Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 . Магнитотаксис и магнитотактические бактерии 8
1.1 Морфология и филогенетическое разнообразие магнитотактических бактерий 8
ГЛАВА 2. Магнетосомы 12
2.1 Разнообразие и характеристика кристаллов магнетосом 12
2.2. Мембрана магнетосом 13
2.3 Белки мембраны магнетосом 15
ГЛАВА 3. Биоминерализация магнетосом 20
3.1 Геномная организация магнетосомальных генов 20
3.2. Биосинтез магнетосом 25
ГЛАВА 4. Практическое примение магнетосом экпериментальная часть 34
ГЛАВА 5. Материалы и методы 34
5.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 34
5.2 Культивирование бактерий 34
5.3 Выделение и очистка магнетосом 35
5.4 Выделение ДНК 36
5.5 Выделение высокомолекулярной ДНК 37
5.6. Получение генетических конструкций методом ПЦР 37
5.7. Детектирование продуктов ПЦР 39
5.8. Очистка ПЦР-фрагментов 39
5.9. Рестрикция ДНК 40
5.10. Лигирование ДНК 40
5.11 Фосфорилирование ДНК 40
5.12 Выделение плазмидной ДНК 40
5.13. Секвенирование ДНК 41
5.14 Приготовление химически компетентных клеток 41
5.15. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 41
5.16. Экспрессия белка методом автоиндукции 42
5.17 Анализ суммарного белка клеток E. coli BL21(DE3) 42
5.18 Вестерн-блот анализ 43
5.19. Фракционирование растворимых клеточных белков E. coli 43
5.20. Очистка гибридных белков 44
5.21. Иммуноферментный анализ 45
5.22. Определение IgG-связывающей способности модифицированных магнетосом 46
5.23. Оптимизация интеграции гибридных белков в мембрану магнетосом 46
5.24. Световая и просвечивающая электронная микроскопия 47
5.25. Атомно-силовая микроскопия 47
5.26. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей 48
5.27. Секвенирование и аннотирование генома Magnetospirillum sp. SO-1 48
5.28. Реконструкция магнетосомального геномного острова Magnetospirillum sp.
SO-1 48
Результаты и их обсуждение 60
ГЛАВА 6. Описание объекта исследований 60
6.1. Морфологические и физиологические особенности магнитотактической бактерии Magnetospirillum sp. SO-1 60
6.2. Секвенирование и анализ генома Magnetospirillum sp. SO-1 61
6.3. Сборка и аннотирование магнетосомального геномного острова Magnetospirillum sp. SO-1 64
6.4. Сравнительный анализ магнетосомальных геномных островов представителей рода Magnetospirillum 69
ГЛАВА 7. Получение магнетосом с иммобилизованными на поверхности антителами 71
7.1. Получения магнетосом с целостной мембраной 71
7.2. Проектирование и сборка генетических конструкций 72
7.2.1. Получение генетической конструкции mb 73
7.2.2. Получение генетической конструкции mbb 77
7.2.3. Получение генетической конструкции mzz 80
7.2.4. Получение генетической конструкции mistbb 83
7.3. Получение гибридных иммуноглобулинсвязывающих белков 84
7.3.1. Экспрессия pET23a(+)/mb, pET23a(+)/mbb, pET23a(+)/mzz и pET23a(+)/mistbb 84
7.3.2. Фракционирование белков 86
7.3.3. Очистка гибридных белков 87
7.4. Исследование функциональной активности модифицированных белков 88
7.5. Встраивание гибридных белков в мембрану магнетосом 91
7.6. Анализ результатов МАПО при интеграции гибридных белков Mbb и Mistbb
94
7.7. Исследование модифицированных магнетосом с использованием атомно-силовой микроскопии 100
7.8. Определение стабильности модифицированных магнетосом 102
Заключение 104
Выводы 105
Благодарности 106
Список литературы
- Разнообразие и характеристика кристаллов магнетосом
- Выделение высокомолекулярной ДНК
- Определение IgG-связывающей способности модифицированных магнетосом
- Получение генетической конструкции mzz
Разнообразие и характеристика кристаллов магнетосом
Магнитотактические бактерии являются водными прокариотами, разнообразными по морфологии, физиологии и филогении. Наибольшее количество МТБ (105-106/мл) обитает в зоне перехода от кислородных к бескислородным условиям, что совпадает с границей ил-вода [26]. В морской среде МТБ, в основном, проживают в прибрежной зоне, хотя некоторые исследования указывают на их распространение в океане на глубине до 3000 м [136; 168]. По форме клеток различают палочки, вибрионы, спириллы, кокки и овоидные бактерии, а также многоклеточные магнитотактические бактерии. Большинство известных МТБ передвигаются при помощи жгутиков и имеют клеточную стенку, структура которых характерна для грамотрицательных бактерий, исключением являются некультивируемые пресноводные бактерии, относящиеся к филе Nitrospirae и имеющие более сложное строение клеточной стенки [70; 90]. Расположение жгутиков у различных групп МТБ отличается и может быть полярным, биполярным или пучками.
Количество культивируемых видов МТБ очень мало, но их разнообразие может быт изучено методами молекулярной экологии без предварительного культивирования. На основе данных сходства последовательности 16S рРНК МТБ является полифилетической группой, но все известные МТБ принадлежат царству Bacteria [93]. Большинство культивируемых и некультивируемых МТБ относятся к классам Alpha-, Gamma- и Deltaproteobacteria филы Proteobacteria. Несколько видов некультьтивируемых МТБ относятся к филе Nitrospirae и штамм SKK-01, относящийся к candidate division OP3 [79] (Рисунок 1).
Используя метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), было показало, что представители класса Alphaproteobacteria доминируют среди МТБ в пресноводных и морских микробных сообществ [164; 165; 166]. В настоящее время, наиболее изученными МТБ данного класса являются представители рода Magnetospirillum: M. magnetotacticum MS-1 [25], M. magneticum AMB-1[75], M. gryphiswaldense MSR-1 [155]. Стоит отметить, что род Magnetospirillum также включает бактерий, сходных с магнитотактическими по морфологии и филогении, но не способных к образованию магнетосом - M. bellicus [179] и M. aberrantis [57]. Другие культивируемые представители класса Alphaproteobacteria: морские вибрионы Magnetovibrio blakemorei MV-1 [19], морские спириллы Magnetospira thiophila MMS-1 [187] и морские кокки Magnetococcus marinus MC-1 [18]. Для всех магнитотактических представителей класса Alphaproteobacteria характерен синтез магнетит-содержащих магнетосом. Рисунок 1. Филогенетическое дерево магнитотактических бактерий, построенное на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК [97]. Информации о степени разнообразия магнитотактических бактерии в классе Gammaproteobacteria очень мало. На сегодняшний день, описаны лишь два штамма МТБ, относящихся к классу Gammaproteobacteria - BW-2 и SS-5 [92]. Оба штамма мезофильные, микроаэрофильные палочки, способные к биоминерализации магнетита. BW-2 и SS-5 филогенетически далекие организмы: BW-2 принадлежит к порядку Thiotrichales, тогда как СС-5 относится к порядку Chromatiales.
Внутри класса Deltaproteobacteria описаны мезофильные магнетит- и грейгит-продуцирующие МТБ, среди которых: различные формы некультивируемых многоклеточных магнитотактических прокариот (ММП) [2; 34; 76; 162]; группа некультивируемых и две культивируемых (Candidatus Desulfamplus magnetomortis BW-1 и штамм SS-2) больших, палочковидных МТБ [91]; сульфатредуцирующая палочковидная Desulfovibrio magneticus RS-1 [150].
МТБ, относящихся к филе Nitrospirae, в чистые культуры не выделено. Тем не менее, четыре различных некультивируемых бактерии, филогенетически связанные с этой филой, были довольно подробно описаны. Большая палочка Candidatus Magnetobacterium bavaricum является наиболее изученной и была впервые обнаружена в пробах из озер Кимзее и Аммерзее, расположенных на юге Германии [137; 186]. Другой чувствительный к магнитному полю Nitrospirae, является небольшая палочковидная бактерия MHB-1 [47]. Недавно Лефевр с соавторами описали два новых представителя МТБ внутри Nitrospirae: найденный в солоноватых горячих источниках, умеренно термофильный вид Candidatus Thermomagnetovibrio paiutensis HSMV-1, а также большой, овоидной формы Candidatus Magnetoovum mohavensis LO-1 [88; 90].
До недавнего времени все известные МТБ принадлежали к филам Proteobacteria и Nitrospirae, но недавно был выявлен штамм SKK-01, относящийся к candidate division OP3 [79]. Клетки штамма SKK-01 большие, овоидной формы с крупными включениями серы. Это открытие указывает на то, что разнообразие МТБ недооценено и можно ожидать открытия МТБ и в других филогенетических группах. ГЛАВА 2. МАГНЕТОСОМЫ 2.1 Разнообразие и характеристика кристаллов магнетосом
Магнетосомы представляют собой кристаллы магнетита или грейгита, окруженные липопротеиновой мембраной. Синтез бактериальных магнетосом контролируется генетически. Вследствие этого, магнитные кристаллы имеют стандартные размеры и формы, и строго упорядоченные цепочки магнетосом служат эффективным сенсором магнитного поля. Частицы, как правило, расположены вдоль оси клетки и собраны в одну или несколько цепей и имеют размер от 35 до 120 нм [49]. Частицы магнетита и грейгита в этом диапазоне размеров имеют однодоменную магнитную структуру с постоянным магнитным полем [29; 117; 147]. Более мелкие частицы при температуре окружающей среды суперпарамагнитны и не имеют стабильной остаточной намагниченности. Более крупные частицы имеют тенденцию к образованию нескольких доменов, что приводит к снижению остаточной намагниченности. Впрочем, в некоторых некультивируемых кокках из южного полушария были выявлены магнетосомы имеющие размеры, значительно превышающие характерные для монодоменных магнитных кристаллов параметры [45; 94; 115; 166]. Тем не менее, даже эти крупные кристаллы ведут себя, как магнитные монодоменные кристаллы, когда они в клетке организованы в цепочку [115]. Морфология, размеры и внутриклеточная организация кристаллов магнетосом являются видоспецифичными [13]. По морфологии кристаллы магнетосом различают кубооктаэдрические [9; 100], в виде удлиненных и гексогональных призм [15; 100] и в форме пули [91; 139] (Рисунок 2).
Выделение высокомолекулярной ДНК
Способность связывания модифицированных белков с антителами определяли с помощью твердофазного ИФА. В лунках сорбировали 1 мг инсулина человека в течение ночи при +4оС. Остаточную сорбцию блокировали 1.5%-ным раствором БСА в Твин-фосфатном буфере (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8 мМ KH2PO4, 0.01%-ный NaN3, 0.05%-ный Твин 20) в течение часа. Далее добавляли 0.1 мкг моноклональных антител мыши против инсулина человека (Имтек, Россия) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки отмывали 4 раза Твин-фосфатным буфером, после чего наносили с заданными разведениями гибридные белки и инкубировали в течение 1 ч. После аналогичной отмывки в течение 1 ч инкубировали 0.1 мкг антител мыши против гистидинового тага (Имтек, Россия); система детекции - пероксид водорода/пероксидаза хрена, хромогенный субстрат 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидин (Sigma-Aldrich, США). В качестве отрицательного контроля использовали полипептид, несущий гистидиновый таг на С-конце.
Специфичность взаимодействия определяли путем вычисления константы диссоциации комплекса гибридного белка с антителом, согласно [96]. В условиях данного эксперимента в каждую лунку наносили по 1 мкг гибридного белка. После блокирования поверхности лунки, добавляли антитела кролика к Fc-фрагменту иммуноглобулина G мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в заданных разведениях. 5.22. Определение IgG-связывающей способности модифицированных магнетосом
Способность модифицированных магнетосом связывать IgG определяли с помощью магнитного ИФА. 10 мкг магнетосом с интегрированными в мембрану иммуноглобулинсвязывающими белками Mbb и Mistbb инкубировали со 100 мкл антител кролика класса G меченых пероксидазой хрена (100 мкг/мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем магнетосомы были отделены на магнитном стенде (Promega, США) и промывали 5 раз 100 мкл Твин-фосфатным буфером (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8 мМ KH2PO4, 0.01%-ный NaN3, 0.05%-ный Твин 20). Промытые магнетосомы инкубировали с 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидином (Sigma-Aldrich, США) в течение 1 мин, реакцию прекращали путем 50 мкл 1 М раствора HCl. Эксперименты проводили по крайней мере в трех повторностях.
С целью оптимизации встраивания гибридных белков мембрану магнетосом был выбран метод анализа поверхности отклика (МАПО). МАПО является эффективным экспериментальным инструментом для определения оптимальных условий для многофакторных систем. В серии пилотных экспериментов были определены факторы, влияющие на встраивание гибридных белков в мембрану магнетосом: pH, концентрация NaCl и способ интеграции (интенсивное перемешивание или озвучивание). МАПО с применением плана Бокса-Бенкена (ПББ) была использована для определения оптимальных уровней из трех выбранных переменных для каждого гибридного белка. Уровень встраивания гибридных белков при выбранных условиях определяли, основываясь на данных магнитного ИФА. Во всех экспериментах были использованы 10 мкг магнетосом и 50 мкг каждого гибридного белка, общий объем реакционной смеси 1 мл. Анализ полученных данных проводили с помощью программы Minitab 15.0. Графические изображения регрессионных моделей и соответствующие контурные графики были получены с использованием программного обеспечения Design-Expert (версия 9.0.1.0, Stat-Ease Inc, США).
Световая и просвечивающая электронная микроскопия
Морфологию клеток исследовали под световым микроскопом Olympus BX-41 и под просвечивающим электронным A JEM 100CXII с ускоряющим напряжением 80 кв. Тотальные препараты клеток для электронной микроскопии готовили без контрастирования. Способность к магнитотаксису определяли под световым микроскопом, наблюдая изменение направления движения бактерий в зависимости от направления оси магнита, расположенного на предметном столике микроскопа.
Атомно-силовая микроскопия Визуализация и определение размеров магнетосом проводили с использованием атомно-силового микроскопа NTEGRA Prima (NT-MDT, Россия. Для сканирования был выбран полуконтактный режим с использованием зондов NSG01 (резонансная частота 87-230 кГц, К=1,45-15,1 Н/м), скорость сканирования 1 Гц. 10 мкл образца инкубировали на слюдяной подложке в течение 1 мин, после чего промывали водой milliQ и подложку высушивали на воздухе. Полученные препараты были просмотрены немедленно после сушки при комнатной температуре и влажности окружающей среды без дополнительной очистки. 5.26. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей
Cравнительный анализ полученных последовательностей с аналогичными последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Построение филогенетических деревьев проводили с использованием алгоритмов, реализованных в MEGA 5 [173]. Секвенирование и аннотирование генома Magnetospirillum sp. SO-1 Секвенирование проводили методом пиросеквенирования на приборе 454 FLX (Roche) согласно рекомендациям производителя. Сборку полученных последовательностей проводили с помощью пакета программ Phred/Phrap/Consed [11; 56]. Поиск и аннотацию открытых рамок считывания проводили с помощью программы Glimmer [33]. Последовательности фрагментов генома (контигов) были аннотированы с использованием сервиса Prokaryotic Genomes Automatic Annotation Pipeline (PGAAP) [142] и депонированы в DDBJ/EMBL/GenBank под номером AONQ00000000.
Определение IgG-связывающей способности модифицированных магнетосом
С целью получения максимального выхода белка в растворимой форме проводили оптимизацию температуры выращивания бактерий (37, 28 или 13С). Гибридные белки Mb, Mbb, Mzz и Mistbb при температуре клеточного роста 37С накапливались преимущественно в тельцах включения. При температуре культивирования 28С или 13С гибридные белки были локализованы в мембранной фракции белков штамма-продуцента. Так как рост бактерий происходил значительно быстрее при 28С, эта температура была выбрана в качестве оптимальной для экспрессии запланированных генетических конструкций.
С помощью вестерн-блот-анализа (Рисунок 26) с окрашиванием антителами против гистидинового тага, было показано, что произошла экспрессия целевых генетических конструкций.
Для определения локализации целевого белка в клетке было проведено фракционирование клеточного лизата штамма-продуцента. Были исследованы фракции растворимых, нерастворимых и мембранных белков (Рисунок 27). Было обнаружено, что при температуре культивирования до 28С включительно основная масса целевого белка находилась в мембранной фракции.
Наличие в составе химерных белков на C-концах дополнительной гексагистидиновой последовательности позволило использовать металло-хелат аффинную хроматографию (МХАХ) на Ni-NTA сефарозе (гесксагистидиновый таг имеет сродство к ионам никеля). Десорбцию целевого белка проводили, понижая pH элюирующего буфера, одновременно повышая концентрацию имидазола.
Электрофоретический анализ накопления белков Мb, Mbb, Mzz и Mistbb в клетках E. coli BL-21(DE3). M – маркер молекулярной массы белка, фракции (1) растворимых белков, (2) нерастворимых белков, (3) мембранных белков. Полосы, соответствующие целевым белкам, указаны стрелкой.
Мембранная фракция была использована для серии экспериментов, направленных на оптимизацию условий МХАХ. Для солюбилизации белков гибридных белков, а также поддержания белков в растворимом виде использовали ионный детергент лаурилсаркозинат натрия. После того, как были подобраны оптимальные концентрации детергента и других компонентов буферов, с применением МХАХ были выделены гибридные белки Mb, Mbb, Mzz и Mistbb. Для избавления от имидазола, излишков солей и детергента применяли диализ через мембраны с размером отсечения 3 кДа в течение 4 ч при комнатной температуре на магнитной мешалке (Рисунок 28).
Для определения функциональной активности модифицированных белков был проведен твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения способности белков гибридных белков специфически связывать Fc-фрагмент антител класса G была выбрана схема эксперимента, представленная на Рисунке 29. На поверхность лунок иммунологической плашки был сорбирован инсулин человека, после чего в каждую лунку добавляли раствор специфичных против инсулина человека моноклональных антител мыши класса G. Антитела связывались Fab-фрагментом с сорбированным белком, что обеспечивало одинаковую ориентацию антител. Гибридные белки, имеющие в своем составе иммуноглобулин-связывающий домен белка A и гесксагистидиновый таг, связывались с первичными антителами. В качестве меченых антител были выбраны моноклональные антитела мыши против гексагистидинового тага, меченые пероксидазой хрена.
Для определения способности гибридных белков связывать иммуноглобулины, проводили ИФА. С инсулином человека, адсорбированным на поверхности лунок, связывали первичные антитела против инсулина, что обеспечивало однозначную ориентацию первичных антител. Гибридные белки, имеющие в своем составе иммуноглобулинсвязывающий домен, связывали Fc-фрагмент первичных антител. Результаты ИФА свидетельствуют о проявлении иммуноглобулинсвязывающей активности гибридными белками (Рисунок 30).
Рисунок 30. Результаты исследования IgG-связывающей активности гибридных белков Mb, Mbb, Mzz и Mistbb методом ИФА с ориентированными антителами.
Для определения уровня связывания антител гибридными белками была вычислена константа аффинности комплекса гибридного белка с антителом. В результате было показано, что белки Mbb, Mzz и Mistbb проявляют сравнимые уровни специфичности взаимодействия с антителами: Кaff (Mbb)=1.59±0.12 нМ, Кaff (Mzz)=1.44±0.16 нМ, Кaff (Mistbb)=1.53±0.11 нМ, тогда как константа аффинности между белком Mb и антителами отличалась от них существенно - Кaff (Mb)=4.83±0.34 нМ, что свидетельствует о более низком уровне специфичности взаимодействия.
На основании результатов ИФА был сделан вывод, что все модифицированные белки проявляют иммунноглобулинсвязывающую активность. Белки Mbb, Mzz и Mistbb связывали большее количество антител по сравнению с Mb, что подтверждает большую эффективность связывания с Fc-фрагментом антител двойного домена B и его синтетического аналога домена Z по сравнению с одиночным доменом B белка A. Также можно сделать вывод, что для модификации поверхности магнетосом могут быть использованы гибридные белки, имеющие в своем составе в качестве якорного домена как белок мембраны магнетосом Mam12, так и мембраноактивный белок Mistic. Для дальнейшей модификации магнетосом были выбраны белки с двойным доменом B белка А – Mbb и Mistbb.
Встраивание гибридных белков в мембрану магнетосом Для определения способности гибридных белков Mbb и Mistbb связывать IgG после интеграции в мембрану магнетосом, был выбран способ встраивания, предложенный ранее [103], посредством ультразвуковой обработки смеси магнетосом с гибридным белком в присутствии 300 мМ NaCl. Иммуноглобулинсвязывающую активность магнетосом с интегрированными в мембрану гибридными белками Mbb и Mistbb определяли методом магнитного ИФА (Рисунок 31).
Результаты исследования иммуноглобулинсвязывающей активности магнетосом с интегрированными в мембрану белками Mbb и Mistbb, полученные с использованием магнитного ИФА. Разведение IgG 1: 1 соответствует 1 мкг/мл. После интеграции оба белка сохраняли способность связывать антитела, но уровень встраивания белка Mbb был выше. Значения OD450, при инкубировании интактных магнетосом с антителами, были очень низкими, что свидетельствует о незначительной неспецифической адсорбции антител на мембране магнетосом.
В серии предварительных экспериментов, используя магнитный ИФА, были определены факторы, влияющие на представленность гибридных белков в мембране магнетосом: pH, концентрация NaCl и способ механического воздействия (интенсивное перемешивание или ультразвуковая обработка). Для выявления оптимального соотношения выявленных параметров был выбран метод анализа поверхности отклика (МАПО) с использованием плана Бокса-Бенкена. Ранее было показано, что МАПО является эффективным инструментом для прогнозирования оптимальных параметров для многомерных систем [10; 23; 144]. План Бокса-Бенкена с соответствующими параметрами представлен в Таблице 6.
Получение генетической конструкции mzz
Для определения локализации целевого белка в клетке было проведено фракционирование клеточного лизата штамма-продуцента. Были исследованы фракции растворимых, нерастворимых и мембранных белков (Рисунок 27). Было обнаружено, что при температуре культивирования до 28С включительно основная масса целевого белка находилась в мембранной фракции.
Наличие в составе химерных белков на C-концах дополнительной гексагистидиновой последовательности позволило использовать металло-хелат аффинную хроматографию (МХАХ) на Ni-NTA сефарозе (гесксагистидиновый таг имеет сродство к ионам никеля). Десорбцию целевого белка проводили, понижая pH элюирующего буфера, одновременно повышая концентрацию имидазола.
Электрофоретический анализ накопления белков Мb, Mbb, Mzz и Mistbb в клетках E. coli BL-21(DE3). M – маркер молекулярной массы белка, фракции (1) растворимых белков, (2) нерастворимых белков, (3) мембранных белков. Полосы, соответствующие целевым белкам, указаны стрелкой.
Мембранная фракция была использована для серии экспериментов, направленных на оптимизацию условий МХАХ. Для солюбилизации белков гибридных белков, а также поддержания белков в растворимом виде использовали ионный детергент лаурилсаркозинат натрия. После того, как были подобраны оптимальные концентрации детергента и других компонентов буферов, с применением МХАХ были выделены гибридные белки Mb, Mbb, Mzz и Mistbb. Для избавления от имидазола, излишков солей и детергента применяли диализ через мембраны с размером отсечения 3 кДа в течение 4 ч при комнатной температуре на магнитной мешалке (Рисунок 28).
Для определения функциональной активности модифицированных белков был проведен твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения способности белков гибридных белков специфически связывать Fc-фрагмент антител класса G была выбрана схема эксперимента, представленная на Рисунке 29. На поверхность лунок иммунологической плашки был сорбирован инсулин человека, после чего в каждую лунку добавляли раствор специфичных против инсулина человека моноклональных антител мыши класса G. Антитела связывались Fab-фрагментом с сорбированным белком, что обеспечивало одинаковую ориентацию антител. Гибридные белки, имеющие в своем составе иммуноглобулин-связывающий домен белка A и гесксагистидиновый таг, связывались с первичными антителами. В качестве меченых антител были выбраны моноклональные антитела мыши против гексагистидинового тага, меченые пероксидазой хрена.
Схема проведения ИФА с ориентированными антителами. Для определения способности гибридных белков связывать иммуноглобулины, проводили ИФА. С инсулином человека, адсорбированным на поверхности лунок, связывали первичные антитела против инсулина, что обеспечивало однозначную ориентацию первичных антител. Гибридные белки, имеющие в своем составе иммуноглобулинсвязывающий домен, связывали Fc-фрагмент первичных антител. Результаты ИФА свидетельствуют о проявлении иммуноглобулинсвязывающей активности гибридными белками (Рисунок 30).
Результаты исследования IgG-связывающей активности гибридных белков Mb, Mbb, Mzz и Mistbb методом ИФА с ориентированными антителами.
Для определения уровня связывания антител гибридными белками была вычислена константа аффинности комплекса гибридного белка с антителом. В результате было показано, что белки Mbb, Mzz и Mistbb проявляют сравнимые уровни специфичности взаимодействия с антителами: Кaff (Mbb)=1.59±0.12 нМ, Кaff (Mzz)=1.44±0.16 нМ, Кaff (Mistbb)=1.53±0.11 нМ, тогда как константа аффинности между белком Mb и антителами отличалась от них существенно - Кaff (Mb)=4.83±0.34 нМ, что свидетельствует о более низком уровне специфичности взаимодействия.
На основании результатов ИФА был сделан вывод, что все модифицированные белки проявляют иммунноглобулинсвязывающую активность. Белки Mbb, Mzz и Mistbb связывали большее количество антител по сравнению с Mb, что подтверждает большую эффективность связывания с Fc-фрагментом антител двойного домена B и его синтетического аналога домена Z по сравнению с одиночным доменом B белка A. Также можно сделать вывод, что для модификации поверхности магнетосом могут быть использованы гибридные белки, имеющие в своем составе в качестве якорного домена как белок мембраны магнетосом Mam12, так и мембраноактивный белок Mistic. Для дальнейшей модификации магнетосом были выбраны белки с двойным доменом B белка А – Mbb и Mistbb.
Встраивание гибридных белков в мембрану магнетосом Для определения способности гибридных белков Mbb и Mistbb связывать IgG после интеграции в мембрану магнетосом, был выбран способ встраивания, предложенный ранее [103], посредством ультразвуковой обработки смеси магнетосом с гибридным белком в присутствии 300 мМ NaCl. Иммуноглобулинсвязывающую активность магнетосом с интегрированными в мембрану гибридными белками Mbb и Mistbb определяли методом магнитного ИФА (Рисунок 31).
Рисунок 31. Результаты исследования иммуноглобулинсвязывающей активности магнетосом с интегрированными в мембрану белками Mbb и Mistbb, полученные с использованием магнитного ИФА. Разведение IgG 1: 1 соответствует 1 мкг/мл. После интеграции оба белка сохраняли способность связывать антитела, но уровень встраивания белка Mbb был выше. Значения OD450, при инкубировании интактных магнетосом с антителами, были очень низкими, что свидетельствует о незначительной неспецифической адсорбции антител на мембране магнетосом.
В серии предварительных экспериментов, используя магнитный ИФА, были определены факторы, влияющие на представленность гибридных белков в мембране магнетосом: pH, концентрация NaCl и способ механического воздействия (интенсивное перемешивание или ультразвуковая обработка). Для выявления оптимального соотношения выявленных параметров был выбран метод анализа поверхности отклика (МАПО) с использованием плана Бокса-Бенкена. Ранее было показано, что МАПО является эффективным инструментом для прогнозирования оптимальных параметров для многомерных систем [10; 23; 144]. План Бокса-Бенкена с соответствующими параметрами представлен в Таблице 6.
Способность комплекса БМЧ-Mbb и БМЧ-Mistbb связывать IgG определяли согласно плану Бокса-Бенкена методом магнитного ИФА, результаты которого представлены в Таблице 7. При интеграции белка Mbb наиболее высокие значения OD450 наблюдали при следующих условиях: без добавления NaCl при рН=8.0 и интенсивном перемешивании или ультразвуковой обработки в течение 55 с. В случае интеграции Mistbb самое высокое значение OD450 было достигнуто при 5 с обработки ультразвуком без добавления NaCl при рН=8.0, и при 55 с перемешивания на вортексе при рН=11.0 в присутствии 250 мМ NaCl.
