Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Объект исследования и его свойства 9
1.2. Физические свойства амфетамина и его производных 10
1.3. Химические свойства амфетамина. Воздействие на организм человека 11
1.4. Методы исследования наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях человека 14
1.4.1. Физико - химические методы 15
1.4.2. Иммунохимические методы 24
1.4.3. Иммуноферментный анализ (ИФА) 30
1.4.3.1. Характеристики качества иммуноферментных тест-систем 33
1.4.3.2. Иммунохимические свойства антител и методы их исследования 36
1.5. Определение антител к наркотическим веществам 42
1.5.1. Антитела к наркотикам, индуцированные у животных 42
1.5.2. Антитела к наркотикам, индуцированные у людей 44
2. Материалы и методы исследований 47
2.1. Материалы исследований 47
2.2. Методы исследований 50
2.2.1. Получение реагентов для иммуноферментного анализа определения амфетамина...50
2.2.2. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с различными белками 51
2.2.2.1. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с овальбумином 51
2.2.2.2. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с бычьим сывороточным альбумином (БСА) 52
2.2.3. Получение антител к амфетамину 53
2.2.4. Определение сыворотки, содержащей антитела к амфетамину, методом иммуноферментного анализа 53
2.2.5. Разработка иммуноферментного анализа определения амфетамина в моче 54
2.2.5.1. Подбор оптимальных условий проведения иммуноферментного анализа с использованием кроличьих антител к амфетамину 54
2.2.5.2. Разработка иммуноферментного анализа определения амфетамина в моче с использованием кроличьих антител 55
2.2.5.3. Подбор оптимальных условий проведения иммуноферментного анализа с использованием овечьих антител к амфетамину 55
2.2.6. Иммуноферментный анализ определения амфетамина в моче 56
2.2.7. Сравнительное определение амфетамина в моче методом ГХМС 56
2.2.8. Разработка иммуноферментного анализа антител к амфетамину в биологических жидкостях человека 57
2.2.8.1. Определение рабочего разведения анализируемой сыворотки крови и концентрации антигена, сорбируемого на планшете 57
2.2.8.2. Определение рабочего разведения анализируемой слюны и концентрации антигена, сорбируемого на планшете 58
2.2.9. ИФА определения антител к амфетамину в биологических жидкостях человека 59
2.2.9.1. ИФА определения антител к амфетамину в сыворотке крови человека 59
2.2.9.2. ИФА определения антител к амфетамину в слюне человека 60
2.2.10. Выделение антител к амфетамину из сыворотки крови человека 60
2.2.10.1.Получение сорбента для аффинной хроматографии антител к амфетамину 60
2.2.10.2. Выделение антител к амфетамину методом аффинной хроматографии 61
2.2.11. Изучение иммунохимических свойств антител к амфетамину. Определение
специфичности и аффинности выделенных на аффинном сорбенте антител к
амфетамину 61
2.2.11.1. Выбор условий проведения ингибиторного ИФА 61
2.2.11.2. Ингибиторный ИФА для оценки специфичности и аффинности антител к амфетамину 62
2.2.11.3. Определение специфичности антител к амфетамину 63
2.2.11.4. Расчёт константы аффинности антител к амфетамину 63
3. Результаты и их обсуждение 64
3.1. Получение реагентов для иммуноферментного анализа определения амфетамина 64
3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с различными белками 65
3.1.2. Получение антител к амфетамину 68
3.2. Иммуноферментный анализ определения амфетамина 69
3.2.1. Определение чувствительности разработанного твердофазного ИФА определения амфетамина 71
3.2.2. Определение специфичности разработанного твердофазного ИФА определения амфетамина 72
3.2.3. Определение воспроизводимости результатов разработанного метода ИФА определения амфетамина 73
3.3. Определение амфетамина в биологических жидкостях разработанным твердофазным ИФА и сравнение полученных результатов с другими методами анализа 74
3.4. Иммуноферментный анализ определения антител к амфетамину и определение его диагностической значимости 76
3.4.1. Разработка ИФА выявления антител к амфетамину у больных, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда 78
3.5. Выделение антител к амфетаминам аффинной хроматографией и исследование их иммунохимических свойств 81
3.5.1. Исследование иммунохимических свойств антител к амфетамину 83
3.5.1.1. Определение константы аффинности (Ка) для антител против амфетамина 83
3.5.1.2. Изучение специфичности аффинно очищенных антител к амфетамину 86
3.6. Иммуноферментный анализ определения антител к наркотическим веществам в биологических жидкостях человека 89
3.6.1. Разработка ИФА выявления иммуноглобулинов человека, связывающих конъюгат амфетамин-белок в сыворотке крови 89
3.6.2. Разработка ИФА выявления иммуноглобулинов человека, связывающих конъюгат амфетамина с белком в слюне 90
3.7. Определение диагностической значимости разработанного ИФА выявления антиамфетаминаых антител в сыворотке крови людей 91
3.8. Определение диагностической значимости разработанного ИФА выявления антиамфетаминовых антител в слюне 93
Выводы 97
Список литературы
- Методы исследования наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях человека
- Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с различными белками
- Определение воспроизводимости результатов разработанного метода ИФА определения амфетамина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Увеличение незаконного оборота синтетических наркотиков, в том числе амфетаминового ряда, и злоупотребления ими стало одной из серьезнейших проблем мирового сообщества. Решение многих вопросов, связанных с противодействием распространению наркомании, обуславливает потребность в доступных и достоверных методах, позволяющих при массовых обследованиях быстро выявлять факты злоупотребления психоактивными средствами. Разработка и производство тест-систем для надежной диагностики фактов злоупотребления различных видов наркотических веществ является одним из актуальных направлений биотехнологии.
На сегодняшний день в медицинской практике широкое применение нашли иммунохимические методы анализа, используемые для определения самых разных физиологически активных веществ и объектов - от низкомолекулярных регуляторов метаболизма до маркеров раковых клеток и патогенных микроорганизмов. Уникальная специфичность реакции антиген - антитело позволяет достоверно выявлять индивидуальные соединения в биопробах сложного состава, не прибегая к их предварительной обработке и фракционированию. Наиболее перспективным биотехнологическим методом анализа является иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет в течение 2-3 часов получить результаты анализа большого количества биопроб пациентов.
Известно, что хроническое употребление ряда наркотических веществ приводит к образованию специфических антител в сыворотке крови больных наркоманией. Так, у людей, злоупотребляющих опиатами и препаратами эфедрина, выявлено повышение уровня иммуноглобулинов (IgG), связывающих эти вещества. Специфические антитела к наркотикам долгое время циркулируют в кровотоке в отличие от быстро выводимых из мочи метаболитов. Полученные научные данные стали основой для создания новых методов диагностики скрытых форм наркомании.
Цель работы. Цель данного исследования заключается в разработке эффективных методов твердофазного иммуноферментного определения амфетамина и антител к нему в биологических жидкостях человека и установление его практической значимости в диагностике и профилактике употребления препаратов амфетаминового ряда.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Осуществить синтез иммунохимических реагентов - новых конъюгированных антигенов, содержащих в своем составе производные амфетамина на макромолекулярном носителе - белковой матрице.
Разработать условия проведения твердофазного иммуноферментного анализа определения амфетамина в биологических жидкостях человека с использованием различных вариантов получения иммунохимических реагентов.
Провести сравнительное определение амфетамина в моче человека разработанным иммуноферментным методом и хроматографическим способом. Установить диагностическую значимость разработанного иммуноферментного метода.
Разработать иммуноферментные методы определения антител к амфетамину в биологических жидкостях человека. Оптимизировать условия определения антител к амфетамину в сыворотке крови человека на основе использования в иммуноферментном анализе новых синтетических антигенов.
Синтезировать сорбенты для аффинной хроматографии, провести выделение антител к амфетамину из сыворотки крови больных, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда, и доноров, исследовать их иммунохимические свойства.
Провести сравнительный анализ содержания специфических антител к амфетаминам в биологических жидкостях человека и установить практическую значимость разработанных вариантов иммуноферментного анализа.
Научная новизна. Получены новые конъюгаты амфетамина с использованием различных
методов синтеза.
Разработаны оригинальные способы твердофазного иммуноферментного анализа для определения амфетамина и антител к нему в биологических жидкостях человека, являющиеся основой комплексного подхода к диагностике наркомании.
На основе исследования сыворотки крови больных, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда, обнаружены антитела к указанному наркотическому соединению. Причём, достоверно установлено увеличение уровня антител к амфетамину по сравнению с нормой при злоупотреблении амфетаминовыми препаратами, в период развития зависимости от наркотика. Впервые выполнено определение иммуноглобулинов класса А, связывающих производные этого препарата, в слюне больных наркоманией. Проведено сравнительное определение содержания данных иммуноглобулинов, концентрации slgA и общего белка слюны.
Практическая значимость работы. Результаты по созданию новых методов иммуноферментного анализа амфетамина и антител к нему в биологических жидкостях человека получили высокую оценку специалистов и имеют важное значение для практического использования в диагностике наркомании.
На базе лаборатории иммунохимии физиологически активных веществ ИФАВ РАН разработана технология изготовления тест-систем для определения амфетамина в моче. Данные тест-системы зарегистрированы как изделия медицинского назначения (Набор реагентов для иммуноферментного определения амфетаминов в моче «Дианарк-А» № ФСР 2009/0530 от 30 июня 2009 г.) и с 2009 года начат выпуск опытно-промышленных партий этой тест-системы для применил в отечественном здравоохранении.
Апробация работы. Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены на заседании Ученого совета кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева (протокол №651 от 22 декабря 2008 г.). на межлабораторной конференции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН) (протокол №1 от 24 декабря 2008 года). Результаты исследования представлены на VII Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, ноябрь 2008 г.); Первом Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009 г); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии, Первом Российском национальном конгрессе по наркологии (Москва, ноябрь 2009 г.); Восьмой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Москва, 2009 г.); Научно-практической конференции "Современные аналитические задачи определения наркотиков, лекарственных средств и других компонентов в различных матрицах» (Москва, май 2010 г.). Зарегистрирована Медицинская технология «Метод раннего выявления потребления наркотических веществ «Дианарк» для предупреждения наркомании». Учреждения разработчики: МНПЦ наркологии ДЗ г. Москвы, ИФАВ РАН, г. Черноголовка Моск. обл., ООО «Диамедика»
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьях в научных журналах, рекомендованных ВАК, 6 - сборниках статей и материалах конференций.
Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы (197 источников). Работа содержит 19 таблиц и 13 рисунков. Материалы изложены на 113 страницах машинописного текста.
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии физиологически активных веществ ИФАВ РАН и на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева.
Методы исследования наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях человека
Исследование методом УФ-спектроскопии. Наиболее важное значение метод УФ-спектроскопии приобретает при проведении количественных определений амфетаминов и других наркотических веществ. Метод имеет ряд достоинств: простота и экспрессность определения, возможность проведения определений в водных растворах. Кроме того, метод не требует наличия редких реактивов и растворителей, отсутствует стадия сложной предварительной пробоподготовки объекта, определению не мешают такие часто встречающиеся наполнители, как сахара, крахмал, стеараты, сода [17].
Оборудование для УФ-спектроскопии имеется практически во всех экспертно-криминалистических подразделениях. При использовании метода УФ-спектроскопии для количественных определений необходимо иметь построенную калибровочную кривую по стандартным растворам на данном приборе [93].
В основе количественных определений спектральными методами лежит закон Бугера-Ламберта-Бера, устанавливающий зависимость между оптической плотностью и концентрацией анализируемого раствора. Следует выделить два способа количественного определения веществ методом УФ-спектроскопии [1, 113].
Первый способ - самый простой, но он требует наиболее полного знания о составе объекта и применим к смесям, не содержащим каких-либо веществ, поглощающих в той же области, что и определяемый компонент. При этом необходимо убедиться с помощью любого физико-химического метода в наличии только одного из амфетаминов в пробе и отсутствии мешающих веществ (веществ, поглощающих в той области спектра, которая используется для спектрального исследования) [67, 68].
Второй способ количественного определения представляет собой сочетание методов ТСХ и УФ-спектроскопии, требует более длительной пробоподготовки объекта, но является универсальным методом при исследовании различных смесей, содержащих один или несколько амфетаминов, а также различные наполнители [68, 68].
Принципиальная схема количественного определения наркотических веществ методом УФ-спектроскопии с предварительным разделением методом ТСХ включает несколько этапов. К достоинствам данного метода спектроскопии в УФ-области света иногда используется для определения токсических и смертельных концентраций не только производных амфетамина и других наркотических веществ в моче, крови, желчи, содержимом желудка и печени [64, 80].
Однако недостатком данного метода является то, что количественное определение проводится только после идентификации наркотических веществ в исследуемом объекте любым физико-химическим методом [68, 68, 94, 106]. Исследование методом хроматомасс-спектрометрии. Исследование компонентного состава методом хроматомасс-спектрометрии проводят на кварцевой капиллярной колонке длиной 15 - 30 см (НР-1, НР-5 или аналогичная) с диметилсиликоновой стационарной фазой в описанных ниже условиях [1].
Регистрация масс-спектров разделенных компонентов проводится в режиме скан по полному ионному току. Полученные масс-спектры сравниваются с библиотечными масс-спектрами [58, 59, 67].
Результат может считаться достоверным при наличии на хроматограмме минимум 8-10 хроматографических пиков. При исследовании объектов, имеющих низкое содержание действующего начала, возможно использование режима Splitless (без деления потока) [17, 62, 80].
Исследование неизменённых амфетаминов и их аналогов методом масс-спектрометрии при использовании ионизации электронным ударом связано с определёнными трудностями, так как почти все они являются близкими структурными аналогами и имеют схожие, трудно различимые между собой масс-спектры [60]. Исследование методом хроматомасс-спектрометрии проводят для качественного выявления амфетамина, но из-за дороговизны оборудования и сложной пробоподготовки нет возможности качественного определения (Рисунок 4).
Этот метод можно использовать для анализа газообразных, жидких и твёрдых веществ с молекулярной массой меньше 400 г/моль, которые должны удовлетворять определённым требованиям, главные из которых — летучесть, термостабильность, инертность, лёгкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому газовую хроматографию широко используют как серийный метод анализа органических соединений. С помощью газовой хроматографии проводят качественный и количественный анализ термически стабильных органических и неорганических соединений, давление пара которых при температуре колонки превышает 0,001 мм рт. ст. (0,13 Па). Газовая хроматография позволяет определять соединения, находящиеся в анализируемых пробах в очень малых концентрациях - 10"4 - 10"8%. Широко используется газовая хроматография и для определения различных физико-химических характеристик (констант межфазного распределения, коэфактивности, констант скорости и равновесия химических реакций, коэф. диффузии и др.) [94, 96, 99]. Достоинство метода заключается в том, что газовая хроматография позволяет проводить количественное определение амфетаминов.
В связи с тем, что амфетамины хроматографируются в виде несимметричных пиков, необходимо проводить исследование, получая их трифторацетильные производные [89]. Следует отметить, что исследование амфетаминов нужно проводить с чистой газохроматографической системой (т.е. необходимо проводить регулярную чистку детектора, инжектора и кондиционирование хроматографической колонки). Зоны разделенных компонентов в потоке газа поступают в детекторы хроматографические. В газовой хроматографии используются практически только дифференциальные детекторы (катарометр, пламенно-ионизационный, электронно-захватный, пламенно фотометрический). Регистратор записывает изменение сигнала во времени. Полученная диаграмма называется хроматограммой [17, 55, 67, 74, 75, 76].
Выполнение этого метода анализа достаточно трудоемко, требует специальной обработки анализируемых образцов, связанной с экстракцией биологической жидкости и легко летучих производных исследуемой пробы, что значительно усложняет проведение анализа, так же как дороговизна оборудования и длительное время анализа [68, 99, ПО, 144].
Исследование методом жидкостной хроматографии. Исследование методом жидкостной хроматографии применяют как для качественного выявления производных амфетамина и других наркотических веществ, так и для их количественного определения в экспертных образцах [19, 190].
Для проведения количественного определения производных амфетамина калибруют УФ-детектор, применяя для этого растворы индивидуальных веществ с точно известной концентрацией (метод абсолютной калибровки). Анализ образцов, изъятых из незаконного оборота и содержащих производные амфетамина, хроматографируют в указанных условиях. Выявление хроматографических пиков, соответствующих производным амфетамина, проводят, сравнивая время удерживания пиков компонентов хроматограммы анализируемого вещества с временем удерживания компонентов хроматограммы модельной смеси. Для компонентов с близкими значениями времени удерживания проводят сравнение УФ-спектров и применяют метод добавок. Концентрацию производных амфетамина в экстракте анализируемого вещества определяют по калибровочным графикам [17, 67, 75, 190, 141].
Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с различными белками
Определение аффинности антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами.
Во-первых, гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе по сродству к антигену. Во-вторых, сложностью определения общего количества антител, а также отдельных фракций. В-третьих, в случае поливалентных антигенов возможностью образования комплексов сложного состава, в том числе циклической структуры, в которых проявляется кооперативность взаимодействия активных центров антител. Все это не позволяет применить традиционные методы для расчета истинных значений констант связывания. Более надежные данные могут быть получены для моноклональных антител и их Fab-фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.
В основе взаимодействия антиген-антитело лежат те же законы термодинамики, что и в любой обратимой биомолекулярной реакции связывания.
Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия антиген - антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител.
Рассмотрим принципиальные подходы к определению констант равновесия. Из уравнения следует, что для расчетов необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют антигены, меченные маркером, который с высокой чувствительностью может быть определен одним из доступных физико-химических методов.
Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие группы (Таблица 5). К первой относятся методы, в которых стадия разделения свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания или гельфильтрации. Если реагенты достаточно сильно различаются своими молекулярными массами и размерами, то процедура разделения существенно упрощается. В случае корпускулярных антигенов оставшиеся несвязанные антитела могут быть отделены либо центрифугированием, либо пропусканием смеси через фильтр, задерживающий антиген. Для низкомолекулярных антигенов используется равновесный диализ. Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.
Равновесный диализ - наиболее распространенный метод изучения реакции антиген - антитело. Метод основан на различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемые мембраны. Раствор каждого реагента известной концентрации в одном и том же растворителе с одинаковой ионной силой и значением рН помещают по разные стороны мембраны. Молекулы гаптена диффундируют в раствор антител и связываются с ними. При достижении равновесия концентрация свободного гаптена выравнивается по обе стороны мембраны. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно рассчитать количество гаптена, связанного с антителами, и определить по уравнению константу связывания.
Как правило, метод равновесного диализа применяется для низкомолекулярных соединений с Afr 3000. Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода. К недостаткам метода надо также отнести относительно большое время достижения равновесия и необходимость учета эффектов, вызываемых присутствием мембраны, в результате чего необходимо работать с достаточно высокими концентрациями реагентов, что значительно понижает чувствительность определения константы связывания.
Методы фракционного осаждения используются для разделения комплексов антиген - антитело и несвязавшегося антигена. Они основаны на способности высокомолекулярных комплексов антиген - антитело избирательно осаждаться различными реагентами. При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации, при которой комплекс антиген - антитело и несвязавшиеся антитела становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
Методы, не включающие фазовое разделение вступившего и не вступившего в реакцию антигена, относятся к группе гомогенных методов.
Флуоресцентные методы основаны на способности остатков триптофана в молекулах белков флуоресцировать при возбуждении УФ светом. Взаимодействие ряда антигенов с антителами приводит к изменению интенсивности флуоресценции, что может быть использовано для оценки количества антигена, вступившего в реакцию с антителами. В зависимости от химической структуры антигена может наблюдаться как усиление, так и гашение флуоресценции. Степень гашения интенсивности свечения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации образовавшихся специфических комплексов. Методы флуоресценции просты, не занимают много времени и имеют высокую чувствительность, что сокращает расход реагентов.
Метод деполяризации флуоресценции основан на измерении поляризации флуоресценции антигена, меченного красителем, до взаимодействия с антителами и после комплексообразования. Поляризация флуоресценции определяется молекулярным объемом частицы и степенью ее асимметрии. Комплексообразование антигена с антителом сопровождается резким изменением поляризации флуоресценции красителя, который играт роль метки антигена или антитела. Предел обнаружения антигена этими методами достаточно мал. Недостатками методов, основанных на измерении флуоресценции, являются необходимость работы с препаратами очищенных антител и строгие требования к структуре изучаемых антигенов. Вследствие этого флуоресцентные методы не являются универсальными и могут быть применены для ограниченной группы антигенов.
Определение воспроизводимости результатов разработанного метода ИФА определения амфетамина
С другой стороны, данные по специфичности антител, индуцированных свободным наркотиком у людей (таблица 16) свидетельствуют о том, что каждая сыворотка больного, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда, индивидуальна по специфичности. Однако все антитела можно разделить на три группы. Во-первых, при индукции антител к амфетаминам свободным наркотиком образуются высокоспецифичные антитела, связывающие только амфетамин (сыворотки № 4, 6, 7, 9, 10). Во-вторых, были выявлены, взаимодействующие с производными амфетамина - метамфетамин и эфедрин (сыворотки № 3 и 5). В-третьих, обнаружены антитела, реагирующие в одинаковой степени как с амфетамином, так и с его производными (№ 1, 2, 8).
Существование различий в специфичности антител, индуцированных низкомолекулярным наркотиком, можно объяснить тем, что как хорошо известно из биохимических исследований, амфетамин в организме под действием различных ферментативных систем (пероксидаза, цитохром Р-450, ксантиноксидаза и др.) трансформируется в реакционноспособные интермедиаты, которые могут связываться с белками организма с образованием естественных конъюгированных антигенов, являющихся индукторами синтеза специфических антител. Вероятно, именно эти процессы и приводят к образованию индивидуальной для каждого организма смеси естественных конъюгированных антигенов, что и обуславливает в конечном итоге разнообразие индуцируемых антител.
В результате установлено, что все выделенные из сыворотки крови антитела индивидуальны по своей специфичности и не дают перекрёстных реакций с исследованными ингибиторами, отличающимися по структуре от использованных для аффинной хроматографии.
Таким образом, установлено, что по мере развития патологического состояния (наркомании) в организме у больного человека, происходит изменение уровня антител, возрастает их аффинность и способность избирательно связываться с антигенами, предохраняя организм от патогенного воздействия. Таблица 16. Специфичность антиамфетаминовых антител, выделенных из сыворотки крови больных, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда.
Создание твердофазного иммуноферментного анализа выявления антител к амфетамину проводили на основе синтезированных конъюгированных антигенов -производных амфетамина с белком. В ходе исследования было изучено влияние различных условий сенсибилизации планшета, а именно: концентрации конъюгированных антигенов КА-1 и КА-2. Также было подобрано оптимальное соотношение реагентов для проведения анализа. Результаты данной работы представлены в таблице 17.
Сравнительный анализ данных, представленных в таблице 17 показал, что использование КА-1 по сравнению с КА-2 имеет ряд преимуществ при проведении ИФА антител к амфетамину. Так, использование КА-1 позволяет иммобилизовать на планшет антиген в меньшей, по сравнению с КА-2, концентрации, а также работать при более высоком разведении сыворотки. Эти факторы способствуют выявлению специфического взаимодействия антител с антигеном и снижение уровня неспецифического фона.
Далее с помощью ИФА мы проводили анализ содержания иммуноглобулинов, связывающихся с КА-1, у 95 больных, употребляющих психостимулирующие препараты амфетаминового ряда, и 32 доноров. Все полученные данные обрабатывали, используя методы вариационной статистики.
Установлено, что среднее значение оптической плотности OD450 У доноров составляет 0,580±0,005 в случае IgM и 0,530±0,007 для IgG, а у наркоманов 0,776±0,010 и 0,643±0,006 соответственно.
Обследовали группу больных с наркотической зависимостью (22 человека) и группу здоровых доноров (20 человек). Для больных наркоманией, поступивших в клинику добровольно, обеспечивалась анонимность лечения. Возраст больных составлял от 25 до 40 лет, здоровых людей - от 20 до 30 лет. Длительность употребления наркотиков колебалась от 1 года до 10 лет. Большинство лиц в группе наркоманов употребляли опиаты, амфетамины и каннабиноиды. Давность последнего приема наркотика колебалась от двух часов до трех месяцев. Слюну собирали утром натощак после ополаскивания ротовой полости водой путем сплевывания ее в пробирку в течение 10-15 минут. Далее образцы слюны центрифугировали (10 тыс. об/мин) в течение 15 минут, собирали надосадок и хранили при температуре -20С.
Первый этап работы был связан с выбором условий выполнения ИФА для определения антител к конъюгату амфетамина. С этой целью исследовали влияние различных концентраций сорбируемого антигена и разведений слюны на уровень выявления антител, относящихся к иммуноглобулинам человека класса А против амфетамина.
Анализ результатов зависимости изменения оптической плотности в ИФА от различных концентраций иммобилизованного антигена показал возможность работы в диапазоне от 2,5 мкг/мл до 5 мкг/мл для конъюгатов амфетамина. Для использованных разведений слюны область линейной зависимости в ИФА с учетом выбранных концентраций антигена находится в интервале от 1:4 до 1:40. Однако наиболее значительная достоверная разница при определении оптической плотности в ИФА образцов слюны доноров и больных наркоманией обнаружена при сорбции конъюгированного антигена 3 мкг/мл и разведении слюны 1:20.
Определение диагностической значимости разработанного ИФА выявления антиамфетаминаых антител в сыворотке крови людей.
На первом этапе работы для обследованной группы наркоманов провели выявление антител к амфетамину твердофазным ИФА. Из полученных результатов определили количество больных, имеющих по сравнению с донорами достоверно повышенный уровень иммуноглобулинов к данному антигену. За величину порогового уровня, разделяющего анализируемые сыворотки, приняли среднее значение оптической плотности в ИФА (OD450) плюс трехкратное стандартное отклонение.
Для сопоставления результатов ИФА с клиническими данными обследовано 27 человек. Результаты сопоставления диагнозов с результатами иммунологического исследования сывороток имело место в 90% случаев. Применение разработанного способа диагностики позволило дополнительно к клиническому обследованию выявить несколько лиц, злоупотребляющих амфетаминами (испытуемые № 12, №18, а также № 55 и № 60) Был поставлен под сомнение факт длительной ремиссии (более 4 мес.) у больных № 19, № 39, № 61. Результаты анализа для больных этой группы представлены в таблице 18.
