Введение к работе
Актуальность исследования: Нейротрофины - семейство факторов роста, играющих важную роль в регуляции развития и функционирования центральной и периферической нервной системы. На сегодняшний день для человека описано четыре представителя данного семейства - фактор роста нервов NGF, нейротрофический фактор головного мозга BDNF, а также нейротрофические факторы NT-3 и NT-4/5. При этом наиболее значимыми для развития нервной системы являются первые три нейротрофических фактора, что делает их важными объектами различных биомедицинских исследований.
Нейротрофины синтезируются в клетках в виде предшественников -препронейротрофинов, имеющих в своем составе сигнальный пептид, N-концевую пропоследовательность и, собственно, зрелую часть, которая, как полагали долгое время, и обладает всеми биологическими свойствами, описанными для данных факторов роста. Роль пропептида не установлена и активно исследуется во многих лабораториях. Есть основания полагать, что про-часть нейротрофинов может служить внутримолекулярным шапероном и определять фолдинг молекулы нейротрофина.
Недавно было показано, что клетками секретируются не только зрелые, процессированные, нейротрофины, но и их предшественники - пронейротрофины. При этом пронейротрофины, как было показано, обладают биологической активностью. Известно, что в некоторых случаях проформы нейротрофинов могут запускать механизм клеточной смерти. Таким образом, пронейротрофины и зрелые белки способны оказывать противоположные эффекты на клетки, а процессинг, в таком случае, может служить своего рода механизмом регуляции функциональной активности нейротрофических факторов.
Имеющаяся на данный момент совокупность данных свидетельствует о том, что изучение предшественников нейротрофинов необходимо для понимания механизмов функционирования нервной системы человека в норме и при патологии и является важным направлением в современных биологических науках.
Цели исследования: Целью данной работы являлось изучение вовлеченности пропоследовательностей в формирование биологически активных молекул нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.
Научная новизна: Впервые проведено комплексное сравнительное исследование фолдинга нейротрофических факторов человека с использованием предшественников нейротрофинов NGF и BDNF, их индивидуальных зрелых форм и пропоследовательностей. При этом в данной работе впервые осуществлен фолдинг зрелого NGF в присутствии несвязанного ковалентной связью природного пропептида (фолдинг в системе in trans). Показано, что природный пропептид способен существенно повышать эффективность
образования биологически активного NGF, причем наличие ковалентной связи между зрелым белком и пропептидом не является необходимым. Таким образом, в данной работе получены доказательства про-зависимого фолдинга нейротрофина NGF. Впервые осуществлен фолдинг нейротрофина NGF в присутствии не связанной ковалентной связью чужеродной пропоследовательности (пропептида BDNF) и показано, что пропептид BDNF способен направлять фолдинг зрелого NGF. Впервые показано, что пропептид BDNF не оказывает существенного влияния на образование биологически активного нейротрофина BDNF и, по-видимому, фолдинг данного нейротрофина не является про-зависимым. Показано, что индивидуальные пропоследовательности нейротрофинов NGF и BDNF в растворе образуют стабильную димерную форму. Также показано отсутствие дифференцирующего и пролиферативного действия пропептидов на культуры клеток феохромоцитомы крысы PC 12 и эритролейкемии человека TF-1.
Практическая значимость: Получение новых данных о механизмах фолдинга нейротрофических факторов открывает большие перспективы в конструировании нейротрофинов с модифицированными свойствами, в том числе на базе одной аминокислотной последовательности. Это может помочь в исследовании взаимодействия нейротрофических факторов с тирозинкиназными рецепторами (TrkA, Trkfi и TrkC), рецептором р75 и сортилином. Препаративное получение очищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF (предшественников, индивидуальных зрелых нейротрофинов и индивидуальных пропептидов), отработанное в данной работе, позволит использовать данные белки при разработке и создании тест-систем для детектирования пронейротрофинов, нейротрофинов и, вероятно, пропептидов в различных биологических жидкостях (крови, спинномозговой жидкости и т.д.), что может быть широко использовано в диагностике и исследовании целого ряда нейродегенеративных заболеваний. Положения, выносимые на защиту:
Конструирование рекомбинантных продуцентов различных форм нейротрофических факторов NGF и BDNF человека, а именно, их предшественников, пропептидов и зрелых частей.
Получение высокоочищенных вариантов нейротрофических факторов NGF и BDNF человека.
Разработка системы анализа эффективности фолдинга различных форм нейротрофинов.
Анализ биологической активности полученных нейротрофических факторов.
Исследование наличия шапероноподобной функции пропептидов при фолдинге нейротрофинов NGF и BDNF.
Исследование влияния пропептида на биологическую активность сформировавшегося
зрелого нейротрофина NGF.
Исследование собственной биологической активности индивидуальных пропептидов.
Публикации и апробация работы: По результатам диссертационной работы
опубликована одна статья в рецензируемом научном журнале. Результаты исследования
были доложены на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), III
российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 11 и 12 Пущинских школах-
конференциях молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007, 2008), IV съезде
Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008),
конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования
адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), международном
конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2009),
международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных
«Ломоносов-2009» (Москва, 2009), IV и V международных междисциплинарных конгрессах
«Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008, 2009), IV российском симпозиуме
«Белки и пептиды» (Казань, 2009), а также на семинаре Лаборатории белковой инженерии
ИМГ РАН и на заседании кафедры Биотехнологии и бионанотехнологии Московской
государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, списка сокращений,
обзора литературы, посвященного функциональным особенностям нейротрофических
факторов, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка
цитируемой литературы (225 ссылок). Диссертация изложена на 162 страницах и содержит
59 рисунков, 20 таблиц.
Выполнение работы проводилось в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (2009), программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (2009) и при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№№ грантов 06-04-48678-а, 06-04-48690-а, 09-04-00734-а, 09-04-00870-а).
