Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов Бондарь Владимир Станиславович

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Бондарь Владимир Станиславович. Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов : дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.23 Красноярск, 2006 259 с. РГБ ОД, 71:07-3/149

Введение к работе

Актуальность темы. В последнее время активизировались исследования, направленные на разработку и создание новых технологий выделения и очистки биомолекул. Во многом, этому способствовали успехи, достигнутые за последние 10-15 лет, в молекулярной биологии и генной инженерии. Развитие рекомбинантных технологий привело к тому, что в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка (Ferguson, Goodrich, 2001). Стало возможным получение не только аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов (Kidokoro, 1998). Создание штаммов-продуцентов позволило решить проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для наработки больших количеств изучаемых белков (Глик, Пастернак, 2002). Решение этих вопросов с одной стороны открыло новые возможности получения множества белков в препаративных количествах, с другой - способствовало возникновению и развитию новой ветви молекулярной биологии - протеомики.

В связи с изложенным, разработка и создание новых (адекватных разнообразию решаемых задач) высокоэффективных технологий получения чистых белков приобретает большую актуальность и значимость. Основные усилия направлены на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белковых молекул (Галаев, 1999). Технологии, позволяющие решать такие задачи быстро и с минимальными затратами, не только позволят расширить арсенал известных методов белковой химии. Быстрое получение больших количеств чистых белков будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - расширению спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии (Jackson et al., 1996).

Дель и задачи исследования. Основная цель данной работы формулируется как «Создание новых высокоэффективных технологий разделения и очистки белков, основанных на лигандном обмене и применении частиц детонационных наноалмазов».

Указанная цель достигается выполнением следующих задач:

Обосновать и сформулировать общие принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основываясь на обнаруженном эффекте преципитации белковых молекул в растворе под действием ионов двухвалентных металлов с использованием данных о физико-химических свойствах двухвалентных ионов в растворе.
Провести экспериментальную оценку возможности практического использования метода ЛОРБ в модельных экспериментах по разделению смеси коммерческих белковых препаратов.
Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из биомассы бактериальных клеток Е. coli различных рекомбинантных светоизлу-чающих белков: Са²⁺-активируемых фотопротеинов (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков) и люциферазы морских светящихся бактерий.
Основываясь на результатах исследований очистки белков технологией ЛОРБ, предложить общую схему их выделения данным методом.

5. Обосновать возможность применения детонационных наноалмазов
(НА) для разделения и очистки белковых молекул, основываясь на данных о
физико-химических свойствах частиц, и провести экспериментальную проверку
адсорбционных свойств данного материала на модельных белках.

Показать возможность применения частиц НА для экспресс выделения и очистки из сложных белковых смесей: а), биолюминесцентных белков (апообелин, люцифераза) из рекомбинантных штаммов-продуцентов Е. coli, б), ферментов из природных источников (глутатионредуктаза из печени быка, ли-зоцим из куриного яйца).
Исследовать возможные механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц НА, исходя из экспериментальных данных.
Провести проверку возможности создания индикаторных систем, основным элементом которых являются частицы НА, несущие на своей поверхности маркерные люминесцентные белки (обелин, люциферазу).

9. Показать применимость частиц НА как сорбента для колоночной хро-матонграфии обычного давления.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта позволило теоретически обосновать, разработать и предложить новую высокоэффективную технологию разделения и очистки белков, которая пополняет арсенал известных методов, применяемых в биохимии для сепарации белковых молекул, и позволяет без использования хроматографиче-ского оборудования и сорбентов получать высокоочищенные и гомогенные белковые препараты при минимальных временных затратах. Полученные новые знания дополняют и расширяют представления о координационных и лигандо-обменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет общебиологическое значение.

Анализ имеющихся данных о физико-химических свойствах частиц детонационных НА и проведенные исследования позволили обосновать, сформулировать и развить новое научное направление по изучению механизмов взаимодействия частиц НА с белковыми молекулами. Полученные новые знания не только расширяют представления о свойствах этого материала, традиционно используемого в физических, физико-химических исследованиях и технических приложениях, но и открывают новую возможность его изучения и использования в различных областях биологии. Открываются перспективы применения НА в качестве сорбента при разработке новых высокоэффективных технологий выделения и очистки белков и создании сенсорных систем. Исходя из результатов исследований механизмов взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц НА, делается вывод о возможности их применения как универсального сорбента, позволяющего проводить разные типы хроматографии.

Практическая значимость работы.

С помощью метода ЛОРБ разработаны экпресс-технологии выделения и очистки мономерных и полимерных рекомбинантных светоизлучающих белков

(Са²⁺-активируемые фотопротеины апообелин, апоакворин и их мутанты, а также люцифераза морских светящихся бактерий) из биомассы штаммов-продуцентов Е. coli.

Предложенная принципиальная схема выделения белков технологией ЛОРБ позволяет выбрать стратегию поиска оптимальных вариантов применения данного метода для выделения искомого белка с сохранением его структурно-функциональной организации и свойств.

На основе применения частиц детонационных НА разработаны экспресс-технологии выделения рекомбинантных белков (апообелин, люцифераза) из штаммов-продуцентов Е. coli и ферментов (лизоцим, глутатионредуктаза) из природных источников (куриное яйцо, печень быка).

На твердой подложке получены прототипы люминесцентных сенсорных систем (биочипов), основным элементом которых являются частицы НА, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза), и показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

Основные положения, выносимые на защиту:

Новая высокоэффективная технология разделения и очистки белковых молекул, получившая название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ) и позволяющая исключить из процесса выделения искомого белка оборудование для колоночной хроматографии и сорбенты, что значительно упрощает сам процесс и минимизирует временные затраты на его проведение. Технология основывается на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием ионов двухвалентных металлов за счет образования нерастворимых координационных (хелатных, межмолекулярных) комплексов металл-белок.
Разработанные на основе метода ЛОРБ схемы экспресс-очистки рекомбинантных мономерных белков фотопротеинов (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков) и рекомбинантного гетеродимерного белка лю-циферазы из биомассы штаммов-продуцентов бактериальных клеток Е. coli, по-

зволяющие за 1,5-3 часа получать препараты данных белков в высокоочищен-ном и гомогенном состоянии с выходом 35-45 % и 50-60 % соответственно.

Обобщающая схема применения технологии ЛОРБ для выделения и очистки белков, основанная на анализе полученных экспериментальных данных и позволяющая определить оптимальные варианты использования данного метода с учетом индивидуальных свойств выделяемого белка (белков).
Разработанные на основе применения частиц НА высокоэффективные технологии выделения и очистки рекомбинантных светоизлучающих белков (апообелин, люцифераза) из биомассы бактериальных клеток Е. coli и ферментов из природных источников (лизоцим из куриного яйца и глутатионредуктаза из печени быка). Данные технологии являются экспрессными и позволяют при наличии исходных экстрактов за 30-60 минут получать указанные белки в вы-сокоочищенном и гомогенном состоянии с выходом от 35 до 60% без применения специализированного хроматографического оборудования.

Обоснование возможности применения частиц детонационных НА, как нового универсального материала, для сепарации белковых молекул, позволяющего проводить на нем разные типы хроматографического разделения. Выводы делаются на основании экспериментальных данных выделения и очистки с помощью НА белков, принадлежащих к разным классам ферментов, и анализа возможных механизмов связывания их с поверхностью частиц.
Решение физической проблемы, связанной с невозможностью применения НА, как частиц крайне малого размера (4-6 нм), в качестве сорбента для колоночной хроматографии обычного давления. Полученный на основе только частиц НА новый материал, может использоваться как сорбент в колоночной хроматографии обычного давления, что подтверждается экспериментами по адсорбции-десорбции на данном носителе маркерного белка (цитохром С).

Апробация работы и публикации.

Материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены на: V Всесоюзном симпозиуме «Химия и физика белков и пептидов» (Баку, 1980); I Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография» (Вильнюс,

1982); III Всесоюзной межуниверситетской конференции «Физико-химическая биология» (Тбилиси, 1982); III Всесоюзном симпозиуме «Молекулярная жидкостная хроматография» (Рига, 1984); V Всесоюзном симпозиуме «Инженерная эшимология» (Кобулети, 1985); 14^th International Congress of Biochemistry (Prague, 1988, Czechoslovakia); First International School on Biological Luminescence (Wroclaw, 1989, Poland); VII Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимоло-гия» (Москва, 1991); 7^th - 11^th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Banff, Alberta, 1993, Canada; Cambridge, 1994, England; Woods Hole, 1996, USA; Bologna, 1998, Italy; Cambridge, 2001, England); Bioluminescence Symposium (Westin Maui, Hawaii, 1993, USA); III Всероссийской конференции по направлению «Генная и клеточная инженерия» (Москва, 1993); 31^st European Marine Biology Symposium (St. Petersburg, 1996, Russia); II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000); 3-й Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нано-технологии» (С.-Петербург, 2001); 12^th International Symposium «Thin Films in Electronics» (Kharkov, 2001, Ukraine); HIGH-TECH-2001 (Krasnoyarsk, 2001, Russia); I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); VI Всероссийской конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Томск, 2002); I Международном симпозиуме «Детонационные наноалмазы: получение, свойства и применение» (С.-Петербург, 2003); Всероссийской научно-технической конференции «Ультрадисперсные порошки, наноструктуры, материалы: получение, свойства, применение (Красноярск, 2003); International Conference on Biophotons and Biophotonics (Beijing, 2003, China); NATO advanced research workshop «Synthesis, properties and applications of ultrananocrystalline diamond» (St. Petersburg, 2004); The 9* International Conference on New Diamonds Science and Technology ICNDST-9 (Tokyo, 2004, Japan); NATO advanced research workshop «Innovative superhard materials and sustainable coating» (Kyiv, 2004, Ukraine); The XII Symposium of the

Russia-Japan Medical Exchange (Krasnoyarsk, 2005, Russia); The 6^th Pacific Rim Conference on Ceramic and Glass Technology (Kapalua, Maui Hawaii, 2005, USA); The rV-th Moscow International Conference «Theory and Practice of Technologies of Manufacturing Composite Materials and New Metal Alloys Products» (TMCMM) (Moscow, 2005, Russia).

По материалам диссертации опубликовано 49 работ.

Проекты и гранты, в которых автор принимал участие.

Отечественные гранты: Российский Фонд Фундаментальных Исследований (№93-04-21308, №96-04-48489, №99-04-48452); Красноярский Краевой Фонд Науки (№ 9F37, № 10F026C, 1F0099, 5F0029).

Международные проекты: INTAS № 97-1754; Bayer AG (Germany); Federal Ministry of Investigation and Technology (Germany) and the Russian Ministry of Science and Technology (Russia); Department of Trade and Industry (DTI, UK); National Institutes of Health (NIH, USA) (HL12186); National Institutes of Health (NIH, USA) (TW00412); Grant NA76RG0119, Project R/B-32 from the National Oceanic and Atmospheric Administration to Washington Sea Grant Program, University of Washington (USA); EC grant ERB IC15-CT96-0103 (The Netherlands); EU contract CHGE-CT94-0061 (The Netherlands); NWO Grant 047.007.021 for Dutch-Russian research cooperation (The Netherlands).

Личный вклад автора.

Автор принимал личное участие в планировании и проведении основного комплекса исследований, результаты которых представлены в диссертационной работе. Им обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. При его основном участии проводились эксперименты по изучению механизмов адсорбции-десорбции белковых молекул на поверхности частиц детонационных НА. С его непосредственным участием проводилось теоретическое обоснование и формулирование основных положений новых технологий выделения и

очистки белков посредством лигандообменных взаимодействий и применения НА. Им лично, или под его непосредственным научным и техническим руководством разрабатывались технологии выделения рекомбинантных светоизлу-чающих белков и белков из природных источников с помощью ионов металлов и частиц НА. Автор принимал личное участие в обработке, систематизации, анализе и интерпретации полученных результатов.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и списка литературы, изложенных на 259 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 261 источник, из них 176 зарубежных. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ