Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6-51
Раздел 1.1. Характеристика объекта: бифидобактерии, их свойства и значимость для нормальной жизнедеятельности человека 6-20
Раздел 1.2. История генотипирования. Эволюционная систематика. Таксономия бактерий21-41
Раздел 1.3. Становление бифпдофлоры кишечника у детей раннего возраста 42-50
Цель и задачи исследования 51
Глава 2. Материалы и методы исследования 52-69
Раздел 2.1. Материалы 52-59
Раздел 2.2. Методы исследования 59-69
Глава 3. Результаты и обсуждение 70-100
Раздел 3.1 Разработка методики видового типирования 70-84
бифидобактерии на основе двухлокусного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и tal.
Раздел 3.2 Применение разработанной методики двухлокусного 84-92
секвенирования для видовой идентификации 21
коллекционного штамма бифидобактерии.
Раздел 3.3 Применение разработанной методики для видового 92-100
типирования 30 изолятов бифидобактерии из кишечника 11 детей раннего возраста.
Глава 4. Заключение. 101 -104
Выводы 105
Список публикаций по теме диссертации 106-108
Благодарности 109
Библиографический список 110-122
- Характеристика объекта: бифидобактерии, их свойства и значимость для нормальной жизнедеятельности человека
- Материалы
- Разработка методики видового типирования
Введение к работе
Бактерии рода Bifidobacterium являются важным компонентом индигенной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных. Они обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим действием, синтезируют аминокислоты, витамины (К. РР и группы В), биотин, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ.
В связи с широким спектром положительных свойств Bifidobacterium spp. часто используются в качестве пробиотиков при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ. Их применение особо значимо для современных детей раннего возраста ввиду дефицита или полного отсутствия кишечной бифидофлоры и изменения ее видового состава по сравнению с данными 60-80-х годов XX века даже при исключительно грудном вскармливании. Поэтому достоверная идентификация наиболее физиологичных для человека 5 видов бифидобактерий: В. adolescentis, В. bijidum, В. breve, В. infantis и В. longum, являющихся основой большинства про- и синбиотических препаратов для человека и сельскохозяйственных животных, очень актуальна как для производителей такого рода препаратов, так и для ветеринарной и медицинской практики, в особенности для педиатрии и детской диетологии.
В настоящее время видовая идентификация бифидобактерий основывается на фенотипических критериях: морфологических и биохимических признаках, антагонистической активности и устойчивости к антибиотикам. Но эти признаки являются зачастую нестабильными, неоднозначными и очень сходными у представителей близкородственных видов. Поэтому в дополнение к традиционным культуральным методам крайне актуальной становится задача разработки методики генотипирования бифидобактерий на уровне вида, в особенности для различения видов В. infantis и В. longum.
Филогения домена Bacteria построена на анализе последовательностей информационного гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). Однако возможности данной мишени на уровне ниже рода ограничены, поскольку с ее помощью нельзя различить генетически близкородственные виды бактерий. Поэтому возникает необходимость разработки альтернативных подходов, одним из которых является двухлокусное секвенирование - дополнение филогении на основе гена 16S рРНК анализом последовательностей одного из операционных генов (house-keeping genes), кодирующих наиболее значимые для исследуемого таксона белки клеточного метаболизма.
Двухлокусное секвенирование имеет множество преимуществ по сравнению с другими методами видовой идентификации. Во-первых, данный метод выявляет изменения в информационном и операционном генах, эволюционирующих медленно и, вероятно, являющихся нейтральными для отбора, что позволяет различать штаммы бактерий разных видов по длительно сохраняющимся изменениям в геноме. Во-вторых, результаты секвенирования являются однозначными, достоверными, воспроизводимыми и сопоставимыми в рамках разных лабораторий, что позволяет на основе секвенированных аллелей создавать глобальные, общемировые базы данных, анализировать нх и передавать через Интернет исследователям разных стран. Таким образом, применение двухлокусного секвенирования, а в перспективе и мультилокусного секвенирования (MLST) на основе нескольких операционных генов, в анализе штаммов бактерий открывает новые перспективы в исследованиях как молекулярно-биологического, эволюционного, филогенетического, так и эпидемиологического, популяционно-генетического направления.
Характеристика объекта: бифидобактерии, их свойства и значимость для нормальной жизнедеятельности человека
В первой половине XX века благодаря применению физико-химических методов было положено начало использованию хемотаксономического подхода к систематике микроорганизмов, главным образом, изучению нуклеиновых кислот.
В 1939-1943 гг. великим русским физиологом и биохимиком Белозерским А.Н. было показано, что у бактерий всегда присутствуют оба типа нуклеиновых кислот - ДНК и РНК. что наряду с исследованиями растительных и животных клеток подтвердило универсальное присутствие обоих типов нуклеиновых кислот у представителей различных филогенетических царств [5].
В 1950-1951 гг. Erwin Chargaff на основании количественных определений состава нуклеотидов ДНК постулировал специфичность химического строения ДНК организмов небольшого числа таксономических групп, то есть различия состава оснований ДНК при неизменном равенстве содержания аденина и тимина, гуанина и цитозина.
Это исследование послужило важной предпосылкой для революционного события в биологической науке - расшифровки James D. Watson и Francis Н.С. Crick в 1953 году (Нобелевская премия 1962 года) вторичной структуры ДНК как регулярной двойной спирали, состоящей из двух комплементарных цепочек, и открытия механизма репликации ДНК.
Ранее специфика живых организмов связывалась только с белками, но теперь оказалось, что она также связана с исключительно высокой специфичностью нуклеиновых кислот. Таким образом, изучение нуклеиновых кислот в систематическом, сравнительно-биохимическом и эволюционном аспектах наиболее перспективно с точки зрения познания материальных основ эволюционного процесса, поскольку именно эти соединения самым тесным образом связаны с наследственностью и изменчивостью, и, следовательно, в их структуре должна найти материальное выражение и филогения организмов [1].
Анализ GC - состава ДНК
Начало эре генотипирования положило предпринятое в середине 50-х гг. XX века А.Н. Белозерским, А.С. Спириным и др. масштабное исследование нуклеотидного состава ДНК и РНК бактерий из разных систематических групп для выяснения вопроса о том, насколько широко проявляется специфичность нуклеиновых кислот. При этом если в отношении ДНК уже имелись данные, указывающие на видовую специфичность, в отношении РНК такие исследования еще не проводились.
На основании изучения состава ДНК обширного набора видов бактерий Белозерский и Спирин пришли к заключению, что состав ДНК у микроорганизмов вследствие широкой амплитуды изменчивости (начиная от ДНК сильно выраженного GC-типа до сильно выраженного АТ-типа) имеет таксономическое значение и должен быть использован в качестве одного из важнейших признаков при построении систематики микробов [1].
Подключение анализа нуклеотидного состава ДНК (а в наше время, и нуклеотидной последовательности, определяемой путем секвенирования) к решению вопросов систематики привело к формированию новой области биологической науки - геносистематики, занимающейся разработкой принципов систематики и таксономии организмов на основе исследования химической структуры их генома [5].
Вторым важным следствием проведенного исследования стало наблюдение, что при широком спектре вариации в составе ДНК состав РНК лишь незначительно отличался у бактерий разных систематических групп [27]. Это свидетельствовало о том, что основная часть клеточной РНК достаточно близка у разных видов бактерий, то есть эволюционно консервативна [5]. Но помимо этой РНК (как теперь известно - рибосомальной РНК) была обнаружена небольшая фракция видоспецифической РНК, сходной по нуклеотидному составу с ДНК. Таким образом, были получены первые указания на существование матричной или информационной РНК [27].
Материалы
Коллекционные штаммы бифидобактерий. Чистые культуры 19 депонированных штаммов бифидобактерий из Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (Federal Human Host Microflora Bank, далее FHHMB) МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, из которых 11 производственных, были любезно предоставлены с целью проведения генотипирования сотрудниками лаборатории биологии бифидобактерий МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Жиленковой О.Г. и Амерхановой A.M. Это 4 штамма вида В. adolescentis (В. adolescentis FHHMB 40, В. adolescentis FHHMB 75-13. В. adolescentis FHHMB GO-13 и В. adolescentis FHHMB MS-42), 5 штаммов вида В. bifidum (В. bifidum FHHMB 536, В. bifidum FHHMB 791, B. bifldum FHHMB 35, B. bifidum FHHMB LVA-3 и В. bifidum FHHMB 1), 3 штамма вида В. breve (В. breve FHHMB 23, В. breve FHHMB 79-88 и В. breve FHHMB 79-119), 3 штамма вида В. infantis (В. infantis FHHMB 73-15, В. infantis FHHMB 302-87 и В. infantis FHHMB 11-45), 4 штамма вида В. longum (В. longum FHHMB 379, В. longum FHHMB Ya-3, B. longum FHHMB 46 и В. longum FHHMB 8)
Два коллекционных штамма бифидобактерий AC-1248 В. bifidum 83 и АС-1251 В. longum Д4а200 были приобретены во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Russian National Collection of Industrial Microorganisms, далее RNCIM) Государственного научного центра ГосНИИгенетика.
Также Жиленковой О.Г. и Амерхановой A.M. из FHHMB были любезно предоставлены чистые культуры 7 типовых штаммов бифидобактерий следующих видов: В. angidatam, В. animalis, В. catemdatum, В. globosum, В. liberorum, В. magnum, В. ruminantium, и типовые штаммы двух видов лактобактерий {Lactobacillus acidophilus, L. plantarum) для использования в качестве контрольных организмов при разработке специфичных для Bifidobacterium spp. ПЦР - систем. С той же целью использовали ДНК Candida albicans и Escherichia coli, предоставленную лабораторией молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ РАСХН.
Бифидобактерии культивировали по стандартной методике [10]. Видовое определение проводили на основе биохимических тестов АНАЭРОтест 23 (PLIVA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия), арі 50 СН (bioMerieux, Франция). Микробные культуры отмывали забуференным физиологическим раствором, по оптическому стандарту мутности (bioMerieux, Франция) доводили до концентрации 10-10 КОЕ/мл, замораживали при -20С для хранения и транспортировки.
Штаммы бифидобактерии, выделенные из фекальных масс детей раннего возраста. Чистые культуры 30 штаммов бифидобактерии, выделенных из кишечника 11 детей раннего возраста, были любезно предоставлены для видовой идентификации Жиленковой О.Г.
Характеристика выборки детей раннего возраста. Дети были в возрасте 1-18 месяцев на момент забора проб на анализ. Мамы наблюдавшихся детей были клинически здоровы, нарушений во время беременности отмечено не было, роды срочные. Все пациенты были признаны клинически здоровыми, с рождения находились на грудном вскармливании и далее на смешанном питании по возрасту. Из 11 детей при первичном бактериологическом обследовании у 4 детей бифидофлора не была выявлена. Этим пациентам был проведен двухнедельный курс синбиотикотерапии препаратом Бифидум-Мульти-1 по 5 доз дважды в день. Через 10 дней и через 2 месяца после окончания терапии фекальные массы детей были вновь взяты на анализ.
Получение первичных изолятов. Образец фекальных масс в количестве 1 г растворяли в 10 мл физ. раствора, проводили серию десятикратных разведений в среде для выделения и культивирования бифидобактерии (производства НИИ Прикладной микробиологии г. Оболенск). Посевы культивировали при температуре 37,0±1,0 С в течение 48 ч. Из пробирок с разведением 10"8 -10"10 отбирали единичные колонии, характерные для бифидобактерии. Дальнейшие десятикратные разведения отобранных колоний с одновременным контролем морфологии клеток посредством микроскопии проводили до получения чистых культур бифидобактерии. Бифидобактерии культивировали по стандартной методике [10].
Разработка методики видового типирования
Первым этапом работы стал анализ литературы по филогении микроорганизмов и таксономии бифидобактерий с целью выбора мишеней для видового типирования. Как было обосновано в литобзоре, в качестве первой мишени для различения штаммов пяти видов бифидобактерий: В. adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. infantis и В. longum был выбран традиционный для таксономических исследований информационный ген 16S рРНК
При выборе второй мишени главной задачей была дифференциация близкородственных видов В. longum и В. infantis, неразличимых по мишени 16S рДНК, а также наличие гена в одной копии в геноме бифидобактерий. что дает дополнительные возможности при идентификации штаммов бифидобактерий с применением клонирования фрагментов данного гена. Для определения возможностей мишени операционного гена tal было проведено выравнивание всех доступных в GenBank 11 последовательностей фрагмента гена tal 9 видов бифидобактерий, секвенированных группой Requena et al. [92].
Как показал анализ выравнивания и построенного на его основании древа гомологии (рис.3.1). анализируемый фрагмент гена tal длиной 301 п.н. позволяет достоверно различать близкородственные виды В. longum и В. infantis (гомология 89-94%). а также большинство видов группы В. adolescentis. Сходство последовательностей tal В. adolescentis DSM 20083 и В. catenulatum DSM 20103 составило 93%, В. adolescentis и В. pseiidocatenulatum АТСС 27919 - 90%, В. adolescentis и В. angulatum АТСС 27535 — 93%, В. catenulatum и В. pseudocatenulatum — 89%. Последовательности В. catenulatum DSM 20103 и В. angulatum оказались полностью идентичными (сходство 100%).
Таким образом, типироваыие по фрагменту гена tal позволяет отличить В. infantis от В. longum, В. catenulatum от В, pseudocatenulatum и В. adolescentis, но не различает виды В. catenulatum и В. angulatum.
Итак, в качестве мишеней для генотипирования бифидобактерий были выбраны информационный ген 16S рРНК и операционный ген трансальдолазы (tal), являющийся однокопийным геном [92].
Выбор области для анализа, создание родоспецифичной ПНР - системы на основе фрагментов генов 16S рРНК и tal
Следующим этапом работы стал выбор анализируемой области.
По гену 16S рРНК с помощью программы ClustalW Multiple Sequence Alignment было проведено множественное выравнивание и оценена гомология всех представленных в GenBank последовательностей. Данная мишень достаточно консервативна в пределах рода Bifidobacterium, но содержит и непротяженные вариабельные участки, так называемые области вариабельности V1-V9, выделенные Stackebrandt Е. et al. [118]. Общее сходство последовательностей по интересующим 5 видам бифидобактерий составило 90-100%.
Далее на консервативные регионы гена 16S рРНК были подобраны праймеры (с 164 по 534 основание по гену 16S рРНК Е. coli) таким образом, что внутри амплифицируемого участка находилась область вариабельности V3 (по Stackebrandt Е. et al. [118]), наиболее изменчивая в пределах рода Bifidobacterium. Размер выделенной области гена 16S рРНК показал незначительные отличия по видам бифидобактерий и составил 351-356 п.н.
По гену tal для анализа был взят фрагмент длиной 301 п.н. (с 588 по 889 основание по гену tal В. infantis АТСС 15702), выбранный группой Requena et al. [92]. Он является вариабельным для Bifidobacterium spp. и фланкирован консервативными регионами, на которые были заложены праймеры. Общее сходство последовательностей по интересующим 5 видам бифидобактерий составило 88-98%.
Следующим этапом работы стала отработка методики выделения ДНК из чистых культур бифидобактерий и контрольных микроорганизмов, подбор компонентов для специфичных ПЦР - систем и оптимизация условий реакции, проверка систем на специфичность.
При постановке ПЦР не было отмечено ни одной ложно-положительной перекрестной реакции. Показано, что специфический продукт расчетного размера с праймерами на мишени 16S рРНК и tal амплифицируется исключительно на ДНК бактерий рода Bifidobacterium. Ампликоны получены с ДНК штаммов бифидобактерий, относящихся к 12 видам (В. adolescentis, В. bifidum, В. breve, В. infantis, В. longum, В. angulatum, В. animalis, В. catenulatum, В. globosum, В. liberorum, В. magnum, В. ruminantium). Постановка ПЦР с ДНК контрольных организмов, входящих в состав микрофлоры кишечника человека и сельскохозяйственных животных,— представителями других родов эубактерий {Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum) и дрожжеподобного грибка Candida albicans - дала отрицательные результаты.
Ряд ПЦР - фрагментов генов 16S рРНК и tal представлен на рисунках 3.2 и 3.3. На электрофореграмме 3.2 видно, что ампликоны ожидаемого размера получены исключительно для штаммов рода Bifidobacterium: В. adolescentis FHHMB 40 и В. adolescentis FHHMB 75-13, В. bifidum FHHMB 536 и В. bifldum FHHMB 791, Я breve FHHMB 23, В. infantis FHHMB 73-15 и В. infantis FHHMB 302.87. В. longum FHHMB 379 и В. longum FHHMB Ya-3, В. animalis. На дорожках 7, 8, 12 (С. albicans, L. plantarum, E. coli, соответственно) специфическая полоса отсутствует, то есть реакция не проходит с ДНК контрольных организмов, и ПЦР -система является специфичной для Bifidobacterium spp. На рис. 3.3 на примере амплификации фрагмента tal типовых штаммов В. catemdatum и В. ruminantium показано, что разведение ДНК способствует синтезу исключительно специфического продукта в ПЦР.
