Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Маннаны растительного сырья и их характеристика 10
1.2. Р-Маннаназы: продуценты, условия биосинтеза
1.2.1. Продуценты р-маннаназ 16
1.2.2. Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов 19
1.3. Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов 23
1.3.1. Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК 23
1.3.2. Клонирование и экспрессия маннаназных генов 26
1.4. Получение препаратов р-маннаназы и их характеристика 28
1.4.1. Выделение и очистка Р-маннаназ 28
1.4.2. Физико-химические свойства Р-маннаназ различного происхождения 30
1.4.3. Продукты деструкции маннанов 37
1.4.3.1. Функциональные свойства маннозы
и манноолигосахаридов 38
1.5. Практическое применение р-маннаназ 40
Заключение 43
ГЛАВА 2. Объекты, материалы и методы исследований 45
2.1. Объект исследования и условия его культивирования 45
2.2. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе 46
2.3. Методы молекулярного клонирования в бактериях
2.3.1. Выделение хромосомной ДНК 47
2.3.2. Выделение плазмиды pBlueScript ks (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. coli 49
2.3.3. Выделение плазмиды рСВ20 из грамположительных микроорганизмов - В. subtilis 51
2.3.4. Полимеразная цепная реакция 52
2.3.5. Создание генетических конструкций
«клонирующий вектор - встроенная ДНК» 54
2.3.6. Трансформация клеток химическим методом 55
2.3.7. Электрофорез в агарозном геле 56
2.3.8. Выделение ДНК из агарозного геля 57
2.4. Определение активности ферментного препарата 58
2.4.1. Определение активности (3-маннаназы 58
2.4.2. Методы определения активности сопутствующих ферментов 60
2.5. Получение спиртоосажденного фермента 61
2.6. Определение физико-химических свойств фермента 61
2.7. Определение степени гидролиза маннанов 62
2.8. Определение качественного состава продуктов гидролиза 62
2.9. Исследование пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов 63
2.10. Общие биохимические и микробиологические методы исследования 64
2.11. Статистическая обработка экспериментальных данных 65
ГЛАВА 3. Конструирование рекомбинантного штамма - продуцента р-маннаназы 66
3.1. Выбор объекта клонирования и системы экспрессии 66
3.2. Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора pBlueScript ks (+) 69
3.3. Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20 74
3.4. Выбор наиболее эффективного промотора для экспрессии гена (З-маннаназы 78
3.5. Исследование стабильности рекомбинантного плазмидного штамма B.subtilis 81
ГЛАВА 4. Получение рекомбинантнои р-маннаназы и исследование физико-химических свойств фермента 84
4.1. Подбор оптимальных условий глубинного культивирования рекомбинантного штамма B.subtilis 84
4.2. Получение спиртоосажденного ферментного препарата Р-маннаназы 90
4.3. Технология получения ферментного препарата рекомбинантной В-маннаназы B.subtilis 168 94
4.4. Исследование влияния рН и температуры на активность В-маннаназы 98
4.5. Исследование кинетики кислотной и термической инактивации р-маннаназы 101
Глава 5. Исследование процесса ферментативной деструкции маннанов растительного сырья и определение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов 107
5.1. Исследование процесса ферментной деструкции маннанов растительного сырья и идентификация продуктов гидролиза 107
5.2. Изучение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов ПО
5.3. Расчет себестоимости Р-маннаназы по предлагаемой технологии 112
Заключение 117
Выводы 119
Список использованных источников 121
- Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов
- Выделение плазмиды pBlueScript ks (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. coli
- Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20
- Технология получения ферментного препарата рекомбинантной В-маннаназы B.subtilis
Введение к работе
Актуальность работы. р-Маннаназы (ЕС 3.2.1.78) - ферменты, относящиеся к классу О-гликозид-гидролаз, расщепляют внутренние р-1,4-гликозидные связи в маннанах - полисахаридах гемнцеллюлозной фракции клеточкой стенки растений. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза манноолнгосахариды и моносахарид манноза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень маннозы в крови приводит к анормальному гликозилированию иммуноглобулинов и нарушению структуры их углеводной части, а также нарушению синтеза других гликопротеинов [Hernandez et al, 2008]. Поэтому актуальным является создание на основе продуктов гидролиза маинанов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами. Кроме того, р-маннаназы используют для получения высококачественной бумаги, растворимого кофе, комбикормов и некоторых других продуктов.
Спектр микроорганизмов - природных продуцентов р-маннаназ довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.
Достижения в области технологии молекулярного клонирования и генной инженерии позволяют решить данную проблему путем создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что позволяет повысить активность и выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.
Получением высокоактивных р-маннаназ занимались в основном зарубежные ученые: Arcand (1993), Tamaru (1997), Sunna (2000), Hatada (2005), Chen (2008) и другие. Однако исследования, направленные на создание рекомбинантных продуцентов Р-маннаназ, немногочисленны, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.
В настоящее время на рынке ферментных препаратов представлены коммерческие препараты Р-маннаназ зарубежного производства. Имеющиеся запатентованные отечественные комплексные ферментные препараты, продуцентами которых являются в основном микромицеты, обладают низкой маннаназной активностью, по сравнению с импортными ферментами, поэтому поиск и получение активных продуцентов Р-маннаназ является актуальной задачей современной биотехнологии.
В связи с вышесказанным, получение эффективного продуцента Р-маннаназы методом генной инженерии и разработка на его основе биотехнологии высокоактивной р-маннаназы являются актуальными.
Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных Сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», государственный контракт № 02.512.11.2206 от 26.06.2008 г.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биотехнологии высокоактивной Р-маннаназы с использованием методов генной инженерии, исследовании физико-химических свойств ферментного препарата и определении пребиотической способности полученных маннозосодержащих гидролизатов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
выбор микроорганизма - источника гена Р-маннаназы и системы экспрессии клонированного гена;
определение эффективного промотора для экспрессии гена Р-маннаназы;
получение рекомбинантного штамма - высокоактивного продуцента Р-маннаназы;
определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;
получение ферментного препарата Р-маннаназы и исследование его физико-химических свойств;
исследование ферментативной деструкции галактоманнана и идентификация продуктов гидролиза;
определение пребиотических свойств маннозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.
Научная новизна. С применением технологии рекомбинантных ДНК
впервые получен отечественный ферментный препарат
высокоактивной Р-маннаназы. Путем введения в составе многокопийного вектора рСВ20 дополнительных копий гена р-маннаназы под контролем регулируемого промотора PST сконструирован штамм В. subtilis 168 -перспективный продуцент р-маннаназы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам р-маннаназ. Выявлены закономерности кислотной и термической инактивации рекомбинантного фермента. Установлены оптимачьные параметры процесса ферментативной деструкции галактоманнана камеди рожкового дерева, обеспечивающие степень гидролиза галактоманнана 85 %.
Практическая значимость. Проведена апробация биотехнологии рекомбинантной р-маннаназы на базе ИБФМ РАН и получена опытная партия фермента. Разработана технология получения маннозосодержащих гидролизатов, основанная на ферментативном гидролизе галактоманнанов р-маннаназой, которая может найти применение при производстве функциональных продуктов и кормовых добавок с иммуностимулирующим и пребиотическим действием.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных конференциях ВГТА (г. Воронеж, 2009-2011 it.); «Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых» (2009 г); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2010, 2011 гг.); 2-ом международном конгрессе «ЕвразияБно» (г. Москва, 2010 г.); 4-й всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010»; конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.); II Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева (г. Москва, 2010 г.) международном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2011» (г.Санкт-Петербург, 2011г.).
Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», где отмечена медалью за лучшую научно-исследовательскую работу.
Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.».
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсу;кдения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 142 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 25 рисунков и 9 таблиц. Библиография включает 160 наименований, в т. ч. 135 иностранных.
Факторы, влияющие на биосинтез маннаназ при культивировании продуцентов
В последние годы полисахариды сложных лигнифицированных клеточных стенок растений, среди которых преобладают гемицеллюлоза и целлюлоза, рассматривают как потенциальный источник моно- и олигосахаридов, в которые они могут быть превращены при действии гемицеллюлаз - ферментов, катализирующих расщепление гемицеллюлоз [19].
Гемицеллюлозы - структурные полисахариды клеточных стенок растений со степенью полимеризации 50-200, которые являются вторым по массе компонентом клеточной стенки растений после целлюлозы.
Маннаны являются важным компонентом гемицеллюлоз, основная цепь которых состоит в основном из остатков D-маннозы. Они представлены в природе в виде четырех основных форм: линейной, состоящей только из остатков маннозы; галактоманнана, состоящего из остатков маннозы, имеющих боковые группы в виде галактозы; ацетилированного глюкоманнана, состоящего из чередующихся остатков глюкозы и маннозы; и галактоглюкоманнана (рис. 1.1).
В большинстве случаев в основной цепи остатки Сахаров связаны между собой (3-1,4-гликозидными связями, а боковые заместители с основной цепью - а-1,6 связями, однако наблюдаются и иные структуры. Линейные маннаны являются гомополисахаридами, которые состоят из линейных цепей, образованных P-D-маннопиранозными остатками, связанными между собой 1,4 связями, и содержат менее 5 % галактозы. Некоторые из этих манннанов, главным образом из aloe vera, показывают иммуно-фармакологические и терапевтические свойства. Они содержатся в скорлупе орехов слоновой пальмы и зеленых кофейных бобах [102] и обычно присутствуют в эндосперме Palmae, таких как Phytelephas macrocarpa [96].
Маннаны были найдены в красных морских водорослях Porphyra umbilicalis и в различных видах зеленых морских водорослей Codium [108]. Подкласс зеленых водорослей Siphonales содержит р-1,4-связанный маннан со структурой, похожей на структуру целлюлозы [102].
Растительные галактоманнаны состоят из растворимых в воде 1,4-связанных (З-Б-маннопиранозных остатков с боковыми цепями, образованными 1,6-связанными a-D-галактопиранозными остатками, присоединенными вдоль основной цепи [34]. Различия в распределении D-галактозных единиц вдоль структуры маннана обнаружено в галактоманнанах из различных источников [153]. Истинными галактоманнами являются те маннаны, которые содержат более чем 5 % D-галактозных остатков по весу [102].
Галактоманнаны найдены в семенах восьми ботанических семейств, главным образом, в семенах семейства Leguminosae и локализованы в эндосперме семян. Они выполняют функцию энергетического резерва и регулятора водного баланса семени при прорастании [25].
Галактоманнаны присутствуют в видах Annonaceae, Convolvulaceae, Ebenaceae, Loganiaceae и Palmae [102], а также выделены из Retama raetam, дикого растения, принадлежащего к семейству Fabaceae [142], из семян Astragalus falcatus Lam. [20], плодов верблюжьей колючки Alhaagi persarum L. [8] и семян некоторых представителей рода Gleditsia [5].
Кроме этого, эти полисахариды выделены из некоторых видов лишайников. Их основная цепь образована a-D-маннопиранозными остатками, соединенными а-1,6 связями, с различным порядком замещения при втором или при четвертом атоме кислорода свободными единицами a-D-манноиираноз и p-D-галактопираноз соответственно [143].
Глюкоманнаны - полисахариды, представленные в большом количестве в гемицеллюлозной фракции мягкой древесины. Они содержат цепи, в которых беспорядочно расположены [3-1,4-связанные D-маннозные и (3-1,4-связанные D-глюкозные остатки в отношении 3 : 1 и степенью полимеризации более чем 200. В твердой древесине содержатся полисахариды с соотношением глюкозы и маннозы 1:1.5-2 [102].
Содержание глюкоманнанов в хвойной древесине составляет около 11 %. Они также представлены в небольших количествах в гемицеллюлозных компонентах покрытосеменных растений и составляют 3-5 % всего материала клеточных стенок [43].
Глюкоманнан клубней Amorphophallus konjac известен под названием «конъяк-маннан». Полисахарид содержит глюкозу и маннозу в отношении 2:3. Его полигликозидная цепь разветвлена, концевыми группами являются как глюкозные, так и маннозные остатки. В основной цепи преобладают 1,4-3-гликозидные связи [102].
Кроме того, глюкоманнаны были выделены из семян Lupinus varius [144] и корней Eremurus fuscus [3]. Галактоглюкоманнаны - полисахариды, основная цепь которых состоит из Р-(1—»4)-Б-маннопиранозных и (3-(1- 4)-Б-глюкопиранозных остатков, к которым присоединены а-(1—»4)-0-галактопиранозные единицы [102]. Молярное соотношение маннозных, глюкозных и галактозных остатков составляет 3:1:1 [121]. Некоторое количество маннозных единиц частично замещено О-ацетильными группами, одинаково распределенными между 2 и 3 углеродными атомами, в среднем I ацетильная группа на 3-4 гексозных единицы [43]. Данный вид маннанов является основным компонентом гемицеллюлоз в мягкой древесине [43]. Галактоглюкоманнан, выделенный из еловых стружек, имеет следующее строение: степень полимеризации от II до 20, молярное соотношение манноза/ глюкоза/ галактоза - 4:1:0.1, около 1/3 маннозных единиц замещены О-ацетильными группами, которые распределены между 2 и 3 углеродными атомами [87].
Выделение плазмиды pBlueScript ks (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. coli
Бактериальную культуру В. subtilis 168 культивировали в 3 мл среды LB в течение 12 ч. После этого 1,5 мл культуры переносили в пробирку, осаждали клетки центрифугированием в течение 30-60 с на максимальной скорости, супернатант сливали. Оставшиеся 1,5 мл культуры переносили в ту же пробирку, осаждали клетки центрифугированием в течение 30-60 с, супернатант сливали.
В пробирку с биомассой добавляли 300 мкл раствора I и ресуспензировали, далее вносили (на кончике шпателя) лизоцим и инкубировали при 37С в течение 1 часа.
В пробирку добавляли 30 мкл раствор SDS с массовой долей 20 %, тщательно перемешивали. Суспензию помещали в термостат при 55-60С на 10-15 мин. После этого раствор охлаждали и добавляли 90 мкл 5 М Nad.
В пробирку с полученным лизатом вносили равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), встряхивали в течение 30 с. затем смесь центрифугировали 5 мин на максимальной скорости, верхний слой переносили дозатором в чистую пробирку.
В пробирку с верхней фазой снова вносили равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), встряхивали в течение 30 с, центрифугировали 5 мин на максимальной скорости, верхний слой переносили в новую пробирку.
В пробирку с верхней фазой еще раз добавляли равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), встряхивали, смесь центрифугировали, верхний слой переносили в новую пробирку.
В пробирку вносили 2 объема 96 % этанола и выдерживали 20 мин при - 20С. После центрифугирования в течение 5 мин при 6000 об/мин супернатант осторожно удаляли дозатором и осадок ДНК высушивали в открытой пробирке при 37С 30 мин. После этого ДНК растворяли в 40 мкл бидистиллированной Н20 или буфера ТЕ.
Бактериальную культуру Е. coli XL-1 blue культивировали в 3 мл среды LB с ампицилином в течение 12 ч. Затем 1,5 мл культуры переносили в пробирку, осаждали клетки центрифугированием в течение 30-60 с на максимальной скорости, супернатант сливали. Оставшиеся 1,5 мл переносили в ту же пробирку, осаждали клетки центрифугированием в течение 30-60 с на максимальной скорости, супернатант сливали. В пробирку с биомассой добавляли 200 мкл раствора I, ресуспензировали и выдерживали в течение 5 мин, после чего добавляли 400 мкл раствор II, содержимое мягко перемешивали.
В пробирку вносили 300 мкл раствор III, перемешивали и помещали в ледяную баню на 10 мин. После осаждения центрифугированием на максимальной скорости в течение 3 мин жидкую фазу переливали в чистую пробирку.
В пробирку вносили 650 мкл изопропанола, встряхивали на шейкере, выдерживали 2 мин при комнатной температуре. Содержимое осаждали центрифугированием на максимальной скорости в течение 3 мин, тщательно отбирали надосадочную жидкость.
Осадок растворяли в 500 мкл бидистиллированной воды и добавляли 250 мкл насыщенного раствора ЫС1 и выдерживали при - 20С в течение 20 мин. Содержимое осаждали центрифугированием на максимальной скорости в течение 5 мин, надосадочную жидкость переливали в чистую пробирку.
В пробирку вносили 600 мкл изопропанола, встряхивали на шейкере, выдерживали 5 мин при комнатной температуре. Осаждали центрифугированием на максимальной скорости в течение 3 мин, тщательно отбирали надосадочную жидкость.
Осадок промывали в 700 мкл 70 % этанола, осаждали центрифугированием на максимальной скорости в течение 3 мин и отбирали надосадочную жидкость. Осадок подсушивали в открытой пробирке при 37С в течение 30 мин и растворяли в 40 мкл бидистиллированной Н20 или буфера ТЕ.
Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20
По результатам первичного скрининга на наличие (3-маннаназной активности отобрано 4 культуры: В. macerans, В. licheniformis, В. species и В. subtilis 168.
На втором этапе скрининга был подтвержден биосинтез фермента при культивировании отобранных продуцентов в колбах на жидкой среде с 0,5 % камеди рожкового дерева и количественно оценена продукция Р-маннаназы.
Уровень Р-маннаназной активности исследуемых штаммов представлен в табл. 3.2, из которой видно, что исследуемые штаммы имеют сопоставимый уровень активности Р-маннаназы. Для дальнейшей работы по получению рекомбинантного штамма в качестве источника гена (3-маннаназы выбран штамм В. subtilis 168, геном которого полностью секвенирован.
Для полного сохранения активности фермента при высоком уровне экспрессии в качестве клеток хозяина рекомбинантных плазмид выбрали бактерии В. subtilis 168. К тому же, при экспрессии гена Р-маннаназы В. subtilis 168 в бактериях того же вида секреторный сигнал данного белка с высокой степенью вероятности будет корректно распознаваться клетками хозяина, что обеспечит способность клеток-продуцентов секретировать рекомбинантный белок в питательную среду. Данное обстоятельство является важным при получении ферментов, так как при этом значительно облегчается выделение и очистка белка.
Для клонирования фрагментов ДНК использовали вектор -pBlueScript ks (+). Генетическая карта вектора pBlueScript ks (+) представлена на рис. 3.1, из которого видно, что плазмида содержит ген устойчивости к ампицилину; регулируемый сегмент гена р-галактозидазы (lacZ) лактозного оперона Е. coli; ген lad, контролирующий синтез репрессора, который блокирует транскрипцию гена lacZ в отсутствии индуктора ИПТГ; полилинкер с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз.
Плазмида pBlueScript ks (+) обладает рядом свойств, которые делают ее удобной для использования в качестве клонирующего вектора: - pBlueScript ks (+) имеет маленький размер - 2958 п.н., что позволяет интегрировать в нее относительно большой ДНК-фрагмент; - в клетках хозяина плазмида способна к репликации до 500 копий на клетку; - в pBlueScript ks (+) имеется большое число различных сайтов рестрикции, которые компактно расположены в одном структурном регионе - полилинкерном участке; - плазмида имеет селективную систему, позволяющую легко идентифицировать клетки, несущие плазмиду со встроенным фрагментом ДНК.
Последовательность нуклеотидов гена Р-маннаназы (ManF) В. subtilis 168 была получена из базы данных NCBI. Кодирующую часть гена р-маннаназы амплифицировали при помощи ПЦР, используя соответствующие генспецифические праймеры и хромосомную ДНК В. subtilis J68 в качестве матрицы. Полученный фрагмент клонировали в вектор pBlueScript KS (+) по сайтам рестрикции EcoRV и Sad.
В простом случае для экспрессии гена достаточно клонировать нужный ген в плазмиду, содержащую промотор и сайт связывания с рибосомой (RBS) и способную реплицироваться в клетках хозяина. Для экспрессии гена на более высоком уровне часто используют регулируемые промоторы других генов, обеспечивающие более интенсивную транскрипцию нужного гена.
В качестве промоторов гена (3-маннаназы нами были выбраны промотор PST В. subtilis, регулируемый фосфатным голоданием, и ксиланазный промотор XylA B.megaterium, который в комплексе с геном репрессора XylR индуцируется добавлением ксилозы.
Промотор PST был амплифицирован при помощи ПЦР, используя соответствующие генспецифические праймеры и хромосомную ДНК В. subtilis 168 в качестве матрицы, и клонирован в вектор pBlueScript ks (+), содержащий последовательность гена Р-маннаназы, по сайтам рестрикции Kpnl и EcoRV. Полученная конструкция pBS-PST-promoter-ManF представлена на рис. 3.2.
Полученные генетические конструкции ввели в клетки Е. coli. Для идентификации клеток, несущих плазмиду pBlueScript KS (+) с клонированным фрагментом, клетки высевали на питательную среду с ампицилином, ИПТГ и субстратом для Р-галактозидазы (5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-Б-галактозид - Xgal). трансформированные клетки не могут расти в присутствии ампицилина, клетки, несущие интактную плазмиду, образуют колонии синего цвета благодаря тому, что продуцируют р-галактозидазу, расщепляющую Xgal с образованием 5-бром-4-хлор-индиго. При интеграции ДНК-фрагмента в полилинкерный участок происходит разрыв последовательности гена lacZ, ген инактивируется, поэтому бактериальные клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, формируют белые колонии, что позволяет легко их идентифицировать. 3.3. Создание генетических конструкций на основе вектора рСВ20
В качестве вектора для экспрессии клонированного гена (3-маннаназы в работе использована плазмида рСВ20, представленная на рис. 3.4. Плазмида рСВ20 имеет размер 7,6 т.п.н., в составе несет маркерный ген устойчивости к эритромицину, позволяющий селектировать измененные клетки. Основной принцип работы такого маркера - способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде с добавкой определенных антибиотиков, в частности эритромицина, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, нормальных клеток.
Вектор для экспрессии - вектор, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию гена после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. Поэтому вектор рСВ20 содержит последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий гена и трансляции их мРНК в клетках В. subtilis.
Вектор рСВ20 относится к челночным (бинарным) векторам, способным реплицироваться в клетках - хозяевах разных биологических видов, т. е. данная плазмида может размножаться как в клетках Е. coli, так и в клетках В. subtilis.
Технология получения ферментного препарата рекомбинантной В-маннаназы B.subtilis
Пероральное введение мышам возрастающих доз маннозосодержащих гидролизатов на фоне экспериментального дисбиоза оказывало положительное действие на качественный и количественный состав микрофлоры опытной партии мышей.
При исследовании нормофлоры мышей было установлено, что количество Escherichia coli, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, как наиболее важных представителей микрофлоры, составило, КОЕ/см": 106 - 107, 103 и 101 соответственно. При пероральном введении антибиотика в дозе 10 мг/мышь в течение 7 дней у животных наблюдалась элиминация нормальной микрофлоры и контаминация кишечника животных условно-патогенной микрофлорой. Среднее количество E.coli в фекалиях повышалось до 10 КОЕ/г, В. bifidum не высеивались совсем, а содержание L. acidophilus сокращалось до 10 КОЕ/г (табл. 5.1). является их применение в дозировке 0,02 % от массы тела опытных мышей.
Результаты исследования микробиоценоза мышей при введении в суточный рацион питания маннозосодержащих гидролизатов и пробиотических препаратов «Бифидумбактерин» и «Лактобактерин», представленные в табл. 5.2, свидетельствуют о том, что маннозосодержащие гидролизаты, наряду с указанными препаратами, способствовали восстановлению состава и численности индигенной микрофлоры мышей в условиях экспериментального дисбиоза уже на 5 сутки после начала их введения.
Применение маннозосодержащих гидролизатов в дозировке 0,02 % от массы тела опытных мышей в условиях экспериментального дисбиоза способствовало увеличению количества бифидобактерий и молочнокислых бактерий, что свидетельствует об их пребиотическом действии.
Маннозосодержащие гидролизаты оказывали такое же действие на восстановление микрофлоры мышей на фоне индуцированного дисбиоза, как и коммерческие пробиотические препараты «Бифидумбактерин» и «Лактобактерин».
Высокоактивная (3-маннаназа, полученная по разработанной технологии на основе рекомбинантного штамма В. subtilis 168, обладает активностью, сопоставимой с зарубежными аналогами.
Представленные на сегодняшний день на рынке коммерческие ферментные препараты (3-маннаназ (Megazyme, Ирландия) имеют диапазон стоимости от 30 до 260 за 1000 ед. активности, что составляет 1260 -10920 руб в зависимости от активности фермента.
Для оценки конкурентоспособности фермента был произведен расчет себестоимости Р-маннаназы, полученной по предлагаемой технологии.
Полная себестоимость продукта включает в себя прямую и косвенную себестоимость. Прямая себестоимость - это прямые затраты на производство продукции.
При расчете прямой себестоимости фермента Р-маннаназы учтены такие затраты как стоимость компонентов питательной среды, спирта для осаждения фермента, стоимость электроэнергии и воды, потребляемых при эксплуатации оборудования, заработанная плата, амортизация оборудования.
Стоимость компонентов питательной среды и этилового спирта для осаждения фермента представлена в табл. 5.3. Рассчет затрат произведен для культивирования продуцента (3-маннаназы в полупромышленном ферментере на 200 л, рабочий объем - 130 л.
Со 130 л питательной среды получили 130 г фермента, соответственно, затраты на сырье при получении 1 г фермента составили 78,8 руб/г. из В процессе получения фермента использовали несколько видов оборудования, главные из которых ферментер, центрифуга и лиофильная сушилка.
Для получения посевного материала продуцент выращивали в лабораторном ферментере в течение 16 ч. Характеристики лабораторного ферментера: мощность ферментера - 1,5 кВт-ч; расход воды - 25 л/ч. За 16 ч культивирования ферментер потреблял 22,72 кВт энергии и 0,4 м воды.
Для биосинтеза фермента полученный инокулят вносили в полупромышленный ферментер с питательной средой, культивирование вели в течение 24 ч. Характеристики полупромышленного ферментера: мощность ферментера - 15 кВт-ч; мощность мешалки - 7,5 кВт ч; потребление воды - 400 л/ч. За 24 ч культивирования на работу ферментера и мешалки расходовалось 540 кВт энергии и 9,6 м воды.
Расход электроэнергии на процесс ферментации составил 562,72 кВт, а расход воды - 10 м3. Учитывая, что стоимость электроэнергии 1,42 руб за ІкВт-ч, а стоимость воды - 14,35 руб/м , затраты на один цикл ферментации составили 942,5 руб.
Для осаждения фермента использовалась рефрижераторная центрифуга большой вместимости Rotixa 50S (8 л), мощность которой составляет 3 кВт-ч. Для получения фермента осаждали около 60 л смеси культуральной жидкости с этанолом в течение 5 ч. При этом расход энергии составил 15 кВт, стоимость - 21,3 руб.
![Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс]](/i/i/4612/199276.png "Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс] Ефременко Анна Александровна")
