегидрогеназы (ФАДГ) для определения содержания формальдегида в рыбных продуктах, метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах.
-
Разработка нового энзимо-химического метода определения одновременного содержания формальдегида и метанола для анализа стоков.
-
Конструирование элементов биосенсоров, селективно реагирующих на метанол, этанол и формальдегид, с применением ферментных препаратов, выделенных из селекционированных штаммов нетрадиционных дрожжей.
-
Получение мутантных форм АО H. polymorpha с пониженным сродством к этанолу, разработка амперометрических биосенсоров на основе природных и мутантных форм АО H. polymorpha.
-
Биоаналитическое использование ФАДГ H. polymorpha в разработке ферментативных и клеточных биосенсоров для анализа формальдегида в вакцинах.
-
Конструирование рекомбинантных штаммов Pichia stipitis с увеличенной продукцией этанола при алкогольной ферментации лигноцеллюлозного сырья.
-
Изучение взаимосвязи между внутриклеточным пулом GSH, повышением продукции этанола и устойчивости к этанолу у рекомбинантных штаммов пекарских дрожжей S. cerevisiae и метилотрофных дрожжей H. polymorpha.
Научная новизна исследования. В работе представлены примеры использования нетрадиционных дрожжей Н. рolymorpha и их мутантов – сверхпродуцентов ферментов (АО – алкогольоксидазы, ФАДГ – формальдегиддегидрогеназы), мутантных форм АО с уменьшенным сродством к субстратам, выделение ферментов и их биоаналитическое применение в ферментно-химических и биосенсорных методах анализа формальдегида, метанола и этанола в промышленных сточных водах, продуктах питания и вакцинах. Представлены примеры конструирования рекомбинантных штаммов дрожжей Pichia stipitis и H. polymorpha с улучшенными параметрами алкогольной ферментации.
Разработан новый ферментно-химический метод одновременного анализа формальдегида и метанола в их смесях, в котором определение метанола осуществляется с участием АО в условиях химического «маскирования» формальдегида в реакционной смеси (добавление веществ, связывающих молекулы формальдегида, делает невозможным его реакцию с АО). Метод использован для анализа промышленных сточных вод и коммерческих препаратов формалина. Порог чувствительности метода для обоих аналитов составляет 1 мкМ, что в 3,2 раза выше по сравнению с традиционным химическим методом.
Показана возможность применения АО, пероксидазы хрена (ПО) и ФАДГ при анализе этанола в спиртосодержащих напитках, метанола и формальдегида в модельных растворах и промышленных сточных водах, а также формальдегида в рыбных продуктах. Использование таких методов значительно упроститло процедуру анализа этанола, метанола и формальдегида по сравнению с традиционными способами.
Сконструирован новый прототип двухферментного амперометрического биосенсора с применением АО метилотрофных дрожжей и ПО, способного к анализу этанола, метанола и формальдегида. Биоселективный элемент создан путем электроосаждения двух ферментов в различных слоях с использованием катионных и анионных полимеров. Эффективная коммуникация между окисленной формой ПО и поверхностью рабочего электрода достигнута путем введения во внутренний слой, контактирующий с электродом, полимера, содержащего осмиевый комплекс. Преимуществами биосенсора являются быстрый ответ на аналит, высокая чувствительность и стабильность. Это дает возможность примениеия разработанной конструкции биосенсора также в исследованиях других ферментов (ФдДГ, мутантной АО), а также для практического использования биосенсоров в анализах соответствующих аналитов.
На основе селекции в среде с аллиловым спиртом впервые получены мутантные штаммы Н. рolymorpha СА2 и СА4 с пониженным сродством АО к этанолу. Проведено секвенирование мутантных аллелей структурных генов АО из мутантов Н. рolymorpha СА2 и СА4, идентифицированы точечные мутации в гене АОХ, которые приводят к уменьшению сродства фермента к субстрату. Изучены некоторые структурно-функциональные свойства мутантных форм АО. Разработана технология иммобилизации ферментов на поверхности рабочего электрода биосенсора. Показано, что биосенсор на основе мутантной формы АО обладает расширенным спектром линейного ответа на аналиты по сравнению с сенсором на основе АО дикого типа.
Оптимизированы условия культивирования рекомбинантного штамма H. polymorpha с повышенным синтезом термостабильной ФАДГ, выделен фермент из рекомбинантных клеток, изучены некоторые свойства очищенной ФАДГ. Удельная активность очищенных препаратов ФАДГ превышала активность коммерческих препаратов ФдДГ из Ps. putida. Разработан ФАДГ-метод анализа формальдегида и показана возможность его использования в анализе сточных вод. Ферментативный метод на основе ФАДГ рекомендован к практическому использованию вместо химических методов, которые трудоемки, требуют дистилляции проб или дополнительных исследований (в случае содержания фенола).
Разработаны два типа селективных к формальдегиду амперометрических биосенсоров (ферментный и клеточный) с использованием зависимой от НАД+ и глутатиона ФАДГ, выделенной из рекомбинантных клеток дрожжей H. polymorpha, с высоким содержанием ФАДГ. Сконструированные биосенсоры использованы для анализа содержания формальдегида в промстоках и вакцинах (АДТ-М, антигеморрагическая вакцина кроликов, вакцина Imovax Polio). Установлена корреляция между результатами биосенсорного и химического определения.
Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей P. stipitis XYL1m9 с увеличенной продукцией этанола при ферментации ксилозы. В полупромышленной среде на основе кислотных гидролизатов опилок и отрубей штамм характеризовался существенным улучшением параметров алкогольной ферментации. Так, при ферментации гидролизатов пшеничных отрубей штамм продуцировал в 1,5 раза больше этанола по сравнению с дрожжами S. cerevisiae дикого типа. Использование смеси рекомбинантного штамма P. stipitis и штамма дикого типа S. cerevisiae увеличивало синтез этанола в 1,6 раза по сравнению с параметрами ферментации рекомбинанта.
Рекомбинанты H. polymorpha с повышенным пулом внутриклеточного GSH в связи с гиперэкспрессией первого гена биосинтеза GSH, гамма-глутамилцистеинсинтетазы, или центрального регуляторного гена метаболизма серы MET4 (мультикопийная интеграция генов GSH2 и MET4) накапливали почти в два раза больше этанола при сбраживаении глюкозы по сравнению со штаммом дикого типа, тогда как штамм S. cerevisiae с повышенным внутриклеточным пулом GSH не увеличивал продукцию спирта. Трансформанты S. сerevisiae, и H. polymorpha с повышенным пулом GSH более чувствительны к экзогенному этанолу, чем соответствующие штаммы дикого типа.
Практическое значение полученных результатов. Предложенные модификации ферментных фотометрических методов анализа этанола, метанола и формальдегида с использованием АО и ФАДГ из мутантов - сверхпродуцентов этих ферментов использованы для анализа содержания этанола в винах, формальдегида и метанола в промышленных сточных водах, формальдегида - в рыбных продуктах. Показаны их преимущества по сравнению с традиционными химическими методами. Сконструированный биосенсор на основе АО использован для определения содержания метанола в промстоках.
Разработан новый ферментно-химический метод позволяющий определять метанол и формальдегид в смесях этих веществ и, в отличие от химических методов, не требует использования агрессивных химических веществ, прост в реализации и используется для контроля аналитов в промстоках и различных продуктах, содержащих формальдегид и метанол.
Показана возможность применения сконструированного двухферментного амперометрического биосенсора, содержащего АО и ПО с использованием раздельного электроосаждения двух ферментов в различных слоях, применением катионных и анионных полимеров для анализа метанола, этанола и формальдегида.
С использованием предложенного нами метода селекции мутантов дрожжей H. polymorpha получены препараты АО с пониженным сродством к субстратам, которые иммобилизованы на поверхности трансдукторов амперометрических биосенсоров и показана возможность их применения для анализа этанола в широком диапазоне концентраций.
Сконструированные на основе рекомбинантного штамма H. polymorpha со сверхпродукцией термостабильной ФАДГ энзиматические и клеточные биосенсоры для анализа формальдегида использованы для определения содержания формальдегида в промышленных сточных водах и в сыворотках.
Рекомбинантные штаммы дрожжей Pichia stipitis XYL1m9 с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы и H. polymorpha с увеличенным внутриклеточным содержанием глутатиона перспективны для получения этанола из гидролизатов растительной биомассы и традиционного сырья.
Предложенные нами методы используются при анализе метанола и формальдегида в сточных водах фабрики по производству пластмасс в Пусткове (Польша), в учебном процессе на практических занятиях по биотехнологии и при выполнении дипломных работ во Львовском университете им. Ивана Франко (Украина) и Жешовском университете (Польша).
Основные положения, выносимые на защиту
Нетрадиционные дрожжи Н. рolymorpha и их мутанты – сверхпродуценты АО и ФАДГ впервые использованы для анализа этанола и метанола в биогенных пробах (вино, пиво, соки, безалкогольные напитки), метанола и формальдегида в модельных растворах и промстоках, а также формальдегида - в пищевых рыбных продуктах.
Разработан и использован в аналитической практике новый ферментно-химический метод определения метанола и формальдегида в смесях этих веществ, основанный на применении химического анализа формальдегида с гидразоном 3-метил-2-бензотиазолина без АО и последующей реакции с участием АО, что позволяет определять общее содержание метанола и формальдегида в промстоках.
Разработаны новые типы амперометрических биосенсоров с использованием ферментов дрожжей Н. рolymorpha (АО, мутантная АО, ФАДГ) и осмий-содержащих катионных и анионных полимеров для получения быстрого отклика на аналит при высокой чувствительности и стабильности биосенсора. Сконструированные биосенсоры использованы для анализа метанола, этанола и формальдегида.
Сконструирован рекомбинантный штамм дрожжей XYL1m9 P. stipitis с повышенной продуктивностью алкогольной ферментации ксилозы и гидролизатов растительного сырья. Обнаружена способность рекомбинантных штаммов H. polymorpha с увеличенным внутриклеточным содержанием глутатиона к сверхсинтезу этанола в среде с глюкозой.
Работа выполнялась на кафедре Биотехнологии и микробиологии Биолого-почвенного факультета Жешовского университета (Жешов, Польша). Часть исследований проведена на основе Отдела молекулярной генетики и биотехнологии и Отдела аналитической биотехнологии Института биологии клетки НАН Украины (Львов, Украина), Института инжинерии окружающей среды Ченстоховского Технологического университета (Ченстохова, Польша), кафедры Технологии воды и сточных вод Свентокшыского Технологического университета (Кельце, Польша), Лаборатории аналитической химии – электроаналитики и сенсорики Рурского Университета (Бохум, Германия), кафедры Экологии микроорганизмов Брюссельского свободного университета (Брюссель, Бельгия).
Исследования выполнялись также в рамках международных научных грантов: KBN 3 PO4B 003 23 «Новые ферментативные и биосенсорные методы анализа формальдегида, метанола и этанола в окружающей среде и клеточные системы детоксикации формальдегида», KBN N N302 1385 33 «Мутанты дрожжей Hansenula polymorpha с нарушенной катаболитной репрессией и их использование с целью конструирования сверхпродуцентов собственных и чужих белков с биотехнологическим значением», P-W CG „Interaction between glutathione and аlcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae and non-conventional yeasts”.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на XXI Международном специализированном симпозиуме по дрожжам «Биохимия, Генетика, биотехнология и экология ннетрадиционных дрожжей» (Львов, Украина, 2001), на ХХII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам „Yeast Fermentations and other Yeast Bioprocesses” (Пиланесбург, ЮАР, 2002), на II Конгрессе по биотехнологии (Лодзь, Польша, 2003), на VI Международной конференции „Role of Formaldehyde in Biological Systems” (Печ, Венгрия, 2003), на Первом (Инаугурационном) Украинском Конгрессе по биологии клетки (Львов, Украина, 2004), на Украинско-Германском Симпозиуме по нанобиотехнологии "Current State and Prospects for Future Cooperation" (Киев, Украина, 2006), на II Украинско-Польской Вайглевской конференции "Microbiology of the XXI century" (Варшава, Польша, 2007), на XII Международном Конгрессе по дрожжам (Киев, Украина, 2008), на III Украинско-Польской Вайглевской конференции «Микробиология на службе человека» (Одесса, Украина, 2009), на X Международной научной конференции “Risk factors of food chain” (Нитра, Словакия, 2010), на XXVIII Международном специализированном симпозиуме по дрожжам „Metabolic and Bioprocess Engineering for Sustainable Development” (Бангкок, Таиланд, 2010), на IV Украинско-Польской Вайглевской конференции "От микробиологии к синтетической биологии" (Вроцлав, Польша, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ, среди которых 17 статей, в российских журналах, рекомендуемых ВАК, и в приравниваемых к ним периодических изданиях, входящих хотя бы в одну из библиографических баз цитирования (PubMed, Scopus, Web of Knowellege и др.), в том числе с международным импакт-фактором (IF); 2 монографии; 10 статей в других журналах и сборниках, а также 16 тезисов докладов на международных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 7 глав результатов исследований, выводов, списка литературы (361 источник). Основной текст диссертации изложен на 279 страницах, включая 69 рисунков и 13 таблиц.
Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в формулировании проблемы, постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов, в обобщении и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
