Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Ризобактерии рода Pseiidomonas. Функционирование в системе растения - фитопатогены 14
1.1.1. Антагонистическая активность PGPR Pseiidomonas 15
1.1.2. Метаболиты псевдомонад - агентов биологического контроля фитопатогенных грибов
1.1.2.1. Синтез антибиотиков 1 8
1.1.2.2. Продукция сидерофоров
1.1.3. Синтез фитогормонов PGPR Pseiidomonas 35
1.1.4. Биопрепараты на основе бактерий рода Pseiidomonas
1.2. Свойства метаболитов бактерий рода Pseiidomonas, обладающих фунгицидиой активностью 47
1.3. Механизмы комплексообразования метаболитов бактерий с органическими соединениями и ионами металлов 55
1.4. Оптимизация условий культивирования бактерий рода Pseiidomonas
1.4.1. Условия культивирования, питательные среды для бактерий рода Pseiidomonas - продуцентов метаболитов с фунгицидиой активностью 66
1.4.2. Математическое моделирование для оптимизации условий культивирования микроорганизмов 72
2. Объекты и методы исследований 78
2.1. Объекты исследований 78
2.2. Условия хранения псевдомонад 79
2.3. Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов 79
2.4. Определение динамики роста бактерий в средах с различными источниками углерода
2.5. Изучение условий культивирования, влияющих на биосинтез метаболитов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью 80
2.6. Оптимизация ферментационной питательной среды и условий культивирования псевдомонад 81
2.7. Приготовление автолизатов дрожжей 85
2.8. Определение содержание белка в дрожжевом автолизате 85
2.9. Определение массовой доли азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в дрожжевом автолизате 85
2.10. Определение массовой доли общего азота в дрожжевом автолизате 86
2.1 1. Выделение метаболитов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью 87
2.12. Определение рЫ - стабильности и
термостабилы-юсти низкомолекулярных фракций метаболитов Pseiidomonas 88
2.13. Методы изучения состава и структуры метаболитов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной и фитогормональной активностью 88
2.14. Определение антигрибной активности штаммов Pseiidomonas и их метаболитов, обладающих фунгицидной активностью 89
2.15. Определение спектра антагонистического действия культур Pseiidomonas 90
2.16. Определение фитогормональной активности метаболитов Pseiidomonas 91
2.17. Исследование комплексообразования метаболитов Pseiidomonas с экссудатами растений 91
2.18. Исследование комплексообразования метаболитов Pseiidomonas с ионами металло 93
2.19. Статистическая обработка результатов 94
3. Структура и свойства экзометаболитов pseiidomonas, обладающих фунгицидной и фитогормональной активностью 95
3.1. Способность штаммов Pseiidomonas к росту и их
антигрибная активность в средах с различными источниками углерода 95
3.2. Влияние условий культивирования на биосинтез
низкомолекулярных метаболитов штаммами бактерий Pseiidomonas 103
3.2.1. Влияние углеродного и азотного питания на фунгицидную активность штаммов Pseiidomonas 103
3.2.2. Влияние температуры культивирования на фунгицидную активность штаммов Pseiidomonas 106
3.3. Динамика процессов периодического роста и образования антибиотических веществ штаммами Pseiidomonas 107
3.4. Определение состава низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseiidomonas 109
3.5. Ill гамм Pseiidomonas chlororaphis ИБ 6 продуцент цитокининов 1 12
3.6. Характеристика физико-химических свойств низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseiidomonas 1 16
3.7. Выделение метаболитов штаммов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью, оценка их чистоты и гомогенности 1 18
3.8. Определение молекулярной массы метаболитов штаммов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью 122
3.9. Аминокислотный и элементный составы метаболитов штаммов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью 123
3.10. И К- и ЯМР С- спектроскопия метаболитов штаммов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью 125
3.1 1. Ферментативный гидролиз метаболитов штаммов Pseiidomonas, обладающих фунгицидной активностью 129
3.12. Антигрибная активность триглицеридпептидов Pseudomonas 13 1
3.12.1. Характеристика антигрибной активности триглицеридпептидов псевдомонад в средах с различными источниками углерода 131
4. Комплексообразование триглицеридпептидов pseudomonas с экссудатами растений и ионами металлов 135
4.1. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas спектрофотометрическими методами 136
4.1.1. Определение комплексных соединений методом Бснта-Френча 136
4.1.2.Определение комплексных соединений методом изомолярных серий 139
4.2. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas поляриметрическим методом 142
4.3. Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas полярографическим методом 149
5. Культивирование бактерий рода pseudomonas, обладающих фунгицидыой активностью 1 54
5.1. Оптимизация питательных сред при культивировании бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью 154
5.1.1. Дрожжевой автолизат - компонент питательной среды 1 55
5.1.2. Получение математических моделей для трёх штаммов Pseudomonas 158
5.1.3. Определение оптимального состава питательных сред для культивирования бактерий Pseudomonas 162
5.2. Оптимизация условий культивирования трех штаммов Pseudomonas 169
5.3. Оценка антигрибной активности штаммов Pseudomonas, выращенных в оптимальных условиях 1 71
5.4. Изучение параметров культивирования штамма Pseiidomonas chlororaphis ИБ 5 1 в периодических и непрерывных условиях 175
5.5. Питательные среды для промышленного культивирования псевдомонад и экономический эффект от использования новых сред 1 82
Заключение 186
Выводы 188
Практические предложения и рекомендации 190
Список литературы
- Метаболиты псевдомонад - агентов биологического контроля фитопатогенных грибов
- Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов
- Характеристика физико-химических свойств низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseiidomonas 1
- Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas поляриметрическим методом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Бактерии рода Pseudomonas - одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов и обладающих совокупностью полезных для растений свойств (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Боронин, 1998; Логинов и др., 2001; Weller, 1988; Dowling & O’Gara, 1994; Bloemberg & Lugtenberg , 2001; Whipps, 2001).
Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации. В свою очередь, ризосферные бактерии обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений.
Одним из факторов, позволяющих воздействовать на фитопатогенные микроорганизмы, заселяющие ризосферу растений, является продукция бактериями различных низкомолекулярных веществ, таких как сидерофоры и антибиотики. За последнее десятилетие учеными обнаружены и выделены новые метаболиты бактерий рода Pseudomonas, обладающие фунгицидной активностью, такие как фураноны, аеругин, меркапто-4-формилкарбостирил и др. (Shoji et al., 1990; Sokol et al., 1992; Lee et al., 1994; Jiao et al., 1996; Moon et al., 1996; Gamard et al., 1997; Suzumura et al., 1997; Thrane et al., 1999; Nielsen et al., 1999; Nielsen et al., 2000; Paulitz et al., 2000; Kim et al., 2000; Fakhouri et al., 2001; Sorensen et al., 2001; Quail et al., 2002; Lee et al., 2003), что в какой-то мере можно связать с привлечением новых физико-химических методов анализа. Эти антигрибные метаболиты имеют различную химическую структуру и некоторые из них обладают способностью к комплексообразованию с экзометаболитами растений, образуя с ними стабильные комплексы, недоступные для использования фитопатогенами, что приводит к ограничению их роста. Однако эта способность для метаболитов бактерий рода Pseudomonas практически не изучена. В тоже время, установление механизмов действия метаболитов бактерий рода Pseudomonas на фитопатогены необходимо для разработки эффективных способов защиты растений.
С другой стороны широкомасштабное использование в сельском хозяйстве биопрепаратов на основе ризосферных бактерий рода Pseudomonas сдерживается отсутствием стандартных технологий их производства. Нужно отметить, что при производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для практического использования в агробиотехнологии одной из главных проблем является высокая стоимость питательной среды.
Использование для оптимизации параметров технологии производства биопрепаратов в качестве методического аппарата методов математического планирования эксперимента позволяет не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий исследователей процесс, но и количественно оценить степень этого влияния. Что в итоге позволит производить высокоэффективные биопрепараты с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностями даже с использованием в качестве компонентов сред вторичного сырья, например, автолизатов отработанных пивных дрожжей.
Учитывая, что потребность сельского хозяйства в средствах защиты растений увеличивается с каждым годом, проблема совершенствования технологии биологической защиты растений также представляется актуальной.
Цель исследования. Целью работы явилось определение биологической роли экзометаболитов бактерий рода Pseudomonas в их взаимодействии с фитопатогенными грибами, установление их химической природы, а также разработка технологии промышленного культивирования псевдомонад для производства сельскохозяйственных биопрепаратов на их основе.
Задачи исследования:
1. Выделить биологически активные метаболиты исследуемых штаммов Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, P. chlororaphis ИБ 6 и P. putida ИБ 17, исследовать их физико-химические свойства, определить состав и структуру.
2. Изучить способность комплексообразования метаболитов штаммов Pseudomonas с различными углеводами, органическими кислотами и аминокислотами, входящими в комплекс экссудатных выделений корней растений, а также с катионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия, свинца.
3. Установить стехиометрические составы комплексов метаболит : экссудат, метаболит : катион. Оценить комплексообразующую способность триглицеридпептидов бактерий рода Pseudomonas как одного из механизмов их ингибирующего воздействия на фитопатогены.
4. Выявить условия максимальной продукции цитокининов штаммом бактерий P. chlororaphis ИБ 6 в зависимости от состава питательной среды, определить их химическую структуру.
5. Изучить влияние условий культивирования и отдельных компонентов питательной среды на накопление биомассы и продукцию метаболитов штаммами Pseudomonas. Определить оптимальный состав ферментационных сред для культивирования штаммов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.
6. Оптимизировать условия периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas.
Научная новизна.
Впервые показана способность триглицеридпептидов псевдомонад образовывать межмолекулярные комплексы с компонентами, входящими в корневые экссудаты растений: углеводами, органическими кислотами, аминокислотами, тем самым, лимитируя по субстрату фитопатогены. Установлено, что процесс комплексообразования триглицеридпептидов и компонентов экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений.
Впервые показано, что метаболиты псевдомонад способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца.
Разработаны новые питательные среды (Патент РФ № 2303061, 2007) и технологии промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.
Практическая значимость.
Определены условия максимальной продукции и активности метаболитов фунгицидной природы Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений.
Разработаны новые экономичные питательные среды и подобраны оптимальные условия для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для защиты сельскохозяйственных растений.
Установленная комплексообразующая способность метаболитов бактерий Pseudomonas с ионами металлов позволяет рекомендовать применение препаратов на их основе для снижения загрязнения почв.
Основные положения, выносимые на защиту:
- исследуемые штаммы Pseudomonas spp. синтезируют новые экзометаболиты, обладающие фунгицидной и фитогормональной активностью;
- комплексообразование триглицеридпептидов с компонентами экссудатов растений является одним из механизмов, ограничивающих развитие фитопатогенов в ризосфере сельскохозяйственных растений;
- триглицеридпептиды способны к образованию ассоциатов различного стехиометрического состава с ионами тяжелых металлов: меди, цинка, кадмия и свинца;
- новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов сельскохозяйственного назначения на основе бактерий рода Pseudomonas с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток;
- технология промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на ХV, XIX и XX Международных научно-технических конференциях «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002, 2006, 2008), I и II Международных конгрессах «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология – 2003» (Пущино, 2003), IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), . IV Всероссийской научной internet-конференции (Уфа, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008), 5-м Всероссийском научно-практическом совещании-семинаре, (Анапа, 2008), Международной научно-технической конференции «Китайско-российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» (КНР, Харбин – Санья, 2008).
Публикации. По материалам работы опубликовано 34 научных работы, в том числе 16 работ в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора. Все результаты, представленные в работе, получены при непосредственном участии автора в период с 1999 по 2011 г. Планирование и проведение экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследований, экспериментальную часть (три главы), заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 335 ссылок. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста и содержит ____ рисунков и _____ таблиц.
Метаболиты псевдомонад - агентов биологического контроля фитопатогенных грибов
Устойчивость растений к заболеваниям, вызываемым почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами. Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ними прочные ассоциации как внутри корневых тканей, так и на корневой поверхности (ризоплане), а также в почве, непосредственно окружающей корни (ризосфере). В ризосфере в отличие от свободной от корней почвы доминируют грамотрицательные бактерии, причем преобладают бактерии рода Pseudomonas (Воронин, 1998; Ligon et al., 2000; Danhorn, Fuqua, 2007). способны к синтезу целого ряда соединений, стимулирующих рост растений. Стимуляторы роста растений, образуемые псевдомонадами, представлены фитогормонами, такими как ИУК (индолил-3-уксусная кислота) и цитокинины. Кроме того, некоторые штаммы псевдомонад способны улучшать азотное и фосфорное питание растений.
В некоторых публикациях авторы отмечают наличие положительного комплексного действия на растение со стороны бактерий-антагонистов. Речь идет не только о биологическом контроле почвенных инфекций, использование культур штаммов-антагонистов способствует также индукции системной устойчивости растений, благоприятствует раннему росту и увеличению урожая сельскохозяйственных культур (Свешникова и др., 2003; Zehnder el al., 2001; Haas, Defago, 2005).
Известно, что бактерии рода Pseudomonas обладают целым рядом механизмов, определяющих их способность ингибировать развитие почвенных фитопатогенов: это, в первую очередь, синтез антифунгальных метаболитов, конкуренция за питательные субстраты и поверхность корней, а также индукция защитных систем растений.
К настоящему времени в литературе описано множество штаммов псевдомонад, обладающих антагонистическими свойствами в отношении широкого круга фитопатогениых грибов и бактерий. Очень хорошо эти данные представлены в монографии О.Ы. Логинова (2005).
В качестве фигурантов с точки зрения антагонизма к фитопатогенным грибам выступают псевдомонады в основном следующих видов: P. cepacia (Гарагуля и др., 1989; Додатко и др., 1989;), P. putida (Gordon-Lennox ct а!.. 1987; Liao, 1989; Osburn et al. 1989; Sikora ct al., 1990; Renato de Freitas, Germida, 1991), P. fluorescens (Rhodes, Logan, 1986; Canesan, Gnanamanickam, 1987; Savithiry, Gnanamanickam, 1987; Levy et al., 1989: Novotna, 1990: Elsherif, Grossmann, 1991; Tosi, Za/zerini, 1994; Liang et al.. 1996), P. solanacearum (Toyoda et al., 1988; Tsuyumu et al., 1989).
Объекты воздействия псевдомонад-антагонистов очень разнообразны: Gaeumannomyces gramim s (Weller et al., 1989; Zaspel, 1989), Rhizoctonia solum (Canesan, Gnanamanickam, 1987; Savithiry, Gnanamanickam, 1987; Renato de Freitas, Germida, 1991), Phomu lingam (Novotna, 1990). Fusurium uvenaceum (Novotna, 1990), Pythium ultimitm (Osburn et al. 1989; Pietr, Kempa. 1989; Sikora et al., 1990; Sugimoto et al., 1990), Plasmodiophora brussicue (Elsherif, Grossmann, 1991), Sclerotium rolfsii (Canesan, Gnanamanickam, 1987; Savithiry, Gnanamanickam, 1987), грибы родов Penicillium и Botrytis, поражающие плоды фруктовых растений в послеуборочный период (Janisiewicz, Yourman, 1989; Мао, Cappellini, 1989; Wilson, Chalutz, 1989; Sobiczewski, Bruk, 1999)
Стоит отметить и более свежие публикации по антагонизму псевдомонад. Гак холодоустойчивые изоляты Pseiidomonas Jluorescens Pf-102, PJ-/03. Pf-110 и PJ-173. выделенные из ризосферы гороха, обладали фунгистатическим и литическим действием в отношении фитопатогенного гриба Fusarium soloni, вызывающего гибель гороха (Garg el al., 2005).
В условиях гидропоники на минеральном тепличном субстрате Л.В. Кравченко с соавторами (2006) изучали антифугальную активность штаммов P. Jluorescens SPB2137 и P. chlororaphis SPB12I7 в ризосфере огурцов. Наблюдения показали что, численность грибов в контроле в 2 раза выше, чем в варианте с инокуляцией штаммом SPB2137.
При исследовании совместного развития Fusarium culmorum и Pseiidomonas Jluorescens в почве было установлено ингибирующее действие P. Jluorescens на развитие вегетирующих структур гриба (Струнникова и др. 2007).
В двухлетнем микрополевом опыте изучали влияние инокуляции растений сахарной свёклы бактериями P. Jluorescens 20 и P. pulida 23, а также смешанной культурой этих бактерий на урожайность. Прибавка урожая корнеплодов сахарной свёклы и содержание водорастворимых Сахаров при инокуляции P. Jluorescens 20 составила 37-38% и 38-41% соответственно, а при инокуляции P. putida 23 составила 44-48%) и 67%. (Шабаев, 2008).
Исследователями предложены биологические методы борьбы с фузариозами растений с использованием бактерий рода Pseiidomonas. Исследована ангифунгальная активность концентрированной культу рал ьной жидкости бактерий P. solanacearum, и отмечена возможность ее использования для борьбы с фузариозным вилтом томатов (Кравченко и др., 2003; Коршунова и др., 2007; Danhorn, Fuqua, 2007; Matthijsetal., 2007).
Был исследован противомикробный эффект Pseudomonas CUY8 в отношении ряда патогенных грибов {Saccharomvces cerevisiae, Rhodotorula hacarum, Mucor circinelloides, Rhizopus apicuhttus. Penicillium charlesii, Aspergillus niger) (Yan Wang Dag el al, 2007).
Также некоторые штаммы псевдомонад проявляют нематоцидную активность (Смирнов с соавт., 1999; Мс Laughlin et al., 1989; Мс Laughlin, Sequeira, 1988; Ali Siddiqui et al., 2001).
Антагонисты p. Pseudomonas отличаются широким спектром антагонистической активности (Hasegawa et al. 1987; Conway et al. 1989; Liao, 1989; Sbrana et al., 2000; Schouten et al., 2004; Ahmadzadeh et al., 2006), обладают свойствами комплексного воздействия как на фитопатоген, так и на растение (ускоряют рост и увеличивают урожай сельскохозяйственных культур) (Becker et al., 1990) и могут рассматриваться в качестве потенциальных агентов биологической защиты (Кузьмина и др., 2003; Danhorn, Fuqua, 2007).
Таким образом, среди бактерий рода Pseudomonas встречаются антагонисты различных грибных и бактериальных фитопатогенов, в многочисленных опытах получено подтверждение тому, что бактерии-антагонисты рода Pseudomonas могут использоваться для снижения и предотвращения заболеваний растений. Очевидно, что наиболее перспективными для практического использования следует считать штаммы-антагонисты с широким спектром антимикробной активности
Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов
Известно, что бактерии рода Pseudomonas способны к ассимиляции индивидуальных легколетучих н-алканов от гексана до декана, а также к синтезу некоторых биологически активных веществ на средах, где смесь лёгких парафинов являлась единственным источником углеродного питания.
Многие виды Pseudomonas развиваются на богатых средах сложного состава: бульонах мясопептонных и рыбных, на кукурузном экстракте, картофельном соке (Межераупе, 1978). Но для культивирования Pseudomonas с целью получения антибиотических веществ, как правило, требуются среды богатые органическими формами азота и углевода.
В 50-х годах прошлого века King et al. (1954) предложили среду для определения образования флюоресцирующих пигментов; в дальнейшем и до наших дней эта среда Кинг В, в состав которой входят глицерин, пептон, К2НРО,ь MgS04, является одной из основных для культивирования Pseudomonas - продуцентов веществ с фунгицидной активностью. В последнее время предпринимаются попытки по модификации этой среды, как, например, в работе Lee et al. (2003), где проводится количественное изменение соотношения глицерин : пептон.
Реже используются также богатые среды - такие, как среда LB и питательные бульоны с добавлением 0,5-1,0% источника углевода (обычно глюкозы) (Katoh, Itoh, 1983; Gould al., 1985; James, Gutterson, 1986).
Автолизаты и гидролизаты пивных дрожжей обладают сильным биостимулирующим эффектом, поэтому чаще всего их применяют в качестве добавок к питательным средам для увеличения скорости роста при культивировании дрожжей и других микроорганизмов. Гидролизаты и автолизаты содержат продукты гидролиза белков, сахара, нуклеиновые и другие биологически активные соединения. Дрожжевые гидролизаты широко применяются в качестве источника витаминов (в первую очередь В1 и В2, а также РР, ВЗ, В4, В6, Н), незаменимых аминокислот и жирных кислот в медицине, в микробиологии при составлении питательных сред. Автол изаты и гидролизаты пивных дрожжей получают из отходов пивоваренного производства, в частности из отработанных пивных дрожжей. Отработанные пивные дрожжи 7-8 генерации не используются в производстве пива, так как клетки таких дрожжей уже не способны к осуществлению своей основной функции в процессе брожения; они также утрачивают и способность к размножению, но могут использоваться в качестве дешевого источника азота, замены пептона, в средах для культивирования псевдомонад.
Однако, как показано в работе Квасникова с соавт. (1975), штаммы P. aurantiaca способны к синтезу веществ с фунгицидной активностью не только на богатой среде Кинга, но и на синтетической среде Мюнца в атмосфере низкомолекулярных //-алканов (Сб Сщ). Также показано, что способность этих штаммов к образованию антибиотических веществ стабильна и сохраняется на протяжении 10 - 15 лет лабораторного культивирования.
Синтез пиоцианина P. aeruginosa начинается в стационарную фазу роста. На среде с глицерином в качестве источника углерода, лейцином и аланином в качестве источника азота и определенным уровнем содержания магния и фосфора выход пиоцианина достигает максимальной концентрации (MacDonald, 1967; Leisinger, Margraff, 1979). Лимитирование фосфатами вызывает синтез пиоцианина. Низкий уровень фосфатов в конце экспоненциальной фазы является триггером синтеза пиоцианина. Повышение концентрации фосфатов останавливает синтез (Martin, 1977; Martin el al., 1992).
Достаточно хорошо изучен синтез антибиотиков феназиновой природы на средах, где їв качестве единственного источника углевода фигурировал w-алкан, что было показано для пиоцианина (Поморцева, 1965), феназин-1 -карбоновой кислоты (с октадеканом, гексадеканом и тетрадеканом) (Higashihara, Sato, 1969) и оксихлорорафина (с октадеканом) (Ogata etal., 1971).
Из работы Ohmori et al. (1978) видно, что в значительных количествах синтезируется бактериями на средах с я-парафинами и пиолютеорин.
Higashihara, Sato (1985) получили феназин-1-карбоновую кислоту из штамма P. aeruginosa, источником углерода для которой служил этанол.
Duffy, Defago в своих работах (1997, 1999) показали влияние источника углерода и минерального состава питательной среды на биосинтез диацетилфлороглюцина, пиолютеорина, пирролнитрина и сидерофора пиохелина, продуцируемых штаммом P. fhiorescens СНАО. Секреция флороглюцина стимулировалась наличием в питательной среде ионов Zn ", NH4M0 " и глюкозы, биосинтез пиолютеорина стимулировался ионами Zn ", Со и глицерином, но в то же время подавлялся глюкозой, а выход антибиотика пирролнитрина увеличивался на средах с фруктозой, маннитолом в присутствии смеси ионов Zn " и NHjMo , синтез же сидерофора пиохелина стимулировался ионами Со " и источниками углерода, такими, как фруктоза, маннитол и глюкоза. Эти закономерности сохранялись и для других 41 штамма этого вида, менее продуктивных по количеству синтезируемых антибиотиков. В этой работе также показано, что неорганические фосфаты ингибируют синтез флороглюцина, а секреция других антибиотиков уменьшается незначительно.
Внесение в питательную среду таких ионов, как Си , Mn", Li , Fe ", Mg , Са ", В " не играет значительной роли в биосинтезе.
Slininger, Jackson (1992) также отмечают стимулирующее действие ионов Zn " на производство феназин-1-карбоновой кислоты.
Синтез феназиновых антибиотиков начинается в стационарную фазу роста. На среде с глицерином в качестве источника углерода, лейцином и аланином в качестве источника азота и определенным уровнем содержания магния и фосфора выход феназинов достигает максимальной концентрации (MacDonald, 1967; Leisinger, Margraff, 1979). Лимитирование фосфатами вызывает синтез феназинов. Низкий уровень фосфатов в конце экспоненциальной фазы является триггером синтеза феназинов. Повышение концентрации фосфатов останавливает синтез (Martin, 1977; Martin etal., 1992).
Псевдомонады обычно не требовательны к аминокислотному составу питательных сред, за исключением P. maltophilia, которые нуждаются в метионине (Clarke, Ornston, 1975).
Многие аминокислоты могут быть единственным источником углерода и азота. P. putida может расти на среде с любой из 18 аминокислот. P. aeuroginosa может использовать как источник азота метионин, треонин и цистеин (Рубан, 1986).
Изучение динамики синтеза ИУК и условий, оптимальных для накопления в среде максимума гормона, показало, что синтез фитогормона псевдомонадами стимулируется добавлением в среду триптофана или триптамина и подавляется ионами аммония (Мордухова с соавт., 1991). Выращивание в периодическом режиме продуцентов ИУК ризосферных бактерий P. fluorescent 20 и P. putida 23 выявило два максимума в накоплении ИУК, соответствующих 9 и 40 ч культивирования (Олюнина, Шабаев, 1996, Joseph et al., 2007).
Большое влияние на синтез антибиотиков оказывает аэрация в процессе культивирования. Как правило, культивирование псевдомонад с целью получения антибиотиков фунгицидной природы проводят в течение 48-72 ч (исключение составляет синтез антибиотика аеругина - 6 суток (Lee et al., 2003) при температуре 24-28С в условиях аэрации. И так же, как правило, максимальный рост фунгицидной активности наблюдается в стационарную фазу.
Характеристика физико-химических свойств низкомолекулярных фракций метаболитов штаммов Pseiidomonas 1
Температурный оптимум и термостабильность. Максимум активности для изучаемых метаболитов штаммов Pseudomonas наблюдался в диапазоне температур 25 - 60С (рис. 3.11, а), при температуре 70С происходила значительная термоинактивация, но при этом 20 — 25 % от начальной активности у штаммов P. chlororaphis оставалось даже после инкубации при температуре 100С. Такая картина может быть обусловлена наличием во фракциях двух компонентов, обладающих фунгицидной активностю, один из которых имеет пептидную природу и денатурирует при температуре, выше 60С, а второй - антибиотик феназиновой природы в следовых количествах, нехарактерный для вида P. putida. рН-стабильность. В интервале рН 6-9 уровень фунгицидной активности ЫМ фракций метаболитов штаммов Pseudomonas оставался максимальным и стабильным (рис. 3.11, б), критическими точками стабильности являлись значения рН 4 и рН 11, после которых активность падала больше, чем в два раза.
Выделение метаболитов штаммов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью, оценка их чистоты и гомогенности
В задачу данного этапа входила разработка оригинальной методики выделения метаболитов, так как методики для выделения известных метаболитов бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью, в нашем случае не подошли. Разработанная схема выделения и этапы очистки представлены на рис. 3.12 и в табл. 3.6. Схема выделения метаболитов с антигрибной активностью включала в себя стадии центрифугирования, ультрафильтрации, концентрирования, осаждение примесей и осаждение метаболитов. Центрифугирование КЖ. Стадия удаления микробных клеток из КЖ - общая стадия для всех методик по выделению экзоцеллюлярных антибиотических веществ. Ультрафильтрация на модулях волоконного типа. Стадия избавления от высокомолекулярных соединений. Ультрафильтрации подвергаются супернатанты со стадии центрифугирования КЖ с отбором фильтратов, заведомо содержащих низкомолекулярные фракции ( 3 кДа) внеклеточных метаболитов.
Эти фракции содержали 6-11 компонентов, причем, как было показано выше, антигрибной активностью обладал только один компонент каждой фракции.
Концентрирование ультрафильтрата. Эта стадия проводилась путем упаривания фильтрата на вакуумном роторном испарителе при 35С. Степень концентрирования 20 раз.
Осаждение примесей. На этой стадии проводили осаждение солей и других остатков питательной среды в концентрате метанолом до 60 % насыщения с дальнейшим их отделением центрифугированием и отгонкой метанола из супернатанта под вакуумом. Эту стадию проводили двухкратно.
Осаждение метаболитов, обладающих фунгицидной активностью. Заключительная стадия выделения, на которой из супернатанта предыдущей стадии, изучаемые вещества осаждали ацетоном. На этой стадии также происходит освобождение от антибиотиков феназиновой природы за счет их растворимости в ацетоне.
В результате применения разработанной оригинальной методики выделения в хроматографических профилях элюции выделенных метаболитов присутствовал лишь один пик (рис. 3.7, г), по времени выхода соответствующий пикам компонентов, обладающих антигрибной активностью, причем время выхода активного компонента для каждого из штаммов Pseudomonas достоверно не отличалось.
Осаждение ацетоном P. chlororaphis И1351 8,1 72,50 5,873 3000 510,812 P. chlororaphis ИІ36 9,2 57,82 5,319 3067 576,612 P. pulida И1317 8,8 58,88 5.181 2933 566,107 Ниже суммированы результаты, полученные в ходе работы над идентификацией выделенных метаболитов штаммов P. chlororaphis ИБ 51, P. chlororaphis ИБ 6 и P. putida ИБ 17 и изучения биологической роли данных метаболитов в проявлении активности исследуемых штаммов по отношению к фитопатогенным грибам.
Определение молекулярной массы метаболитов проводили при помощи эксклюзионной жидкостной хроматографии с использованием маркеров молекулярной массы. В результате чего было установлено, что метаболиты штаммов Pseudomonas близки по молекулярной массе, различие составляет ± 200 Да, и их молекулярная масса варьирует в пределах 2,8 - 3,0 кДа (рис. 3.13).
Полученные величины молекулярных масс нашли подтверждение и при использовании метода определения бактериальных пептидов и белков с Мг 20 кДа, дающего достаточно достоверную информацию об их количестве в частично очищенных смесях и молекулярной массе, основанного на проведении адсорбционной ВЭЖХ с использованием сорбента Ultrasphere Si и предложенным в одной из наших работ (Логинов и соавт., 2004).
Хроматограмма метаболитов Pseudomonas с антигрибной активностью (2, время выхода 15,2±0,1 мин.) и маркеров молекулярной массы (1 - инсулин (Mr 5,8 кДа), время выхода 11,5 мин., 2 - витамин В12 (Mr 1355 Да), время выхода 17,2 мин.). (280 нм, колонка TSK G2000SW (300x7,8 мм), элюент - 0,1 М фосфат натрия, 0,3 М хлорид натрия (рН 7,0), расход 1 мл/мин).
Исходя из того, что активность изучаемых метаболитов штаммов Pseudomonas проявлялась в диапазоне температур 25 - 60С (рис. 3.1 1, а), а при температуре 70С происходила их значительная термоинактивация, можно было предположить, что метаболиты имеют пептидную природу. Это предположение было подтверждено данными аминокислотного анализа гидролизатов метаболитов. Данные аминокислотного и элементного анализов (табл. 3.7 и 3.8) также показали, что метаболиты изучаемых штаммов нендентичны по своему составу, различие составляет в одну аминокислоту, чем и определяется разница в их молекулярных массах.
Исследование комплексообразования триглицеридпептидов Pseudomonas поляриметрическим методом
Основное положительное влияние на антигрибную активность двух штаммов вида P. chlororaphis оказывает увеличение концентраций глицерина (Х) и Na2HP04x12H20 (Х-,), причем на штамм ИБ 6 дополнительное положительное влияние оказывает увеличение концентрации КН2РОХ2Н20 (Х4), а концентрация дрожжевого автолизата (Х2) соответствует оптимальному значению для штамма этого вида (т.е. изменение его концентрации в выбранных пределах не вызывает заметное, статистически значимое, изменение антигрибной активности). Несколько иначе ведет себя штамм вида P. putida, где положительное влияние на увеличение антигрибной активности оказывает увеличение концентраций автолизата (Х2), Na2HP04x 12Н20 (Х3) и КН2Р04х2Н20 (Х4). Следовательно, для достижения оптимальных соотношений источников питания в средах культивирования двух штаммов P. chlororaphis нужно повышать уровень глицерина и фосфата натрия, а в среде культивирования штамма вида P. putida нужно повышать уровень дрожжевого автолизата и фосфатов.
На основании полученных данных в ПФЭ-2 были поставлены опыты по плану крутого восхождения, в котором осуществляли одновременное изменение концентраций всех значимых факторов по алгоритму, рассчитанному точно в соответствии с величинами коэффициентов регрессии. Восхождение было начато от исходного состава среды (средний уровень ПФЭ-2 ). Таким образом, были установлены оптимальные составы питательных сред (табл. 5.4).
Антигрибная активность выращенных на данных средах штаммов Pseudomonas в 1,5 раза выше, чем в среднем варианте, в то же время титр клеток на данной среде составил 2,20 1010, 1,46 1010 и 5,00 109 КОЕ/мл культуральной жидкости соответственно для штаммов P. chlororaphis ИБ 51, P. chlororaphis ИБ 6 и P. put і da ИБ 17.
Неоценимо важное значение для растениеводства приобретает применение не столько очищенных микробных гормональных препаратов, сколько всего природного комплекса, образующегося в результате метаболизма микробной клетки, содержащего, зачастую в весьма удачных для живого организма сочетаниях, фитогормоны, витамины, аминокислоты, органические кислоты и другие необходимые для растения соединения (Мишке, 1988).
Некоторые представители бактерий рода Pseudomonas способны стимулировать рост и развитие растений, в связи с чем разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику биологических препаратов на их основе приобретает особое значение.
С помощью метода ИФА у исследуемых штаммов псевдомонад была изучена способность к синтезированию ИУК и цитокининоподобных веществ (Логинов, 2005). Все исследуемые штаммы способны к синтезу веществ, стимулирующих рост растений, причем максимальной продукцией ИУК отличается штамм P. chlororaphis ИБ 51, два других штамма ее также синтезируют, другая закономерность в синтезе цитокининоподобных веществ - максимальной продукцией отличается штамм P. chlororaphis ИБ 6, а штамм P. putida ИБ 17 не синтезирует цитокинины.
В данной работе мы попытались рассмотреть закономерности синтеза цитокининов в зависимости от состава питательной среды штаммом бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 6, являющегося объектом биологического контроля почвенных фитопатогенов и обладающего совокупностью полезных для растений свойств, такими как синтез антифунгальных антибиотиков и ростстимулирующих веществ.
При разработке питательной среды на основе автолизата отработанных пивных дрожжей с целью увеличения биомассы и антигрибной активности был реализован полный факторный эксперимент (ПФЭ) по плану 24, где в качестве 4 факторов варьирования были взяты глицерин (Х), дрожжевой автолизат (Х2), Na2HP04x12H20(X ), КН2Р04х2Н20(Х4).
Все образцы ПФЭ 24 по увеличения выхода биомассы и антигрибной активности в виде низкомолекулярных фракций, полученных при помощи ультрафильтрации, как было описано ранее (Логинов, Четвериков, 2003), проанализировали при помощи ВЭЖХ и проверили на наличие в них веществ цитокининовой природы.
Хроматографические профили образцов низкомолекулярных фракций метаболитов представлены на рис. 5.1 и содержат в зависимости от варианта эксперимента два - восемь пиков, причем один из пиков - это пик, принадлежащий веществу, обладающему антигрибной активностью. Количество пиков и их интенсивность по поглощению в ультрафиолете не коррелировали с наличием на данном варианте среды цитокининовой активности у исследуемого штамма.
Данные иммуноферментного анализа (табл. 5.5) показали, что в условиях проведенного эксперимента в варианте № 6 ПФЭ штамм Р. ch/ororaphis ИБ 6 способен синтезировать цитокинины, максимальный выход которых составляет 1117 нг/мл культуральной жидкости. Следует отметить, что степень разведения КЖ штамма в тест-системе не влияет на результаты ИФА. Т.е. количество гормонов, определяемое при разведении КЖ в 10 и в 100 раз при пересчете на мл КЖ, одинаково (в пределах ошибки).
