Содержание к диссертации
Введение
1. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ВОПРОСА 9
1.1. Особенности носителей используемых для иммобилизации биологически активных веществ . 9
1.1.1. Органические полимерные носители 9
1.1.2. Носители на основе дисперсных кремнеземов 16
1.2. Модифицирование поверхности твердых носителей макромолекулами биополимеров 21
1.2.1. Основные фракции казеина, характеристика, химический состав 21
1.2.2. Структурообразование в водных растворах казеина 24
1.3. Методы иммобилизации ферментов 28
1.4. Применение иммобилизованных препаратов. 33
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 37
2.1. Характеристика реагентов, используемых для получения композиционных сорбентов 37
2.2.Методы определения структуры сорбентов 38
2.3.Метод определения сорбционной емкости сорбентов 41
2.4. Метод определения содержания глюкозы 42
2.5. Метод определения содержания белка 43
2.6. Ферментные препараты и методы их исследований 44
2.6.1. Метод выделения уреазы из бобов сои 44
2.6.2. Метод определения активности уреазы. 45
2.6.3. Метод определения активности В-галактозидазы 47
2.7. Методы математической и статистической обработки 48
3 .СИНТЕЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ БИОСОРБЕНТОВ 49
3.1 . Получение композиционных биосорбентов 49
3.2. Способы получения биосорбентов 53
3.3. Исследование структурных характеристик биосорбента 5 8
3.4. Исследование сорбционной емкости биосорбента по иону железа (III) 68
4. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ УРЕАЗЫ Ир- ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 79
4.1. Получение препарата иммобилизованной уреазы 79
4.2.Получение и свойства препарата иммобилизованной галактозидазы 100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Особенности носителей используемых для иммобилизации биологически активных веществ
- Характеристика реагентов, используемых для получения композиционных сорбентов
- Получение композиционных биосорбентов
Введение к работе
Актуальность темы
Основные направления современной биотехнологии предусматривают разработку сорбционных материалов и дальнейшее их применение в различных областях медицины, сельского хозяйства, а также конструирование высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов, в качестве регенерируемых и специфических катализаторов.
Среди различных методов синтеза носителей для иммобилизации ферментов перспективно направление биотехнологии по получению композиционных сорбентов, основанное на химической сборке структурных единиц органической и неорганической природы (Weyl W., 1951; Leboda R., 1978; Бры-калов А.В., 1996; Ефременко В.И., 1996). Данные носители отличают стандартностью состава, исключают неспецифическую сорбцию и подверженность микробиологической атаке. В настоящее время предлагается огромный выбор биокатализаторов, которые могут быть использованы в биотехнологии и медицине в качестве энтеросорбентов, а также для селективного извлечения катионов и анионов из водных (или жидких) сред. Однако далеко не все из них отвечают вышеперечисленным требованиям. Развитие данного направления требует продолжения экспериментов с целью разработки более безопасных и экономичных препаратов.
Не менее важной остается проблема разработки высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов, нашедших применение в самых различных сферах деятельности человека (Березин И.В.,1976; Варфоломеев С.Д., 1999; Вудворд Д.,1988; ТривенМ.,1983).
В области медицины актуальной остается проблема разработки биопрепаратов по обнаружению мочевины в крови человека, с целью ранней диагностики ряда заболеваний (анемии, болезни сердца, рак и др.), сопровождающихся гиперуремией, т.е. увеличением содержания мочевины в крови.
Одной из насущных проблем сельского хозяйства является обеспеченность растений минеральным азотом, запасы которого в непосредственно
доступной растениям форме весьма ограниченны и удовлетворяются исключительно за счет участия почвенной уреазы в разложении мочевины и нитрифицирующих бактерий. Одним из путей повышения азотного плодородия почв может быть дополнительное внесение вместе с минеральным удобрением препарата иммобилизованного фермента, обладающего пролонгированным действием.
В пищевой промышленности одной из актуальных остается проблема создания безлактозных и низколактозных пищевых продуктов. Установлено, что около 10% населения страдают галактоземией, т.е. непереносимостью молочных продуктов. Данная энзимопатия обусловлена отсутствием в организме фермента Р - галактозидазы, участвующего в каталитическом расщеплении дисахарида лактозы на моносахара галактозу и глюкозу, что приводит к различным нарушениям со стороны желудочно-кишечного тракта (Рахимов К.Р., 1991). Для успешной профилактики и лечения этого заболевания необходимо исключить поступление лактозы в организм с пищей и наиболее эффективными методами получения таких продуктов являются энзиматиче-ские.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований Южного Научного Центра РАН по теме «Построение моделей высокоэффективных сорбентов биологического и медицинского назначения с заданными свойствами и функциями на основе соиммобилизованных материалов» (тема № 00-04-04 научной программы фундаментальных исследований РАН).
Цель работы и задачи исследования.
Целью настоящей работы является разработка композиционных сорбентов с заданными свойствами и создание биопрепаратов на основе иммобилизованных ферментов. Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:
разработать технологию композиционных сорбентов на основе материалов органической и неорганической природы и исследовать их состав и физико-химические свойства;
исследовать влияние модификатора поверхности - казеина - на сорбционную емкость сорбентов;
разработать методы иммобилизации ферментов с максимумом сохранения активности и стабильности;
исследовать влияние физико-химических параметров (рН, температура, кратность использования) на активность иммобилизованных ферментов.
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
Впервые разработана технология получения композиционного биосорбента методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии белкового комплекса казеина. Впервые представлены данные о влиянии концентрации модифицирующего агента казеина на структурные характеристики и сорбционную емкость биосорбента. Установлено, что увеличение массовой доли казеина уменьшает удельную поверхность в среднем в три раза, образуя высокоразвитую поверхность сорбционной матрицы, и увеличивает сорбционную емкость.
На основе разработанных биосорбентов были получены иммобилизованные препараты ферментов и исследованы их физико-химические параметры. Выбран оптимальный режим работы биопрепаратов. Для препарата иммобилизованной уреазы на кремнеземном носителе оптимальным является рН 5,4-6,0, температура 20-50С. Для препарата иммобилизованной уреазы на МКЦ оптимум рН 7,0 температура 20-30С. Полученные ферментные препараты характеризуются высокой активностью до 135%, длительном сроком хранения без уменьшения активности и многократностью использования.
Практическая ценность работы.
Получены и исследованы композиционные материалы, обладающие высокой сорбционной емкостью. Проведены испытания по использованию био-
сорбентов для экспресс-диагностики возбудителя туляремии, при этом чувствительность иммуноферментного (ИФА) и иммунофлуоресцентного (КИ-ФА) методов в 2 раза превышала чувствительность общепринятых методов, интенсивность окрашивания опытных проб в 10 раз превышала контрольные, что подтверждено актом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. Разработан и утвержден пакет нормативно-технической документации на препарат "Биосорбент" (ТУ 9229-014-02080718-02), получено положительное решение на выдачу патента «Способ получения биосорбентов» (№2002105544 от 7 марта 2002г.) по заявке и «Способ получения сорбента» (№ 2004115003 18 мая 2004г). В рамках VII Международного выставки - салона «Высокие технологии. Инновации и инвестиции» г. Санкт-Петербург 2002 г. по проекту «Сорбционные материалы в промышленности» оргкомитетом присуждена золотая медаль.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
технология получения композиционных биосорбентов с заданными свойствами на основе кремнеземной матрицы, гетерогенезированной белковым комплексом казеина. Исследование структурных характеристик;
результаты исследования влияния модификатора поверхности - казеина - на сорбционную емкость сорбентов;
разработка твердофазных каталитически активных препаратов иммобилизованной уреазы;
4) технология получения препарата иммобилизованной (3- галактозидазы.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: XIV международной научно-технической конференции «Реактив -2003» (Москва, 2003), 7-ой Пущинской школе-конференции «Биология -наука 21 века» (Пущино, 2003), II Всероссийской, научно-технической конференции, «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002), Всероссийской научной конференции, "Катализ и сорбция биотехнологии,
химии, химических технологиях и экологии" (Тверь, 2003), XVI Международной научно-технической конференции. "Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2003), VII Международной выставке - салоне «Высокие технологии. Инновации и инвестиции» (Санкт-Петербург, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, 3 глав теоретических и экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 117 работ отечественных авторов и 55 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 30 рисунками.
Особенности носителей используемых для иммобилизации биологически активных веществ
Для иммобилизации белковых молекул помимо сорбентов неорганической природы могут применяться органические носители. Органических полимерных носителей можно классифицировать по происхождению: природные и синтетические. Природные полимерные носители можно в свою очередь разделить на белковые, липидные и полисахаридные; а синтетические -на полиэфирные, полиметиленовые и полиамидные. Полисахаридные носители, к которым относятся целлюлоза, агароза и их производные, наиболее часто используются в качестве сорбентов, что объясняется их доступностью, наличием реакционно-способных функциональных групп (в исходном или модифицированном состоянии), которые легко вступают в различные химические реакции (Mathur N.K., Narang С.К. Williams R.E., 1980).
Декстран представляет собой полисахарид, линейной структуры на основе глюкозы, где звенья связаны а-1,6-глюкозидной связью (Цизин Г.И., 1993). Он является полиатомным спиртом с высокой степенью гидрофильно-сти, представляющий широкие возможности для модификации, а также химически инертный. Устойчивость к действию кислот у декстрана меньше, чем у целлюлозы, зато к щелочам гели на основе декстрана более устойчивы. Рабочий диапазон рН составляет 2-12. Существенное отличие от целлюлозы состоит в том, что нити декстрана не образуют агрегатов, т.к. они не вполне линейны, имеются достаточно многочисленные ветвления (по связям 1,2-,1,3-и 1,4). Нити декстрана химически сшитые эпихлоргидрином или диэпокси-дами макропористых полимеров - сефадексов (J.Porath, P.Flodin., 1959) используются в качестве "сефадексов" для хроматографии. Сефадексы относительно мягки и легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Все это накладывает ограничения на их использование в качестве носителей.
Агароза также является полиатомным спиртом. Ее элементарным звеном служит дисахарид агаробиоза, в состав которого входит необычный сахар -3,6-ангидро-Ь-галактоза. Из-за этого агароза более устойчива к действию микроорганизмов.
Агароза очень гидрофильна, ее нити склонны к образованию водородных связей. Благодаря этому горячий 2-6% раствор агарозы застывает в виде жесткого и очень крупнопористого геля. Нити полимера собираются в пучки и образуют жесткий пространственный каркас с пустотами внутри. Модификация агарозы может происходить по гидроксильным группам, но из-за плотно упакованных пучков нитей гидроксильные группы могут находиться внутри и быть недоступными для модификации. Рабочий диапазон рН при использовании матриц из агарозы лежит в пределах 4-9. Агарозу нельзя сушить ввиду необратимой деструкции геля.
Для повышения химической и термической стойкости матриц фирма "Pharmacia" разработала вариант гелей агарозы, в которых нити полимера дополнительно химически "сшиты" обработкой 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. При этом диапазон рН увеличился (3-14) и возросла термическая устойчивость от 100С до 120С (Янкаускайте Д.П., Дикчювене А. А., Паулюконис А.Б., 1980).
Характеристика реагентов, используемых для получения композиционных сорбентов
В качестве матрицы, у которой содержание основного вещества SiC 2 не менее 99% использовали аэросил- 380 х.ч (ГОСТ 14922-77). Аэросил - это непористый кремнезем, имеющий форму частиц близкой к сферической. Он представляет собой продукт высокотемпературного парафазного пиролиза SiCU в токе кислорода с последующей конденсацией в парах воды. Объемная фаза аэросила представлена в равной степени структурными особенностями кварца и кристоболита.
Казеин - белок молока, фосфопротеин. В чистом виде представляет собой белый аморфный гигроскопичный порошок без запаха и вкуса, нерастворимый в воде, спирте и эфире, но растворимый в некоторых органических солях.
В последнее время большое внимание уделяется использованию в качестве сорбционной матрицы неорганического материала - аэросила, в силу положительных свойств данного носителя: не набухает в желудке; имеет по-верхостно-активные группы, реакционно-способные к модификации; не токсичен; устойчив к воздействию микроорганизмов. Именно эти положительные качества аэросила дали повод для использования этого вещества в качестве сорбента для иммобилизации белковых молекул казеина.
Из материалов органической природы нами использовался неионоген-ный гидрофильный полисахарид - микрокристаллическая целлюлоза производства Lachema (Chemapol, Praha-Cechoslovakia), (СбНю05)п, с молекулярным весом (162,14)п.
Выбор микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) в качестве носителя обусловлен, прежде всего, ее доступностью и наличием реакционно-способных групп, легко вступающих в химические реакции. МКЦ - продукт модификации природной целлюлозы, получаемый путем гидролитической деструкции. МКЦ нерастворима в воде, но растворима в аммиачных растворах солей меди, отличается высокой гидрофильностью и хорошими сорбционными свойствами. МКЦ - легкосыпучий порошок белого цвета, по своим свойствам близка к природной целлюлозе, абсолютно безвредна и нетоксична.
Получение композиционных биосорбентов
Целью начального этапа исследований явилось получение сорбционных материалов для их дальнейшего использования в создании гетерогенных биокаталитических комплексов на основе иммобилизованных ферментов для их использования в медицинских целях, пищевой промышленности, в биореакторах многочисленных аналитических устройствах.
Получение биокаталитических комплексов предполагает правильный выбор носителя для иммобилизации фермента. При этом важно учитывать наличие таких положительных свойств твердых матриц как: развитая удельная поверхность, термостабильность, механическая устойчивость, достаточная для обеспечения удовлетворительных гидродинамических характеристик при эксплуатации, малое изменение объема гранул при изменении рН или ионной силы, наличие функциональных групп, пригодных для селективной химической модификации и устойчивость к воздействию микроорганизмов.
В настоящее время предлагается огромный выбор биокатализаторов, которые могут быть использованы в биотехнологии и медицине в качестве эн-теросорбентов, а также для селективного извлечения катионов и анионов из водных (или жидких) сред (Кунижев и соавт.,2001).
Так в АС 1428464 (07.10.88) представлен способ получения сорбента для выделения и очистки тромбопластина на основе макропористого кремнезема поверхность, которого модифицирована у - глицидооксипропилтриэтоксиси-ланом с последующей обработкой гидроксилсодержащим органическим соединением в среде диоксана в присутствии эфира трехфтористого бора. Недостатками способа являются применение вредных компонентов для модификации поверхности кремнезема, что не дает возможности использовать данный сорбент в качестве энтеросорбента.
Следующий способ АС 1437776 (15.11.88) получения сорбентов основан на модификации поверхности кремнезема марки "Силохром С-80" группами амидоксима с целью использования его для хроматографического разделения ионов переходных металлов. Однако данный способ требует значительных энергозатрат, связанных с длительностью и многостадииностью процесса синтеза. .
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбентов АС 1030312 (23.07.83) на основе высокодисперсного кремнезема — аэросила путем его обработки D,L - гистидином в присутствии формальдегида. Недостатками известного способа являются использование в качестве модифицирующего компонента одной аминокислоты D,L - гистидина и как следствие этого отсутствие полифункциональных свойств кремнеземного сорбента.
На данном этапе исследований перед нами стояла задача получения полифункционального сорбента, обладающего высокой сорбционной емкостью и специфичностью, который удовлетворял бы всем вышеперечисленным требованиям, предъявляемым к сорбционным материалам.
Поставленная задача решается способом, включающим гетерогенизацию поверхности пирогенной двуокиси кремния аэросила с удельной поверхно-стью 175-380 м /г и микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) природным высокомолекулярным соединением казеином.
