Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Проблемы загрязнения окружающей среды хлорограническими пестицидами 9
1.1. Производные полихлорфенолов - предшественники диоксинов 10
1.2. Общая характеристика хлорсодержащих пестицидов: их свойства транспорт и деградация в окружающей среде 13
1.2.1. Пестициды группы хлорфеноксикислот 13
1.2.2. Полихлорфенолы 18
1.2.3. Гербициды класса хлорированных ацетанилидов 22
Глава 2. Методы определения хлорорганических пестицидов в природных объектах. 28
2.1. Физико-химические методы анализа 28
2.1.1. Методы пробоподготовки образцов 31
2.2. Иммунохимические методы анализа пестицидов 32
2.2.1. Основные этапы разработки ИХМ пестицидов 34
2.2.1.1. Дизайн и синтез гаптенов, получение иммуногенов и 35 меченых соединений
2.2.1.2. Получение и характеристика антител 36
2.2.1.3. Оптимизация условий иммуноанализа 38
2.2.2. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 40
2.2.3. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) 45 2.2.3.1. ПФИА в системе обращенных мицелл 47
2.2.4. Современные тенденции развития ИХМ 48
2.2.5. Влияние структуры меченого антигена на характеристики ИХМ 51
2.2.6. Методы рассчета констант связывания антиген-антитело 53
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 61
3.1. Материалы и оборудование 61
3.2. Методы 63
3.2.1. Синтез конъюгатов пестицидов с белками 63
3.2.2. Синтез конъюгатов пестицидов с флуоресцеином 64
3.2.3. Пробоподготовка образцов 67
3.2.4. Методики проведения иммуноанализа 68
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 72
Глава 4. Теоретические закономерности конкурентного ПФИА 72
4.1. Определение констант аффинности антител в ПФИА 76
Глава 5. Влияние структуры иммунореагентов и схем проведения анализа на характеристики ПФИА пестицидов - производных полихлорфенолов. 78
5.1. Тестирование антител, изучение влияния структуры иммуногенов на основные характеристики ПФИА пестицидов. 79
5.2. Определение оптимальных концентраций иммунореагентов. 86
5.3. Влияние структуры меченых антигенов на характеристики ПФИА. 89
5.4. Аналитические характеристики разработанных систем ПФИА: чувствительность, воспроизводимость и селективность определения. 100
5.5. Изучение влияния органических растворителей на характеристики ПФИА пестицидов. 107
5.6. Влияние ионной силы буфера на параметры системы ПФИА. 111
5.7. ПФИА в обращенных мицеллах 113
5.8. Иммуноанализ, основанный на тушении флуоресценции 117
Глава 6. Применение ПФИА для анализа пестицидов в объектах окружающей среды
6.1. Определение пестицидов в образцах природной воды 120
6.2. Разработка методик экстракции хлорфеноксикислот из почвы для их 122 определения методом ПФИА
6.2.1. Методика ультразвуковой экстракции хлорфеноксикислот из 126
почвы
6.2.2. Методика микроволновой экстракции хлорфеноксикислот из
почвы 132
6.3. Корреляция разработанных методик ПФИА с методом жидкостной хроматографии139
Глава 7. Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного анализа ацетанилидов
7.1. Влияние структуры конъюгата для сорбции на чувствительность анализа, оптимизация концентраций иммунореагенов для проведения ИФА пропанила 140
7.2. Селективность определения пропанила 147
7.3. Влияние структуры конъюгата для сорбции на чувствительность
анализа, оптимизация концентраций иммунореагенов для проведения ИФА ацетохлора 149
7.4. Селективность определения ацетохлора 153
Глава 8. Применение ИФА ацетанилидов для анализа объектов окружающей среды 156
8.1. Определение пестицидов в образцах природной воды 156
8.2. Определение ацетохлора в яблочном соке 157
8.3. Влияние органических растворителей на характеристики ИФА ацетанилидов 159
8.4. Разработка методики экстракции пропанила из зерен риса для его определения методом ИФА 161
8.5. Разработка методики экстракции ацетохлора из кукурузной муки для его определения методом ИФА 164
8.6. Корреляция разработанных методик ИФА с методом ГХ с МС детектированием 186
ВЫВОДЫ ЛИТЕРАТУРА 171
- Производные полихлорфенолов - предшественники диоксинов
- Физико-химические методы анализа
- Материалы и оборудование
Введение к работе
В современном мире большое внимание уделяется проблеме экологического мониторинга объектов окружающей среды на остаточное содержание пестицидов. Подавляющее большинство используемых в мире пестицидов относятся к классу хлорсодержащих органических пестицидов. Эти соединения способны загрязнять почву, водоемы и продукты питания, оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Именно хлорсодержащие гербициды являются основными загрязнителями рек и грунтовых вод [1]. Более того, некоторые представители хлороганических пестицидов, такие как хлорфенолы и хлорфеноксикилоты, содержат в виде примесей особо токсические и устойчивые соединения — полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны (ПХДД/Ф). Диоксины образуются как в процессе производства пестицидов хлорфенолов и хлорфеноксикислот, так и в ходе их метаболизма в окружающей среде. Однако методы определения диоксинов особенно сложны и дороги, т.к. требуют очень тщательной пробоподготовки из-за необходимости определять концентрации на уровне пикограммов. Присутствие пестицидов-предшественников диоксинов в объекте окружающей среды может служить косвенным доказательством загрязнения диоксинами, при этом пикограммовые уровни диоксинов соответствуют микрограммовым уровням загрязнения соответствующими пестицидами. Поэтому целесообразно проводить предварительный экологический скрининг на наличие пестицидов с целью выявить образцы, предположительно загрязнены диоксинами, а затем, если требуется, проводить точное их определение более чувствительными методами.
Для этих целей необходимы быстрые методы определения пестицидов.
Хорошо разработаны и давно применяются различные виды хроматографических методов. Однако при их высокой чувствительности и точности, эти методы являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных, и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют методы иммунохимического анализа - гомогенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), которые все более широко используются для мониторинга различных объектов окружающей среды. Метод ПФИА обеспечивает высокую точность и экспрессность определения (время анализа 10-ти образцов - несколько минут), а твердофазный ИФА является более чувствительным.
Целью настоящего исследования явилась разработка поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) пестицидов класса производных полихлорфенолов - 2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д), 2,4,5- трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т) и пентахлорфенола (ПХФ), и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) гербицидов класса хлорированных ацетанилидов - ацетохлора и пропанила. В круг задач исследования также входило создание аналитических систем для количественного определения пестицидов в различных природных объектах, т.е. разработка методик выделения пестицидов из природных матриц и подбор условий их определения.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных пестицидов; изучить влияние структуры иммунореагентов - флуоресцентных производных, конъюгатов пестицид-белок и иммуногенов, на основные характеристики методов; исследовать влияние различных факторов на результаты анализа и выбрать оптимальные условия определения пестицидов методами ПФИА и ИФА; разработать экспрессные методики пробоподготовки объектов окружающей среды для определения в них пестицидов методами ПФИА и ИФА; определить аналитические характеристики разработанных методик и провести корреляционные испытания результатов определения пестицидов в реальных объектах с физико-химическими методами анализа.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Экологический мониторинг пестицидов
Производные полихлорфенолов - предшественники диоксинов
Помимо того, что хлорогранические пестициды оказывают токсическое действие на организм человека и животных, некоторые из них содержат в виде примесей особо токсические соединения - полихлорированные дибензодиоксины и бензофураны (ПХДЦ/Ф). Диоксины образуются как в процессе производства пестицидов хлорфенолов и хлорфеноксикислот, так и в ходе их метаболизма.
Самый токсичный диоксин - 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин (ТХДД). Он содержится в разных количествах во всех промышленных формах пестицидов 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной (2,4,5-Т) и 2,4,5- трихлорфеноксипропионовой (2,4,5-ТП) кислот [3,4]. Уровень ТХДД в агенте Оранж (смесь н-бутиловых эфиров 2,4,5-Т и 2,4-Д 1:1), широко использовавшимся до 1970 г, составлял от 0,1 до 47 мг/г. Загрязнение препататов 2,4,5-Т диоксином в 1960-х гг. доходило до 100 мг/г, после 1970г (введение норм на содержание диоксинов) составляло 0,1-1 мг/г [3]. Агент Оранж активно применялся американскими войсками как дефолиант во время войны во Вьетнаме. После этого на протяжении многих лет, до сегодняшнего времени, объекты окружающей среды Вьетнама загрязнены высокими концентрациями диоксинов. Уровень загрязнений рыбы в районе Южного Вьетнама в 1972 г. составил 18-810 нг/кг [3]. Эти данные доказывают, что диоксины способны накапливаться в значительных концентрациях после применения пестицидов в пищевых цепях экосистем. В 1969 г Воздушные силы США прекратили программу дефолиации в юго-восточной Азии. В 1970 г около 8700 м Оранжевого агента были складированы в Галфпорте, Миссисипи, и на острове Джонстон в Тихом океане. Анализ запасов агента выявил концентрацию диоксина 0,1-47 мг/г [4].
Диоксины относятся к классу устойчивых загрязнителей, время их полуразложения в почве превышает 1-1,5 года [9]. Диоксины могут образовываться в природных условиях в процессе фотолиза и случайного пиролиза хлорфеноксикислот (возможные пути их образования указаны нарис. 1).
Пути образования диоксинов из полихлорфенолов указаны в работах [6-9]. Эти процессы происходят в основном в ходе фотохимических и термических реакций. Так, основным продуктом трансформации 2,4,5-трихлорфенола является 2,3,7,8-ТХДД (самый токсичный из известных диоксинов), 2,4-дихлорфенола - 2,8 ДХДД, пентахлорфенола—-—октахлордибензодиоксина (ОХДД), 1,2,3,6,7,8-— гексахлордибензодиоксин и 1,2,3,4,6,7,8-гептахлордибензодиоксин (рис. 1). Непосредственными структурными предшественниками диоксинов (преддиоксинами) являются соединения ряда 2-феноксифенола, которые часто присутствуют в качестве примесей в препаратах хлорфенолов и хлорфеноксикислот. Уровень ПХДД в препаратах, например, пентахлорфенола достигает 1,46 мг/г (Европа, 1991 г) [10]. Доказательством преобразования ПХФ в диоксины служит, например, работа [11] уровень пентахлорфенола (ПХФ), которым обработаны деревянные сооружения на фермах США, хорошо
Также проводились исследования по изучению образования ПХДД in vivo путем введения в организм животных и человека предшественников диоксинов и анализа выделяемых продуктов. В ходе этих работ доказано, что ПХДД/Ф могут образовываться из хлорфенолов, феноксикислот и предиоксинов (таких как нонахлор-2-феноксифенола) в живых организмах в ферментативных или спонтанных реакциях [6,7].
Физико-химические методы анализа
Решение задач экологического мониторинга и охраны здоровья населения невозможно без создания современных методов контроля содержания пестицидов в воде, воздухе, почве и сельскохозяйственной продукции. Среди требований, предъявляемых на сегодняшний день, к новым аналитическим методам можно выделить следующие: оперативность получения результатов анализа;
чувствительность, обусловленная низкими значениями предельно допустимых концентраций гербицидов
специфичность определения индивидуального гербицида или группы гербицидов.
Следует отметить, что общепринятыми на сегодняшний день методами количественного определения гербицидов в объектах окружающей среды являются физико-химические методы анализа. Методы определения хлорорганических пестицидов на примере хлорфеноксикислот, хлорфенолов и ацетанилидов представлены в таблице 3. Наиболее распространенными среди них являются газовая хроматография (ГХ), жидкостная хроматография (ЖХ) или ВЭЖХ с использованием различных видов детекции: электронно-захватной [85-87], масс-спектрометрической [88-97], ультрафиолетовой [98,99], амперометрической [100,101] и других [102]. Популярен также капиллярный электрофорез [103-104]. Наиболее эффективной техникой анализа следовых количеств термоустойчивых гербицидов является ВЭЖХ-МС-ИЭС (масс-спектрометрия с ионизацией электроспреем), когда молекулярные ионы образуются при испарении с поверхности капли малого диаметра [105].
Способность металлопорфиринов катализировать процесс восстановления некоторых органогаллидов была положена в основу амперометрического метода определения пестицидов [101]. Электрохимическое определение осуществлялось за счет восстановления пропанила на графитовом электроде, покрытым 5,10,15,20-тетрафенилпорфиринатом железа (III). Предел обнаружения пропанида с помощью амперометрического сенсора составил 8 10"5 М (17 мкг/мл). Для анализа природных объектов, по мнению авторов," сенсор может быть использован в качестве детектора после хроматографического разделения методом ЖХ.
Физико-химические методы позволяют выявлять и количественно определять все вещества, содержащиеся в анализируемой пробе в концентрациях ниже ПДК. Однако высокая неспецифическая чувствительность данных методов накладывает строгие ограничения на качество предварительной пробоподготовки.
детекция; ПИ - пламенно-ионизационная детекция; УФ -детекция в ультрафиолетовом диапазоне; ИЭС — ионизация электроспреем; ТФЭ -твердофазная экстракция; ТФМЭ - твердофазная микроэкстракция.
Среди недостатков хроматографических методов можно отметить: длительность проведения пробоподготовки и настройки прибора; необходимость в дорогостоящем оборудовании; большой объем проб (0,05 - 1 л). Сложность и высокая стоимость анализа не позволяют использовать ХМ для массовых анализов.
Материалы и оборудование
В работе использовали химические реагенты и органические растворители (метанол, этанол, этилацетат, хлороформ, диметилформамид, диметилсульфоксид, ацетонитрил, дизтиловый эфир, ацетон), перекись водорода, неорганические соли, серную кислоту марки о.с.ч. ("Реахим", Россия); флуоресцеинизотиоцианат, этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат (ЭДФ), 5-([4,6-дихлортриазин-2- ил]амино)флуоресцеин, о-фенилендиамин, бычий сывороточный альбумин (БСА), этилендиамин дигидрохлорид, триэтиламин, г Г, Г-дициклогексилкарбодиимид, N-гидроксисукцинимид, пероксидаза хрена (ПХ) тип VI-A, хлорсодержащие гербициды: 2,4-дихлорфеноксиуксусная, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная, 2-(2,4-дихлор)феноксипропионовая , 2,4,5-трихлорфеноксипропионовая, 2-хлор,4-метилфеноксиуксусная, 2-(4-хлор,4-метил)феноксипропионовая, 2,5-дихлор-феноксиуксусная, 2,4-дихлор-5-фторфеноксиуксусная, пентахлорфеноксиуксусная кислоты, триклопир, пропанил, диурон, линурон, хлорбромурон, метоксурон, небурон, различные хлоранилины и хлорфенолы фирмы "Sigma"; азид натрия и Аэрозоль ОТ, т.е. бис-(2-этилгексил)-сульфосукцинат натрия (АОТ) фирмы "Serva".
Для разделения реакционной смеси при синтезе трейсеров методом препаративной ТСХ использовали пластины фирмы "Silufol" (Чехия).
Поликлональные антисыворотки против 2,4,5-Т и 2,4-Д получены в НПО "Иммунотех" (Москва), против пропанила и ацетохлора — во всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (Москва). Поликлональные овечьи антитела против пентахлорфенола, пентахлортиофенола и 2,4,5-трихлорпропионовой кислоты, очищенные методом иммуноаффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным антигеном, были любезно предоставлены Dr. Ramadan Abuknesha (King s College University, Лондон, Великобритания). Моноклональные антитела против 2,4-Д (E2/G2) были любезно предоставлены Dr. Milan Franek (Veterinary Research Institute, Брно, Чешская Респкблика). В работе также использовали конъюгат антивидовых антител (овца против кролика) с пероксидазой хрена (BioRad Laboratories, Hercules, СА, США).
В работе были использованы следующие буферы: ФБ - 0,01М К2НР04-КН2Р04(рН 7,4); ФБС - 0,01 М К2НР04-КН2Р04, содержащий 0,15 М NaCl (рН 7,4); ФБСТ - ФБС, содержащий 0,1% Твин-20 (рН 7,4); КБ - 0,01 М Na2C03 (рН 9,6); ББ - 0,05 М боратный буфер, содержащий 0,95 г Na2B407- 10Н2О и 1 г азида натрия (рН 7,5-8).
Стандартные растворы пестицидов и перекрестно-реагирующих соединений готовили из исходных растворов гербицидов в метаноле (1мг/мл) до конечных концентраций.
В работе применяли полистироловые 96-ти луночные планшеты фирмы "Nunc" (Дания). При проведении иммуноферментного анализа для регистрации оптической плотности продукта ферментативной реакции использовали многоканальный спектрофотометр для 96-ти луночных планшетов (iEMS, LabSystems, Хельсинки, Финляндия).
Измерение поляризации флуоресценции проводили на программируемом поляризационном флуориметре Beacon 2000, фирмы Panvera (США) и TDx-анализатор фирмы "Abbott" (США), снабженные термостатической ячейкой и программным обеспечением. Для измерений использовали боросиликатные стеклянные кюветы 10x75мм. Исследования проводились в статическом и кинетическом режимах, при температуре 25С.
Масс-спектры конъюгатов ацетохлора и пропанила с белками были получены на масс-спектрометре Kratos Kompact MALDI 3 TOF (Kratos, UK).
Корреляцию разработанных методов ИФА с методом ГХ-МС проводили на газовом хроматографе Varian Saturn 2000 (Varian, Walnut Creek, CA, USA) с масс-селективным детектором с ионной ловушкой, на капиллярной колонке Supelco MDN5-S с толщиной покрытия 0,25 мкм, длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм.
Микроволновую экстракцию (МВЭ) пестицидов из почвы проводили в микроволновой системе «Mars-5» (CEN Corp., США).
