Содержание к диссертации
Введение
1. Характеристика выделяемых объектов 10
1.1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор 10
1.1.1. Функции 10
1.1.2. Структура 10
1.1.3. Секреция и механизм действия 13
1.1.4. Применение препарата рчГ-КСФ в медицинской практике.... 14
1.2. Соматотропин 15
1.2.1 Функции 15
1.2.2. Структура 16
1.2.3. Секреция и механизм действия 17
1.2.4. Свойства рекомбинантного ГРЧ 20
1.2.5. Применение препарата ГРЧ в медицинской практике 22
2. Солюбилизация и ренатурация эукариотических белков, экспрессируемых в Е. coli в виде телец включения 23
2.1. Введение 23
2.2. Характеристика телец включения 23
2.3. Фолдинг белков в живой клетке 25
2.4. Промежуточные состояния и их роль в образовании агрегированных форм белка 28
2.5. Ренатурация белков in vitro 30
2.6. Методы солюбилизации и ренатурации белков, формирующих тельца включения 31
2.6.1. Традиционные методы 31
2.6.2. Методы, позволяющие улучшить проведение процесса ренатурации белка, полученного из телец включения 33
2.6.3. Новейшие методы солюбилизации белков, позволяющие добиться высокого выхода белка после ренатурации 34
3. Требования зарубежных фармакопей к фармацевтическим генно-инженерным препаратам 36
3.1. Введение 36
3.2. Определяемые примеси и методы контроля 37
3.3. Эндотоксины 38
3.3.1. Методы определения эндотоксинов 40
3.3.2. Взаимодействие эндотоксинов с белками 42
3.3.3. Методы удаления эндотоксинов 43
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47
1. Оборудование, реактивы, сорбенты 47
2. Методы 49
2.1. Аналитические методы 49
2.2. Препаративные методы 54
3. Математические расчеты 58
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 59
1. Оптимизация процесса ренатурации Met-рГРЧ и рчГ-КСФ 59
1.1. Введение 59
1.2. Солюбилизация в мягких условиях (Схема 1) 59
1.3. Солюбилизация в жестких условиях (Схема 2) 65
1.4. Масштабирование процесса ренатурации 69
2. Подбор условий очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ 71
2.1. Ионообменная хроматография 71
2.1.1. Исследование влияния рН и размера частиц сорбента на процесс ИОХ 71
2.1.2. Определение динамической емкости сорбента 74
2.1.3. Определение рабочей скорости проведения ИОХ 76
2.2. Оценка чистоты Met- рГРЧ и рчГКСФ после ИОХ 797
2.3. Подбор условий отщепления N-концевого метионина от Met-рГРЧ.. 79
2.4. Гидрофобная хроматография 81
2.5. Масштабирование процессов очистки 86
3. Анализ качества выпускаемых препаратов 93
3.1. Анализ рГРЧ 93
3.2. Анализ рчГКСФ 97
ВЫВОДЫ 100
БЛАГОДАРНОСТИ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102
- Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
- Характеристика телец включения
- Определяемые примеси и методы контроля
Введение к работе
Актуальность исследования.
Получение лекарственных препаратов с помощью методов генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Возможность получения фармацевтических генно-инженерных белков в промышленности дает следующие преимущества: отсутствие ограничений по источнику сырья и низкая себестоимость конечного продукта.
В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из природных источников, на их рекомбинантные аналоги. Такие препараты, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня успешно применяются в медицинской практике. Способы получения инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста человека, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, окситоцина и др. были запатентованы в разных странах. Они характеризуются различными способами экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовой вариабельностью и видовым разнообразием продуцирующих культур, способами очистки и качеством самих препаратов. Однако в России, по ряду причин, отсутствуют как собственные технологии получения многих, из перечисленных выше, терапевтических препаратов, а имеющиеся инновационные разработки не внедрены в производство.
Одним из путей быстрого развития биофармацевтической промышленности является производство дженериков - лекарственных препаратов, срок действия патентной защиты на которые уже закончился. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях ОМР, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми.препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.
Цель исследования:
Целью диссертационной работы являлась разработка технологий получения и очистки рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения для организации полномасштабного промышленного производства активных фармацевтических субстанций.
Задачи исследования:
Оптимизировать условия проведения процессов солюбилизации и ренатурации рГРЧ и рчГ-КСФ в различных условиях.
Подобрать условия, позволяющие оптимально осуществить хроматографическую очистку рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения на промышленных сорбентах.
Подобрать условия ферментативного отщепления Ы-концевого метионина от Ме^рГРЧ.
Выявить критерии, определяющие масштабирование процессов получения рГРЧ и рчГ-КСФ.
Масштабировать процессы получения рГРЧ и рчГ-КСФ в условиях опытно-промышленного производства.
Провести сравнительную оценку качества полученных препаратов с импортными аналогами.
Научная новизна полученных результатов
Впервые, для ренатурации белков, Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ, был применен пероксид водорода, который позволяет быстро и эффективно проводить процесс при высокой концентрации белка.
Установлено, что применение Си804 в процессе ренатурации осложняет очистку белков от эндотоксинов.
Выявлена новая, ранее нигде не опубликованная структурная модификация рГРЧ, связанная с преобразованием дисульфидной связи
11 СО
Суэ -Суэ в тиоэфирную при рН 12.
Практическая значимость полученных результатов:
Разработан опытно-промышленный регламент на производство 150 г субстанций рГРЧ за один производственный цикл.
Разработанный технологический процесс производства рГРЧ используется для производства лекарственного препарата «Растан».
Разработан опытно-промышленный регламент на производство 100 г субстанции рчГ-КСФ за один производственный цикл.
Разработанный технологический процесс производства рчГ-КСФ используется для производства лекарственного препарата «Нейпомакс».
Список опубликованных научных работ по теме диссертации:
Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, Т.И. Костромина, Т.Д. Мелихова, A.A. Вайнсон, Е.В. Свешникова, A.A. Зинченко, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили: Разработка и оптимизация технологического процесса получения субстанции филграстима // Биотехнология.—2009.— № 5.—С.24 - 32.
Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, С.А. Косарев, Г.О. Кожевников, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили, А.И. Мирошников // Опытно-промышленная технология получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека.—Биотехнология.—2008.—№ 5.—С.ЗЗ - 42.
Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Т.Г. Галкина, Д.И. Баирамашвили: Сравнительный анализ качества российского препарата РАСТАН с зарубежными аналогами ГЕНОТРОПИН и ХУМАТРОП // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме Биофарма 2009 —2009.—Турция.—С. 19.
Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Д.И. Баирамашвили: Технология производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в промышленных масштабах // Тезисы научных докладов на Международной школе-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетики.—2008.—Москва.—С.49.
А.И. Бобрускин, Н.В. Кононова, Д.И. Баирамашвили: Промышленная технология производства рекомбинантного гормона роста // Тезисы научных докладов на IV Московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития.—2007.—Москва.—С.85.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. Характеристика выделяемых объектов.
1.1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.
Колониестимулирующие факторы (КСФ, факторы роста) - группа эндогенных физиологически активных соединений полипептидной структуры, относящихся к цитокинам. Они обладают специфической способностью связываться с рецепторами гемопоэтических клеток и стимулировать их пролиферацию, дифференциацию и функциональную активность [1].
Функции.
Г-КСФ влияет на состояние системы кроветворения, образование функционально активных нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. Г-КСФ играет важную роль в регуляции гранулоцитопоэза как в равновесном состоянии, так и в условиях его экстренной активации, например, при инфекции [2]. Уровень Г-КСФ в физиологических условиях, у здоровых людей, низок - менее 30 пг/мл, он может значительно колебаться при различных патологических состояниях, связанных с потребностью в большем количестве нейтрофилов [3].
Ген, контролирующий синтез Г-КСФ, локализован у человека на 17-й хромосоме. Тяжелые нарушения в системе крови могут возникать при повреждении участков генома, ответственных за синтез молекулярных регуляторов гемопоэза, за синтез их рецепторов на колониеобразующих клетках. Так, например, нарушенное воспроизводство Г-КСФ в организме является причиной тяжелой наследственной нейтропении у детей, приводящей к их ранней гибели из-за легкой поражаемостью микробными и вирусными инфекциями [4].
Структура.
Г-КСФ человека впервые получили из плаценты и опухолевых клеточных линий (клетки эпителиальной карциномы, острой миелоидной лейкемии) [5, 6]. к ДНК Г-КСФ была успешно клонирована в бактериальных и животных клетках, что позволило определить его аминокислотную последовательность [7,8]. Природный Г-КСФ не содержит сайтов N-гликозилирования, и единственная О-гликозильная группа присоединена к Thr [9]. Молекула содержит свободную сульфгидрильную группу цистеина в положении Cys и две внутримолекулярные дисулифидные связи в положениях Cys36- Cys42 и Cys64-Cys74[10]. Г-КСФ существует в двух формах: белок типа А состоит из 177 аминокислотных остатков и белок типа В, более активный и представляющий собой основную форму - из 174 аминокислотных остатков (рис. 1). Молекулярная масса последнего составляет 19:6 кДа [И]. Белок в А-форме является минорным продуктом альтернативного сплайсинга мРНК и отличается
3 г «Э /г содержанием вставки из 3 аминокислот (Val-Ser-Glu) между Leu и Cys [12]. Рекомбинантный Г-КСФ человека (рчГ-КСФ), получаемый в клетках E.coli имеет ту же первичную структуру, что и природный Г-КСФ1 типа В, но не гликозилирован и содержит дополнительный N-концевой остаток- метионин [11].
Сравнение биологических и физико-химических свойств природного и рекомбинантного Г-КСФ в различных экспериментальных условиях позволило сделать вывод, что углеводная цепочка не влияет на биологические функции и связывание с рецептором, но существенно повышает физико-химическую стабильность, предотвращая полимеризацию и/или конформационные изменения белка [13,14]. Молекулярный механизм стабилизирующего эффекта гликозилирования, по-видимому, состоит в том, что углеводный остаток уменьшает подвижность в молекуле белка вокруг сайта гликозилирования [15]. Сайт-направленный мутагенез в молекуле Г-КСФ позволил установить, что свободный Cys не существенен для активности белка, в то время как модификация одного или нескольких Cys, формирующих дисульфидные связи, приводит к снижению биологической активности и нарушению вторичной и
ТРЬОРА88ЬР10д5РЬЬКСЬЕд2(уКЮ0ОШААз0ЬдЕК1^ТУК^^1РЕЕЬУЬЬ50
РТЬПТЬдЬОУ,0АОРАТТ^Ш2МЕЕЬОМАРА1нз^Р)ОАМРА^^Д8АРдРЯАСЮ УЬУА8Н1Х}8Р160 1У8УЕУиЩ70ЬАОР
Рис 1. Первичная структура Г-КСФ человека. Утолщенными сплошными линиями показаны дисульфидные мосты. Желтым цветом выделен Суя , содержащий свободную дисульфидную группу. Красным цветом выделен ТИг133 — положение О-гл икозилирован ия.
ТЬг133
Рис. 2. Пространственная структура Г-КСФ человека. Зеленым цветом показаны а-спирали, голубым - нерегулярные участки, /? - повороты и Р - складки, оранжевым- дисульфидные связи желтым цветом выделен Суэ , содержащий свободную сульфгидрильную группу. Красным цветом ТИг'33 - положение О-гликозилирования. третичной структур молекулы [16]. Дисульфидные мостики играют критическую роль в поддержании молекулы в свернутой биологически активной форме [17].
Третичная структура Г-КСФ человека была полностью изучена рентгенокристаллографией и ЯМР-спектроскопией. Г-КСФ является белком, обладающим а-спиральной структурой, 104 из 174 аминокислотных остатков формируют пучок из четырех антипараллельных а-спиралей с углами пересечения -18 , которые соединены с помощью двух длинных и одной короткой петель (рис. 2). Спирали во вторичной структуре белка обозначены А-В, начиная от Ы-конца: аА (8ег12-С1и33), аВ (Ьеи71-С1у94), С (АКО Ьеи103- 01и123), Б (РЬе|44-Н1з170). Помимо основного пучка, Г-КСФ содержит спиральную область в АВ-петле (Е-спираль), АКО (Уа48-01у55), которая начинается сразу за первым' дисульфидным мостиком. Е-спираль уложена почти перпендикулярно к основному пучку возле 14-конца спирали О, за счет чего относительно экспонирована и выступает из основной структуры молекулы [17-19]. Г-КСФ относится к подтипу суперсемейства цитокинов типа I, обладающих сходной структурой (пучок из четырех антипараллельных а- спиралей), за исключением наличия в Г-КСФ уникальной Е-спирали. В этот подтип цитокинов типа I входит также и гормон роста [20].
1.1.3. Секреция и механизм действия.
В качестве индукторов синтеза О-СЗБ выступают такие противовоспалительные цитокины, как фактор некроза опухоли (ТЫБа), интерлейкины (1Ь-17, 1Ь-8) и моноклональные антитела. Продукция фактора происходит в эндотелиальных, стромальных клетках костного мозга, макрофагах и опухолевых клетках [4].
Биологические эффекты Г-КСФ опосредуются его взаимодействием с высоко-специфическим рецептором (О-СБИ*.), что приводит к значительному повышению количества гемопоэтических (С034+) стволовых клеток (предшественников нейтрофилов) в периферической крови. В * костном мозге стволовые клетки фиксированы к стромальным элементам и эндотелиальным клеткам с помощью молекул адгезии (интегринов и селектинов). При этом для поддержания нормального уровня нейтрофилов в циркуляции находится очень небольшое количество CD34+ - клеток. Молекулы адгезии обеспечивают взаимодействия между гемопоэтическими стволовыми клетками и элементами микроокружения костного мозга, которые в свою очередь играют центральную роль в пролиферации и миграции стволовых клеток. Мишенью для действия Г-КСФ являются нейтрофильные гранулоциты и моноциты, имеющие самую высокую плотность G-CSFR на своей поверхности. Эти клетки, получив сигнал от Г-КСФ, инициируют выработку вторичных посредников, которыми могут быть другие цитокины (IL-8, IL-3, ГМ-КСФ) и/или ферменты-коллагенозы (ММР-9 и ММР-2), разрушающие связь СБ34+-клеток со стромальными элементами костного мозга. В результате чего происходит усиление миграции С034+-клеток в периферическую кровь. Для пролиферации гемопоэтических стволовых клеток необходима их плотная фиксация на стромальных элементах костного мозга. Это достигается с помощью молекул адгезии, а экспрессия молекул адгезии на поверхности CD34+-клеток костного мозга повышается при действии цитокинов, стимулирующих пролиферацию, таких, как stem cell factor (SCF), гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (ГМ-КСФ) и IL-3 [21].
1.1.4. Применение препарата рчГ-КСФ в медицинской практике. рчГ-КСФ применяется у ВИЧ-инфицированных лиц, онкологических больных после радио- и химиотерапии и у людей с врожденной нейтропенией для коррекции иммунодефицитных состояний, а также для профилактики инфекционных осложнений [22].
1.2. Соматотропин.
Соматотропин (гормон роста - ГР, соматотропный гормон-СТГ) - белковый гормон, вырабатывается передней долей гипофиза. Секретируется в кровь под воздействием соматостатина и СТГ-выделяющего фактора - соматолиберина. Время и частота выделения регулируются соматостатином, а количество выделяемого ГРЧ регулируется соматолиберином. Гормон роста человека относится к группе анаболических гормонов [23].
1.2.1 Функции.
Сома - значит «тело». Соматотропный. - значит имеющий «тропность» - сродство к телу. В период роста организма соматотропин является основным ростовым фактором. От его количества напрямую зависит рост тела, как в длину, так и в ширину. Чем больше в организме соматотропина, тем больше вырастает человек. После того, как хрящевые зоны роста в костях скелета окостенеют, и рост костей в длину прекращается, некоторое время ещё идет рост костей в толщину. В некоторых частях скелета зоны роста не подвергаются окостенению на протяжении всей жизни человека. Такие участки роста имеются в нижней челюсти, носу, кистях и стопах. Иногда бывает так, что в силу самых разных причин в молодом возрасте секреция гормона роста сильно увеличивается. Тогда вырастают гиганты, которые иногда достигают роста более 2-х метров. Такое состояние считают заболеванием и называют «гигантизм». При недостатке гормона роста в детском возрасте люди вырастают очень маленькими, и их называют карликами. На языке медиков такое состояние носит название «гипофизарный нанизм».
Иногда, когда большинство зон роста уже закрыты, секреция гормона роста резко увеличивается. В этом случае у человека значительно вырастают нижняя челюсть, нос, кисти рук и ступни ног. Такое состояние носит название «акромегалия».
Во взрослом и полностью сформировавшемся организме соматотропин выполняет анаболические функции. Он отвечает за процессы синтеза белка во всех органах и тканях без исключения и плюс ко всему, является еще и стрессовым гормоном. При стрессах уровень ГР в крови резко повышается, и это помогает организму приспособиться к неблагоприятной ситуации за счет усиления синтеза белка, в первую очередь в энергетических структурах клетки. Поэтому люди крепкого телосложения с хорошим прочным скелетом в целом лучше переносят всевозможные стрессы.
ГР вырабатывается в течение всей жизни. Продукция ГР возрастает в период роста организма, примерно, до 20 лет и затем уменьшается с возрастом со средней скоростью 14% в десятилетие [24].
1.2.2. Структура.
Впервые гормон роста животного происхождения был выделен и очищен в 1944 г., а человеческий (ГРЧ) - в 1956 г. Первичная структура соматотропинов была расшифрована в 1970-1972 гг. По химической структуре, физическим, химическим и биологическим свойствам ГР сходен с пролактином и плацентарным лактогеном и входит с ними в одно семейство, так как считается, что эти три гормона произошли в процессе эволюции от общего предшественника. Гормоны роста человека и различных видов животных представляют собой одноцепочечные полипептиды, содержащие около 200 аминокислотных остатков [25]. Видовая специфичность первичной структуры резко выражена. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка с молекулярной массой 22125Да (рис. 3). Сохраняя схему строения, общую для других млекопитающих (содержит два остатка триптофана, три остатка тирозина и четыре остатка, которые образуют в молекуле два дисульфидных моста и формируют две петли - большую, включающую центральный участок аминокислотной последовательности между Суз54- Суэ165, и малую (на С - концевом участке) между Су^-Су^), ГРЧ отличается аминокислотной последовательностью от изученных соматотропинов животных на 34-35%. Этим объясняется неэффективность соматотропинов животного происхождения как стимуляторов роста при введении людям [26].
Третичная структура ГР человека, была определена с помощью рентгенокристаллографии. Так же как и Г-КСФ, ГР является белком, обладающим а-спиральной структурой (рис. 4). Четыре а-спирали (основной пучок), обозначенные aA-aD, начиная от N-конца: aA (Arg-Ala), ссВ (Gln74-Leu87), аС (Туг11'-Gin122), aD (Tyr160-Ser184) расположены относительно друг друга вверх-вверх-вниз-вниз, соответственно, и соединены тремя нерегулярными участками (два длинных и один короткий). Участок Lys168-Glu174 выступает из основной структуры aD-спирали, за счет чего происходит ее небольшой изгиб с направлением N и С-концов внутрь основного пучка. [27,28]. Высокое содержание в молекуле гормона остатков неполярных аминокислот обусловливает большую склонность к образованию в растворе димеров и более крупных агрегатов [29].
1.2.3. Секреция и механизм действия.
На секрецию ГР влияет ряд стимулов (сон, стресс), и она, подобно секреции многих гипофизарных гормонов, носит эпизодический и пульсирующий характер. В течение нескольких минут уровень ГР в плазме может измениться в 10 раз. Один из самых больших пиков отмечается вскоре после засыпания. К другим стимулам относятся стресс (боль, холод, тревога, хирургическое вмешательство), физические упражнения, острая гипогликемия или голодание, белковая пища или аминокислота аргинин. Возможна связь этих и многих других эффекторов, с основным физиологическим действием ГР, состоящим в сохранении глюкозы. При стрессе, гипогликемии, во время сна или голодания ГР стимулирует липолиз (поступление жирных кислот) и проникновение в клетки аминокислот, сберегая, таким образом, глюкозу для метаболизма мозга. На высвобождение ГР оказывает влияние множество агентов, в том числе эстрогены, дофамин, a-адренергические соединения, серотонин, гормоны кишечника и глюкагон. Точкой приложения всех этих
РРТ1РЬ5ЯЬР10ОКАМ ЬРАНКЦ0НдЬАРОТУОЕ30РЕЕАУ1РКЕ940КУ8РЬдЫРдТ50 ^^РЗЕЗ^^/ЗНМЕТддК^ЗЖЕЬЬШдЕ^ЬЬ^ЗХХЪЕРУадОРЬКЗУРАНЗ,^^ YGASDSNV1|0YDLLKDLEEG120IQTLMGRLED130GSPRTGQIFK|40QTYSKFDTNS15 НШВАЬЬКЫУ1б0С1ХУСР1*КОМ 170ВКУЕТРЬЮУ1800СК8УЕО8СО]90Р
Рис. 3. Первичная структура гормона роста человека. Утолщенными сплошными линиями показаны дисульфидные мосты.
соматолиберин
Рис. 4. Пространственная структура гормона роста человека. Зеленым цветом показаны а-спирали, голубым-нерегулярные участки, 13 - повороты и /3- складки, желтым — дисульфидные связи. стресс гипоталамус
ГИПОФ^ передняя г><) я
ГОРМОН РОСТА инсулиноподокнын ФАКТОРЫ РОСТА
ИФР1 И ИФР2
Рис. 5. Механизм действия ГР. Секретируемый гипофизом ГР оказывает эффект на рост, стимулируя транспорт аминокислот в клетку и синтез белка. Эффект ГР опосредуется инсулиноподобными факторами роста (ИФР1 и ИФР2), образуемыми в печени. факторов является вентромедиальное ядро гипоталамуса, где осуществляется регуляция секреции гормона роста по типу обратной связи. Короткая петля системы включает положительный (стимулирующий) регулятор секреции - соматолиберин - и отрицательный (тормозящий) регулятор - соматостатин [24].
Соматотропин вырабатывается в так называемых эозинофильных клетках передней долей гипофиза (рис. 5). Работу гипофиза регулирует гипоталамус. Это особый участок среднего мозга. Там вырабатываются либерины и статины. Соматолиберин (соматотропин-рилизинг-гормон), синтезируемый в вентромедиальном ядре гипоталамуса, усиливает секрецию соматотропного гормона гипофизом. Соматостатин, синтезируемый в супраоптическом (надзрительном) ядре, наоборот, тормозит выработку соматотропина. Чтобы повысить уровень соматотропина в организме человека, необходимо либо увеличить количество соматолиберина, либо уменьшить количество соматостатина [30].
Долгое время считалось, что соматотропин способен сам по себе воздействовать на мышечную ткань, хрящи и внутренние органы. Впоследствии оказалось, что это не так. ГР способен воздействовать на клетки только in vitro в концентрациях в 2000 раз выше физиологической [24]. В нормальном организме он действует исключительно на печень. В печени вырабатываются инсулиноподобные факторы роста (ИФР)- соматомедины, которые тоже оказывают анаболическое и ростовое действие, воздействуя на клетки-мишени с помощью гормонального, паракринного или аутокринного механизмов (рис. 5) [31].
Рост-стимулирующее действие ГР определяет в первую очередь ИФР1, который образуется в печени. ИФР-1 регулирует секрецию ГР, подавляя высвобождение соматолиберина и стимулируя высвобождение соматостатина. ИФР1, ген которого относится к семейству инсулиноподобных генов, первоначально был известен как "сульфирующий фактор" благодаря своей способности стимулировать включение сульфата в хрящ; позднее его стали называть соматомедин С. По структуре он сходен с проинсулином. В плазме человека обнаруживается еще один родственный пептид - инсулиноподобный фактор роста 2. ИФР1 и ИФР2 связываются с мембранными рецепторами, однако они могут быть разделены с помощью специфического радиоиммунного анализа. Несмотря на то, что содержание ИФР1 в плазме вдвое меньше содержания ИФР2, именно ИФР1 обнаруживает сходство с эффектами ГР. Лица с дефицитом ИФР1, вырабатывающие ИФР2 в достаточном количестве, лишены способности к нормальному росту. Инсулиноподобные факторы роста не относятся к панкреатическим гормонам, но, тем не менее, близки к инсулину по структуре и функции. Влияние инсулина на рост и деление клеток трудно отделить от аналогичных эффектов со стороны ИФР1 и ИФР2. Действительно, инсулин и инсулиноподобные факторы роста могут взаимодействовать в этом процессе. Инсулин оказывает более сильное влияние на метаболизм, чем инсулиноподобные факторы роста, однако последние сильнее стимулируют рост клеток. Каждый из этих гормонов имеет свой специфический рецептор. Эти гормоны способны в какой-то степени перекрестно связываться с рецепторами, чем возможно и объясняется присущая, им смешанная биологическая активность. ИФР1 стимулирует рост хряща и ряд процессов в хрящевой ткани: транспорт аминокислот, синтез РНК, ДНК, белка, хондроитин- сульфата, коллагена. Ростовые факторы проявляют также инсулиноподобную активность: в мышцах - это стимуляция транспорта аминокислот (этот процесс протекает значительно быстрее под влиянием ИФР1, чем под влиянием гормона роста) и глюкозы, образование коллагена, синтез белка; в жировой ткани - стимуляция транспорта глюкозы, окисление глюкозы до С02, включение глюкозы в липиды, подавление липолиза (аналогично механизму действия инсулина) [32,33].
1.2.4. Свойства рекомбинантного ГРЧ.
Основным свойством рГРЧ считается усиление в организме белкового синтеза. Это-приводит к значительной задержке азота в организме. В начале повышается содержание белка в печени и сыворотке крови, а затем выраженное анаболическое состояние в мышцах. Увеличивается проникновение аминокислот в мышцы, ускоряется транспорт аминокислот, усиливается включение аминокислот в ядро и митохондрии клеток, образуется новая клеточная протоплазма. При адекватной физической нагрузке происходит гипертрофия мышечных волокон с увеличением их количества и толщины. Мышечная масса при этом значительно возрастает.
Считается, что рГРЧ увеличивает вес внутренних органов, но на практике наблюдается гипертрофия лишь тех органов, которые работают наиболее эффективно. Так, например, при достаточных физических нагрузках гипертрофируется сердечная мышца. В меньшей степени рГРЧ оказывает ростовое действие в отношении селезенки, и в еще меньшей степени* в отношении почек и печени. Говоря о том, что введение больших доз соматотропина вызывает спланхомегалию (увеличение внутренних органов), не следует забывать, что при интенсивной мышечной деятельности рГРЧ действует, в первую очередь, на мышцы. При длительной работе на выносливость рГРЧ расходуется не на гипертрофию мышечных волокон, а на увеличение в размере митохондрий, а также увеличение их количества (митохондрии обладают собственным генетическим аппаратом и способны к делению внутри целой-клетки). Очень интересно то, что пептидную цепочку рГРЧ можно искусственно разделить на 2* части. Одна из этих частей будет оказывать лишь жиросжигающее действие, а другая лишь анаболическое. Очень важным представляется ростовое действие рГРЧ на лимфоидную ткань. Под его влиянием происходит увеличение вилочковой железы и всех лимфатических желез, что сопровождается повышением общего иммунитета.
С усилением белкового синтеза связано и ростовое действие рГРЧ - его способность ускорять рост костей в длину, пока еще не закрылись хрящевые зоны роста; а также рост костей в толщину после того, как зоны роста уже закрыты.
На углеводный обмен рГРЧ может действовать двояко. При введении извне малые и средние дозы рГРЧ увеличивают проницаемость клеток для глюкозы и оказывают инсулиноподобное действие. При этом усиливается синтез белка в поджелудочной железе, возрастает секреция инсулина. Если вводить высокие или сверхвысокие дозы, происходит увеличение содержания сахара в крови, дистрофические изменения в поджелудочной железе и уменьшение секреции инсулина. Большие дозы рГРЧ, таким образом, могут спровоцировать сахарный диабет.
Влияние рГРЧ на жировой обмен неоднозначно. В первые полчаса после введения препарата разрушение подкожно-жировой клетчатки уменьшается, а затем постепенно увеличивается. Разрушение жировой ткани идет одновременно с гипертрофией скелетной мускулатуры. Уровень свободных жирных кислот (СЖК) в крови при- этом возрастает. Под действием рГРЧ улучшаются количественные и качественные показатели крови, что свидетельствует об усилении белково-синтетических процессов в костном мозге.
Влияние на минеральный обмен, происходит за счет задержки фосфора и калия, в результате чего усиливается белковый, синтез и увеличения роста тела в длину [24, 31].
1.2.5. Применение препарата ГРЧ в медицинской практике.
Рекомбинантный гормон роста человека широко применяется в медицинской практике для лечения различного рода заболеваний, связанных с пониженной секрецией данного гормона в организме человека — малорослость, синдром Шерешевского - Тернера, гипофизарный нанизм [31]. По данным научных исследований рГРЧ может применяться при комплексной терапии таких заболеваний, как диабет II типа, гипертония, атеросклероз, сердечно - сосудистая недостаточность, ожирение, и других патологий, которые проявляются в результате снижения уровня ГРЧ в организме человека с возрастом [34].
2. Солюбилизация и ренатурация эукариотических белков, экспрессируемых в Е. coli в виде телец включения.
Введение.
В настоящее время для получения рекомбинантных белков широко используют различные бактерии, дрожжи, грибы и вирусы [35, 36]. До сих пор клонирование различных белков в клетках Е. coli часто используют в биотехнологическом производстве. Одним из частых осложнений при экспрессии эукариотических белков в бактериальных системах является формирование и внутриклеточное накопление неактивных белков в виде нерастворимых агрегатов, так называемых телец включения [37]. Для восстановления биологической активности белка ему необходимо вернуть нативную пространственную структуру, что не всегда является простой задачей [38]. Но, не смотря на это, во многих случаях образование телец включения очень полезно и широко применяется при коммерческом производстве, так как методы выделения белка из телец включения позволяют сделать процесс достаточно удобным и эффективным. Основными преимуществами процесса образования телец включения являются: высокий уровень экспрессии (в некоторых случаях количество целевого белка достигает 30% от общего клеточного белка), простые методы выделения телец включения (так как они отличаются по размерам и плотности от клеточных компонентов), лучшая защищенность белка от протеолиза [39].
Характеристика телец включения.
Тельца включения локализуются в цитоплазме и представляют собой достаточно плотные и стабильные компоненты [40]. Считается, что высокоуровневая экспрессия несложенных и гидрофобных белков в Е. coli (более 2% от общего клеточного белка) приводит к их аккумуляции в тельцах включения [41]. Также белки, имеющие в своей структуре дисульфидные мосты, склонны образовывать агрегаты, так как цитозоль препятствует замыканию мостов.
Размер бактериальных телец включения варьируется от 0,3 до 1,5 мкм. Они обладают аморфной или паракристаллической структурой в зависимости от места локализации [42]. Тельца включения легко выделяются с помощью центрифугирования на высоких оборотах после разрушения клеток, так как имеют более высокую плотность (1.3 мг/мл), чем другие клеточные компоненты. Кроме целевых белков, кодированных плазмидой, тельца включения могут содержать белки наружной мембраны клетки-хозяина, рибосомальные компоненты и РНК/ДНК фрагменты [43]. Содержащиеся белки в тельцах включения очень сильно агрегированы, но легко восстанавливаются и затем могут принять нативную конформацию. Предполагается, что тельца включения являются динамической структурой, которая образована несбалансированным равновесием между агрегированными и растворенными белками [44].
Изучение процесса формирования телец включения показало, что образование телец включения является следствием внутриклеточного накопления частично сложенных экспрессированных белков, которые агрегируют в результате гидрофобных или ионных взаимодействий. Анализ тримера белка фага Р22 сальмонеллы позволил получить информацию об образовании интермедиатов в процессе складывания белка и о природе агрегации белков, приводящей к образованию телец включения в Е.соН [45, 46].
Белки, агрегированные в тельцах включения, могут иметь нативно- подобную структуру [47]. Изучение вторичной структуры {3-лактамазы, выделенной из телец включения Е. соН, показало наличие амидного моста, схожего с таким же мостом у природных белков, что и доказывает существование вторичной структуры у экспрессированных белков из телец включения [48]. Также изучение структуры телец включения с помощью быстрого преобразования Фурье показало, что нерастворимость телец включения связано с наличием неприродного р - слоя, который наблюдается только в белках, осажденных в высокой концентрации соли [49].
Как уже отмечалось, тельца включения имеют более высокую плотность (1.3 мг/мл), чем другие клеточные компоненты, и могут быть легко выделены с помощью центрифугирования после разрушения клеток. Применение центрифугирования в градиенте сахарозы позволяет получить очень чистые тельца включения [50]. Также для очистки телец включения применяют детергенты, мочевину и соль в низких концентрациях. Применяя центрифугирование и различные отмывки, можно добиться чистоты телец включения более 95% [51]. Из полученных телец включения достаточно просто выделить денатурированный белок, подвергнуть его ренатурации и провести дальнейшую хроматографическую очистку. Важно отметить, что получение телец включения в гомогенном состоянии сильно упрощает процесс ренатурации и хроматографической очистки экспрессированных белков [52].
2.3. Фолдинг белков в живой клетке.
Общеизвестно, что полипептидная цепь сворачивается в уникальную третичную структуру согласно коду, заключенному в. аминокислотную последовательность самой полипептидной цепи [53]. При этом важно подчеркнуть, что принципы кодировки нативной пространственной структуры белка принципиально отличаются от принципа кодировки его аминокислотной последовательности (рис. 6). При синтезе белка последовательно, шаг за шагом считывается информация, закодированная в нуклеотидах, и одна за другой собираются в цепь соответствующие аминокислоты, т. е. одномерная информация, заключенная в нуклеотидной последовательности ДНК, трансформируется в одномерную же информацию о последовательности аминокислот первичной структуры белка. При фолдинге белков пошаговый механизм передачи информации явно не работает. В определении контактов, возникающих в третичной структуре, участвуют удаленные друг от друга по цепи аминокислотные остатки. При этом определяющую роль в фолдинге белка играют лишь некоторые (далеко не все) аминокислотные остатки [54].
Мерой стабильности структуры белка является свободная энергия.
Рис. 6. Схема, иллюстрирующая фолдинг белка в процессе биосинтеза. Следует обратить внимание на то, что в процессе транскрипции и трансляции информация, закодированная в одномерной ('Ю) структуре ДНК, используется для построения одномерной первичной структуры белка, а при фолдинге на основании информации, закодированной в одномерной первичной последовательности белка, строится его трехмерная нативная структура [55].
Способность белка самопроизвольно сворачиваться в нативное состояние означает, что этому состоянию белка отвечает минимум свободной энергии. Сворачивание белка в состояние, отвечающее минимуму свободной энергии, происходит за очень короткий промежуток времени, который известен как парадокс «Левинталя», что позволило сделать вывод о том, что в аминокислотной последовательности запрограммирована не только структура нативного белка, но и путь ее достйжения [55].
Фолдинг белков в живой клетке всегда сопряжен с его синтезом. Сходящая с рибосомы цепь сразу начинает сворачиваться, как уже говорилось выше, за счет взаимодействия определенных аминокислотных остатков друг с другом. Например, если это небольшой a-спиральный белок, то сворачивание полипептидной цепи происходит по мере ее роста (контрасляционное сворачивание). Однако существует опасность возникновения неправильных внутримолекулярных контактов [53, 56]. В условиях in vivo эта проблема решается с помощью шаперонов и ферментов, ответственных за цис- трансизомеризацию пролина [57]. В эукариотических клетках синтезируемые рекомбинантные белки всегда имеют нативную третичную структуру и находятся в растворимой форме. При экспрессии эукариотических белков в бактериальных клетках некоторые белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя, так называемые тельца включения вследствие того, что условия, необходимые для поддержания их в растворимой форме, отсутствуют.
Образование телец включения происходит на более поздних этапах складывания белка, когда структура белка находится в состоянии промежуточном между нативным и полностью развернутым. В этом состоянии молекула белка термодинамически стабильна и имеет выраженную или частично выраженную вторичную структуру [40, 48,]. Было также обнаружено, что переход структуры белка в промежуточное состояние всегда сопровождается агрегацией или специфической ассоциацией [55].
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
Г-КСФ влияет на состояние системы кроветворения, образование функционально активных нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. Г-КСФ играет важную роль в регуляции гранулоцитопоэза как в равновесном состоянии, так и в условиях его экстренной активации, например, при инфекции [2]. Уровень Г-КСФ в физиологических условиях, у здоровых людей, низок - менее 30 пг/мл, он может значительно колебаться при различных патологических состояниях, связанных с потребностью в большем количестве нейтрофилов [3].
Ген, контролирующий синтез Г-КСФ, локализован у человека на 17-й хромосоме. Тяжелые нарушения в системе крови могут возникать при повреждении участков генома, ответственных за синтез молекулярных регуляторов гемопоэза, за синтез их рецепторов на колониеобразующих клетках. Так, например, нарушенное воспроизводство Г-КСФ в организме является причиной тяжелой наследственной нейтропении у детей, приводящей к их ранней гибели из-за легкой поражаемостью микробными и вирусными инфекциями [4].
Г-КСФ человека впервые получили из плаценты и опухолевых клеточных линий (клетки эпителиальной карциномы, острой миелоидной лейкемии) [5, 6].
ДНК Г-КСФ была успешно клонирована в бактериальных и животных клетках, что позволило определить его аминокислотную последовательность [7,8]. Природный Г-КСФ не содержит сайтов N-гликозилирования, и единственная О-гликозильная группа присоединена к Thr [9]. Молекула содержит свободную сульфгидрильную группу цистеина в положении Cys и две внутримолекулярные дисулифидные связи в положениях Cys36- Cys42 и Cys64-Cys74[10]. Г-КСФ существует в двух формах: белок типа А состоит из 177 аминокислотных остатков и белок типа В, более активный и представляющий собой основную форму - из 174 аминокислотных остатков (рис. 1). Молекулярная масса последнего составляет 19:6 кДа [И]. Белок в А-форме является минорным продуктом альтернативного сплайсинга мРНК и отличается содержанием вставки из 3 аминокислот (Val-Ser-Glu) между Leu и Cys [12]. Рекомбинантный Г-КСФ человека (рчГ-КСФ), получаемый в клетках E.coli имеет ту же первичную структуру, что и природный Г-КСФ1 типа В, но не гликозилирован и содержит дополнительный N-концевой остаток- метионин [11].
Сравнение биологических и физико-химических свойств природного и рекомбинантного Г-КСФ в различных экспериментальных условиях позволило сделать вывод, что углеводная цепочка не влияет на биологические функции и связывание с рецептором, но существенно повышает физико-химическую стабильность, предотвращая полимеризацию и/или конформационные изменения белка [13,14]. Молекулярный механизм стабилизирующего эффекта гликозилирования, по-видимому, состоит в том, что углеводный остаток уменьшает подвижность в молекуле белка вокруг сайта гликозилирования [15]. Сайт-направленный мутагенез в молекуле Г-КСФ позволил установить, что свободный Cys не существенен для активности белка, в то время как модификация одного или нескольких Cys, формирующих дисульфидные связи, приводит к снижению биологической активности и нарушению вторичной и
Характеристика телец включения
В настоящее время для получения рекомбинантных белков широко используют различные бактерии, дрожжи, грибы и вирусы [35, 36]. До сих пор клонирование различных белков в клетках Е. coli часто используют в биотехнологическом производстве. Одним из частых осложнений при экспрессии эукариотических белков в бактериальных системах является формирование и внутриклеточное накопление неактивных белков в виде нерастворимых агрегатов, так называемых телец включения [37]. Для восстановления биологической активности белка ему необходимо вернуть нативную пространственную структуру, что не всегда является простой задачей [38]. Но, не смотря на это, во многих случаях образование телец включения очень полезно и широко применяется при коммерческом производстве, так как методы выделения белка из телец включения позволяют сделать процесс достаточно удобным и эффективным. Основными преимуществами процесса образования телец включения являются: высокий уровень экспрессии (в некоторых случаях количество целевого белка достигает 30% от общего клеточного белка), простые методы выделения телец включения (так как они отличаются по размерам и плотности от клеточных компонентов), лучшая защищенность белка от протеолиза [39].
Характеристика телец включения.
Тельца включения локализуются в цитоплазме и представляют собой достаточно плотные и стабильные компоненты [40]. Считается, что высокоуровневая экспрессия несложенных и гидрофобных белков в Е. coli (более 2% от общего клеточного белка) приводит к их аккумуляции в тельцах включения [41]. Также белки, имеющие в своей структуре дисульфидные мосты, склонны образовывать агрегаты, так как цитозоль препятствует замыканию мостов.
Размер бактериальных телец включения варьируется от 0,3 до 1,5 мкм. Они обладают аморфной или паракристаллической структурой в зависимости от места локализации [42]. Тельца включения легко выделяются с помощью центрифугирования на высоких оборотах после разрушения клеток, так как имеют более высокую плотность (1.3 мг/мл), чем другие клеточные компоненты. Кроме целевых белков, кодированных плазмидой, тельца включения могут содержать белки наружной мембраны клетки-хозяина, рибосомальные компоненты и РНК/ДНК фрагменты [43]. Содержащиеся белки в тельцах включения очень сильно агрегированы, но легко восстанавливаются и затем могут принять нативную конформацию. Предполагается, что тельца включения являются динамической структурой, которая образована несбалансированным равновесием между агрегированными и растворенными белками [44].
Изучение процесса формирования телец включения показало, что образование телец включения является следствием внутриклеточного накопления частично сложенных экспрессированных белков, которые агрегируют в результате гидрофобных или ионных взаимодействий. Анализ тримера белка фага Р22 сальмонеллы позволил получить информацию об образовании интермедиатов в процессе складывания белка и о природе агрегации белков, приводящей к образованию телец включения в Е.соН [45, 46].
Белки, агрегированные в тельцах включения, могут иметь нативно- подобную структуру [47]. Изучение вторичной структуры {3-лактамазы, выделенной из телец включения Е. соН, показало наличие амидного моста, схожего с таким же мостом у природных белков, что и доказывает существование вторичной структуры у экспрессированных белков из телец включения [48]. Также изучение структуры телец включения с помощью быстрого преобразования Фурье показало, что нерастворимость телец включения связано с наличием неприродного р - слоя, который наблюдается только в белках, осажденных в высокой концентрации соли [49].
Как уже отмечалось, тельца включения имеют более высокую плотность (1.3 мг/мл), чем другие клеточные компоненты, и могут быть легко выделены с помощью центрифугирования после разрушения клеток. Применение центрифугирования в градиенте сахарозы позволяет получить очень чистые тельца включения [50]. Также для очистки телец включения применяют детергенты, мочевину и соль в низких концентрациях. Применяя центрифугирование и различные отмывки, можно добиться чистоты телец включения более 95% [51]. Из полученных телец включения достаточно просто выделить денатурированный белок, подвергнуть его ренатурации и провести дальнейшую хроматографическую очистку. Важно отметить, что получение телец включения в гомогенном состоянии сильно упрощает процесс ренатурации и хроматографической очистки экспрессированных белков [52].
Определяемые примеси и методы контроля
Фармакопея (с др.-греч. срарцакоу— лекарство, яд и др.-греч. тго1т — делаю, изготовляю)— сборник официальных документов (свод стандартов и положений), устанавливающих нормы качества лекарственного сырья—медицинских субстанций, вспомогательных веществ, диагностических и лекарственных средств, и изготовленных из них препаратов.
Положения фармакопеи основаны на достижениях фармацевтической химии и фармацевтического анализа, его критериев, способов и методов. Этот документ включает указания по изготовлению, проверке качества лекарств. Определяет высшие дозы препаратов и устанавливает требования к лекарственному сырью. Выполнение изложенных норм и требований Фармакопеи в сочетании с исполнением требований стандарта ОМР обеспечивает надлежащее качество лекарственных субстанций и препаратов [76].
Современная фармацевтическая промышленность предъявляет высокие требования к параметрам качества лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков [77]. Требования к качеству и методам анализа при производстве генно-инженерных препаратов изложены в Европейской фармакопее 6.0, 6 издание, статьи 1045-1049 [78].
Различия в продуцировании между эукариотическими и прокариотическими клетками хозяина имеют большое значение и которые выражаются в различных требованиях к процессам валидации, очистки и аналитической методологии [7]. Бактериальные клетки хозяина (прокариоты) отличаются от клеток эукариот (дрожжей, клеток животных) тем, что они. синтезируют рекомбинантные белки в более высокой концентрации и требуют присутствия относительно простых компонентов среды, чем эукариоты, но при этом продукты экспрессии требуют дополнительной стадии-ренатурации для восстановления нативной структуры. Другие затруднения при биосинтезе рекомбинантных белков, например, в клетках Е. coli заключаются в присутствии N-концевого метионина, который необходимо удалить, а также в освобождении от протеаз и эндотоксинов. Критическими стадиями при выделении белков и пептидов являются: выделение гена, кодирующего белок или пептид, выбор вектора, получение плазмиды с рДНК, очистка препарата. В процессе проведения этих стадий могут возникать модификации аминокислот (или мутации) в последовательности белка, олигомеризация и деградация молекулы [2].
Рекомбинантные препараты не должны содержать ДНК, белков клеток продуцента и эндотоксинов. Наличие подобных «родственных» примесей, также как следовых количеств ДНК и белков E.coli в активной фармацевтической субстанции (АФС) или в готовой лекарственной форме (ГЛФ) может вызывать нежелательные побочные реакции у пациентов [79-82].
Для определения примесей в рекомбинантных продуктах в фармакопее США описаны общие методы контроля чистоты. Это определение эндотоксинов ЛАЛ-тестом, белков клеток хозяина методами иммуноанализа, определение примеси ДНК штамма продуцента (остаточной ДНК) методами гибридизации, УФ-спектрофотомерии и ПЦР, родственных примесей (дезамидирование, окисление метионинов, наличие N-концевого метионина) и мутаций методами пептидного картирования, ВЭЖХ, MC, наличия протеолитического разрушения и агрегации методами ЭФ и эксклюзивной хроматографии.
Примесь ДНК штамма-продуцента является возможной специфической примесью, и она уникальна для каждого рекомбинантного продукта, так как зависит от организма хозяина и процесса технологического производства. Современные методы очистки позволяют снизить содержание примеси ДНК до пико-граммовых количеств, т.е. в 105-108 раз меньше количества ДНК,
способного трансформировать клетки [83]. Техника метода гибридизации с радиоактивной меткой — наиболее чувствительный метод, который доступен для рутинного определения примеси ДНК в рекомбинантном белке. Кроме того, используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением амплификации; перспективен метод биосенсороной технологии [77]. При высокой концентрации ДНК более 500 нг/мл определение можно проводить с помощью УФ - спектроскопии при длине волны 260 нм.
